微RNA循环使用定量DNA结合染料化学和液滴的数字PCR

摘要

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

摘要

循环微RNA（miRNA）（无细胞的），从细胞释放到血流中。在循环的特定微小RNA的量已与一种疾病状态，并具有被用作疾病的生物标志物的潜力。用于使用基于染料的化学和液滴数字PCR技术循环微RNA定量的灵敏和准确的方法最近已开发。具体而言，使用锁核酸（LNA）为基础的miRNA特异性引物用绿色荧光DNA结合染料在相容的液滴数字PCR系统能够获得特定miRNA的绝对定量。在这里，我们描述了如何执行此技术，以评估在生物流体，例如血浆和血清的miRNA量，是可行和有效的。

引言

MicroRNAs (miRNAs) are released into blood circulation by potentially all the cells of the organism, as a consequence of active release or necrotic and apoptotic processes. Cell-free miRNAs have been detected in the bloodstream either as free stable molecules or linked to lipoproteins or enveloped inside exosomes and microvesicles ^1-3. They are believed to function as cell-to-cell communicators ⁴, and their amount changes in the presence of cancer, cardiac disorders or autoimmune diseases ^5-7. Their accurate and reproducible quantification is the basis for their evaluation as disease biomarkers. However, for several reasons already described elsewhere ^8,9, miRNA quantification in serum or plasma, as well as other body fluids, could be very challenging ^10,11. We recently developed a method for the absolute quantification of circulating miRNAs, based on miRNA-specific LNA primers and DNA-binding dye droplet digital PCR (ddPCR) technology ¹². This methodology has been applied to the validation of miRNA breast cancer biomarkers ^13,14.

After the partitioning of each reverse-transcribed miRNA molecule inside a nanoliter-sized droplet, it is possible to count the copy number of each miRNA in each sample, basically counting the number of green, and therefore positive, fluorescent droplets. As soon as a PCR reaction occurs, a positive count is achieved, without the need to establish a standard curve or taking PCR efficiency into account in target amount calculation, as it happens with quantitative RT-PCR (RT-qPCR). In addition, ddPCR proved to be more sensitive and accurate than RT-qPCR in circulating miRNA quantification ¹⁵. In this article we present the detailed protocol of this methodology, discussing the most relevant steps andspecifically considering serum and plasma clinical samples.

研究方案

从血浆或血清中分离的microRNA

注意:血浆和血清制剂是循环的miRNA定量的相关步骤。存在用于血浆和血清制备没有优选的程序。唯一要考虑的重要的事情是，所有来自同一实验的样品必须使用完全相同的工作流程进行处理。从200μl的血清或血浆开始。总RNA可以从血清或血浆用市售试剂盒进行分离。

1，协议总RNA（miRNA的包括）隔离

1. 在冰上解冻血清/血浆样本。
2. 1毫升裂解试剂（ 如 ，Qiazol加）添加到200微升血清/血浆。
3. 涡旋混匀，含在板凳上的匀浆在室温5分钟管。
4. 从添加C的合成的miRNA CEL-MIR-39-3p的4.16纳米的解决方案的3微升线虫 。
5. 加入200μl氯仿。摇动该管剧烈持续15秒。第广场在室温替补2分钟就电子管。
6. 离心机以12,000 xg离心15分钟，在4℃，以获得相分离:上层水相含有的RNA。
7. 水相转移到一个新的管，约700微升，避免任何白色相间的材料转移。
8. 加入1ml的100％乙醇并通过倒置混合。
9. 吸管向上700微升样品放入一个微型旋转柱置于2ml的收集管。盖上盖子，离心机在12000 XG为15秒。丢弃的流量通过。
10. 重复使用剩余的样本这一步骤。
11. 加入700μlBuffer RWT到微型离心柱，盖上盖子，离心15秒12,000 XG洗列。丢弃的流量通过。
12. 吸取500微升缓冲液RPE到微型离心柱。盖上盖子，离心15秒12,000 RPM。丢弃的流量通过。再次重复此步骤。
13. 离心全速微型旋转柱2分钟以干燥离心柱从膜残留的乙醇。
14. 微型旋转柱转移至新的1.5 ml收集管和移液管35微升不含RNA酶的水在列的膜。
15. 离心1分钟以12,000 xg离心以洗脱RNA。
16. 储存在-80℃的RNA。
    注意:由于RNA浓度不能精确确定的，使用固定的卷作为输入量的量度。

2.微小RNA反转录

1. 解冻的逆转录（RT）试剂混合物成分:5×反应缓冲液，不含核酸酶的水。混合轻轻翻转冰上管和地点。在使用前，立即删除从冰箱中的酶混合物置于冰上。降速所有试剂。
2. 如表1中所述制备在冰上对RT试剂混合物。制备至少10％的超过组合。
3. 混合吹打反应，然后降速。
4. 在42℃孵育60分钟。
5. 热灭活的逆向工程＆本身酶为在95℃5分钟。
6. 立即冷却至4℃。
7. 存放在-20°C的基因。

3.稀释的cDNA

1. 稀需要在无核酸酶的水计划ddPCR反应cDNA模板的量。稀释1:50和1之间的基因反应:500水，取决于目标miRNA的丰度。储存在-20℃下的稀释的cDNA。所述稀释的cDNA被证明为在-20℃至少3个月是稳定的。

4.产生液滴和PCR

注意:液滴生成应该在8个样品在同一时间内进行。技术重复不是必需的，因为这种技术^12,15 .A无模板对照（NTC）的样品应当在每一个板中运行的高再现性，并为每个不同ddPCR条件。

1. 解冻并平衡了主结构（ 例如 ，EvaGreen预混），微小RNA引物和cDNA在室温。
2. 混合母液日oroughly通过倒转试管几次。降速所有试剂。
3. 如表2中所述制备ddPCR组合。当执行多个ddPCR反应，制备ddPCR混合工作溶液。至少准备10％的超额组合。
4. 一旦组装，调匀和降速ddPCR组合。
5. 分配12微升ddPCR的混合到96孔PCR板或PCR管。
6. 添加8微升稀释的cDNA模板的每个管/孔。
7. 将液滴生成墨盒插入支架。
8. 转移20微升每种制备的样品，以微滴发生器盒小心，同时避免空气在井的底部的气泡的样品孔（中间行）。
9. 用70微升液滴生成油填充每个油井（下排）。
10. 钩在盒保持器的垫片和插入液滴发生器。
11. 盖上盖子，开始根据液滴代制造商的公关otocol。当液滴的一代已经完成，打开盖子，取出一次性垫圈。盒的顶部孔包含液滴。
12. 吸管慢慢，平稳40微升的八个顶部孔（液滴）的内容到一个96孔PCR板中的一列。
13. 转移液滴蒸发避免后立即密封带箔的PCR板。使用可刺穿箔片密封件是与液滴读者针相容。
14. 密封板30分钟内开始热循环（PCR）。
15. 根据表3进行循环协议。

5.阅读液滴

1. 上电液滴读者。
2. 从热循环仪，以液滴读者移动板。
3. 放置含有PCR后液滴入盘保持器的底部的96孔PCR板。
4. 放置在PCR板的板保持器的顶部。用力按下两个释放卡舌到固定支架中的PCR板。
5. 开始从系统计算机软件。
   1. 单击设置来定义试​​验（绝对定量），然后单击Run启动液滴读数。
   2. 当液滴阅读完毕后，单击"分析"按钮，打开和分析数据。
   3. 使用2D振幅积在分析软件来选择阳性微滴（套索工具）（ 图1B）。
   4. 使用事件选项卡，检查阳性，总滴数。为18,000的总人数 - 21000飞沫通常与probeless ddPCR实现。
   5. 一旦正液滴被选择，导出使用来自浓度标签导出的.csv选项所述miRNA浓度值。

结果

可使用绿色荧光DNA结合染料和液滴数字PCR技术来确定每毫升的血浆或血清的特定miRNA的绝对量。 图1表示正极的液滴选择的过程中，它决定了最终的miRNA浓度（拷贝/微升）在由分析软件计算的扩增反应。血液中的每个miRNA的量是非常不同的，是一些miRNA族比其他人更丰富。使用在ddPCR反应1:50稀释的cDNA，可以得到正和负的液滴的足够数量。在正液滴饱和（ 例如...

讨论

循环miRNA是存在于血液中的浓度极低，而且可以从血浆和血清样品中提取的RNA的量是低的。因为这个原因，它们难以与其它技术，如微阵列和RNA测序量化。此外，还有在数据归一化的一般化缺乏协议和内源性"参考"微RNA在血液中的存在。在这种情况下，一个灵敏的技术，如微滴数字PCR，能够每毫升血清或血浆，即使非常低的计数的miRNA拷贝数的，是非常有吸引力的。我们配对该技术具有普遍性的cDNA...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	Columns for total RNA, including miRNA, extraction from serum/plasma
100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p	Integrated DNA Technologies	Custom	Sequence: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
Universal cDNA synthesis kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301	Kit for microRNA reverse transcription
MicroRNA LNA PCR primer set	Exiqon	204000-206xxx and 2100000-21xxxxx	Primers for miRNA amplification inside droplets
QX200 droplet generator	BioRad	186-4002	Instrument used for droplet reading
QX200 droplet reader	BioRad	186-4003	Instrument used for droplet generation
QuantaSoft software	BioRad	186-3007	Software for data collection and analysis
PX1 PCR plate sealer	BioRad	181-4000	Plate sealer
DG8 droplet generator cartridges and gaskets	BioRad	186-4008	Cartridges used to mix sample and oil to generate droplets
QX200 ddPCR EvaGreen supermix	BioRad	186-4033/36	PCR supermix
QX200 droplet generator oil for EvaGreen dye	BioRad	186-4005	Oil for droplet generation