إنشاء إعداد إنتاجية عالية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعدل ج-دي-GMP في اشارة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em

Summary

توضح هذه المقالة مقايسة الإنتاجية العالية التي أنشئت بنجاح لفحص مكتبات كبيرة من الجزيئات الصغيرة لقدرتها المحتملة على التعامل مع مستويات الخلايا من دوري دى GMP في الزائفة الزنجارية، وتوفير أداة قوية جديدة لاكتشاف الأدوية المضادة للبكتيريا والاختبار المجمع.

Abstract

وأدت مقاومة البكتيريا للمضادات الحيوية التقليدية محاولات الأبحاث لتحديد الأهداف المخدرات الجديدة في مسارات التنظيمية التي اكتشفت مؤخرا. النظم التنظيمية التي تستخدم الخلايا دوري دى GMP (ج-دي-GMP) كرسول الثاني هي واحدة من الدرجة مثل هذه الهدف. ج-دي-GMP هو جزيء إشارة وجدت في كل البكتيريا تقريبا التي تعمل على تنظيم مجموعة واسعة من العمليات بما في ذلك المقاومة للمضادات الحيوية، وتشكيل بيوفيلم والفوعة. وقد اقترح فهم كيفية ج-دي-GMP يشير الضوابط جوانب التنمية بيوفيلم مقاومة للمضادات الحيوية، نهج يمكن تغيير تركيزات الخلوية من النوكليوتيدات أو تعطيل هذه مسارات إشارات قد يؤدي إلى انخفاض تشكيل بيوفيلم أو زيادة حساسية الأغشية الحيوية للمضادات الحيوية. وصفنا بسيط بروتوكول الإنتاجية العالية bioreporter، بناء على البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، والذي يظهر تحت سيطرة ج-دي-GMP المروج استجابة CDRA، للكشف بسرعة عن جزيئات صغيرة مع إمكانية لتعديل مستويات الخلايا ج-دي-GMP في الزائفة الزنجارية (الزائفة الزنجارية). هذا البروتوكول بسيطة يمكن أن يحجب ما يزيد عن 3500 مركبات غضون 48 ساعة، ولديه القدرة على أن تتكيف الكائنات الحية الدقيقة متعددة.

Introduction

التطور السريع للمقاومة البكتيريا ضد المضادات الحيوية الهامة سريريا هي واحدة من الاهتمامات الرئيسية التي تواجه العاملين في مجال الصحة في جميع أنحاء العالم. وقد أدى هذا الفشل من المضادات الحيوية التقليدية تفتيش جديدة لمسألة الكيميائية التي يمكن أن تتداخل مع عمليات بكتيرية تشارك في الفوعة وتقدم المرض ^1. واحد مثل هذا النظام التنظيمي الذي يستخدم داخل الخلايا رسول الثاني دوري دى GMP (ج-دي-GMP) في الآونة الأخيرة أصبحت هدفا مع صحة واعدة ^2-4. وقد ثبت أن هذا الجزيء الثاني رسول إشارة العالمي ينظم العديد من المهام بما في ذلك المقاومة للمضادات الحيوية، التصاق، تشكيل بيوفيلم والمرض ^2-4.

ومن المفهوم الآن أن يتم التحكم في مستوى الخلية من ج-دي-GMP في الخلية البكتيرية عن طريق التخليق والتدهور التي تستخدم فيها اثنين من جزيئات GTP لتجميع ج-دي-GMP من قبل GGDEF التي تحتوي على نطاق cyclases diguanylate (DGCs) WHيتم تحفيز ereas ج-دي-GMP التحلل بواسطة phosphodiesterases (المعادلات التفاضلية الجزئية) التي لديها إما EAL أو مجال HD-GYP (إعادة النظر في (3، 5)). البروتينات التي تحتوي على هذه المجالات غالبا ما تحتوي على المجالات مما يشير إلى أخرى، مما يشير إلى أن نشاطهم في دوران ج-دي-GMP ينظم إما بشكل مباشر أو غير مباشر عن طريق الاشارات البيئية أو الخلوية ^3،5. ونتيجة لذلك، ج-دي-GMP يشير ظائف لربط الاستشعار من الاشارات البيئية المتنوعة إلى تعديلات في النمط الظاهري البكتيرية. ج-دي-GMP يمارس تأثيره التنظيمي في البكتيريا على مستوى النسخ، بعد النسخ وبعد الترجمة من قبل مختلف الآليات ^4.

وهناك تأثير كبير للج-دي-GMP في العديد من الخلايا البكتيرية في تحديد "نمط الحياة" البكتيرية، وعلى وجه الخصوص، في السيطرة على الانتقال بين الخلايا العوالق متحركة وخلايا اطئة تعلق على الأسطح أو تنظيمها في هياكل متعددة الخلايا من الأغشية الحيوية ^3،5. بشكل عام، وارتفاع الخلويةوترتبط مستويات ج-دي-GMP مع تشكيل بيوفيلم وsessility، في حين تشجع مستويات الخلايا انخفاض القدرة على الحركة وتكوين عوامل الفوعة في العديد من مسببات الأمراض البكتيرية ^3،5. وهكذا، يمكن معرفة أكثر تفصيلا للعمل من ج-دي-GMP إشارات تحمل استراتيجيات لتثبيط تشكيل بيوفيلم والفوعة في مسببات الأمراض البكتيرية. وهذه مهمة شاقة بالنظر إلى أن معظم العوامل الوراثية البكتيرية ترميز العديد من البروتينات مع GGDEF، الخطوط الجوية الاثيوبية و / أو المجالات HD-GYP (على سبيل المثال الزائفة الزنجارية لديها أكثر من 40 البروتينات) ومؤثرات متعددة ^6،7.

ولكن، حتى مع هذا التعقيد، وتشير أدلة حديثة إلى أن استراتيجيات التلاعب ج-دي-GMP إشارات قد تكون وضعت إما منع العدوى المقاومة للمضادات الحيوية النامية أو جعلها عرضة لجهاز المناعة أو علاج فعال عن طريق المشاركة في إدارة المضادات الحيوية الكلاسيكية ^2. وتماشيا مع هذا، فقد ثبت بالتجربة أن انخفاض الاصطناعيمن الخلايا ج-دي-جي إم بي في في المختبر -grown P. الزنجارية يؤدي إلى انخفاض تشكيل بيوفيلم وزيادة التعرض للمضادات الحيوية، في حين P. الزنجارية -developed الأغشية الحيوية على زرع السيليكون، وتقع في التجويف البريتوني من الفئران، ويمكن أن تكون مشتتة بطريقة مماثلة ^8-11.

هنا، نحن تصف الإنتاجية العالية، القائم على مضان مراسل فحص لفحص الجزيئات الصغيرة التي يمكن ان تعدل مستويات ج-دي-GMP الخلوية في P. الزنجارية (الشكل 1). ويستند هذا الفحص على قياس ج-دي-GMP مستويات الخلايا باستخدام وضعت سابقا مراسل GFP التي يرتبط transcriptionally إلى CDRA المروج ج-دي-GMP المراعية ¹² التعبير. يصف هذا البروتوكول منهجية للتعبير عن التركيبة مراسل في P. الزنجارية سلالة من الفائدة، وإعداد لوحة مركب، التلقيح الثقافة في لوحات 384 جيدا، وظروف النمو، ونحنليرة لبنانية عن تفاصيل بشأن جمع البيانات وإدارتها وتحليلها (الشكل 1). وعموما، فإن هذا البروتوكول تساعد الباحثين على تحديد يحتمل أن تكون المركبات رواية تستهدف ج-دي-GMP يشير في البكتيريا، ولاستخدامها في الأبحاث تهدف إلى فهم بيولوجيا P. الزنجارية.

Protocol

ملاحظة: تتم مناقشة إجراءات الاستنساخ وتحويل النقي ج-دي-GMP مراسل البلازميد في أماكن أخرى ^12.

1. جيل من GFP ذات الكلمات الدلالية ج-دي-GMP مراسل P. الزنجارية الانفعال

1. تطعيم 5 مل من مرق استذابة (LB) المتوسطة مع مستعمرة واحدة من P. الزنجارية واحتضان ليلا 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
2. نقل 2 مل من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 200 مل من المتوسط ​​LB جديدة في قارورة 1 لتر واحتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
3. مراقبة الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD ₆₀₀₎ كل 30 دقيقة عن طريق أخذ عينة 1 مل من القارورة ودراسة باستخدام مقياس الطيف الضوئي (كما هو موضح سابقا ^12).
4. عندما يصل OD ₆₀₀ بين 0،3-0،5، ضع 40 مل من ثقافة إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي مخروطي.
5. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 8000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف وصه-تعليق الخلايا في 40 مل من حل المثلج، معقم 300 ملي السكروز.
6. بيليه الخلايا مرة ثانية بواسطة الطرد المركزي كما هو موضح في الخطوة 1.5 وإعادة تعليق في 20 مل من حل المثلج، معقم 300 ملي السكروز.
7. بيليه الخلايا مرة أخيرة قبل الطرد المركزي كما هو موضح في الخطوة 1.5 وإعادة تعليق في 400 ميكرولتر من حل المثلج، معقم 300 ملي السكروز.
   ملاحظة: كثافة الخلايا في هذه المرحلة ينبغي أن يكون حوالي 1 × 10 ¹¹ مستعمرة وحدات تشكيل في الملليمتر الواحد (كفو / مل).
8. هدئ الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة، وبعد ذلك انهم على استعداد ل electroporation.
9. إضافة 1 ميكرولتر من 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر pCdrA :: GFP ^C البلازميد ¹² حلا ل40 ميكرولتر من P. الزنجارية الخلايا الكهربائية المختصة أعدت أعلاه في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل الذي كان قبل المبردة على الجليد. مزيج تعليق ونقل إلى ما قبل المبردة، 2 مم فجوة القطب، كفيت Electroporation لل.
   ملاحظة: pCdrA :: GFP ^C: pUCP22Not ف _CDRA -RBSII- GFP (MUT3) -T ₀ -T _1، ^ص الأمبير جم ^ص، الذي يعطي قراءات الفلورسنت من مستوى داخل الخلايا ج-دي-جي إم بي في بي سلالات الزنجارية، وقد وضعت والتصديق عليها من قبل Rybtke وآخرون. ^12.
10. إزالة الرطوبة على السطح الخارجي للكفيت مع المناديل الورقية ووضع كفيت في غرفة عينة من electroporator. نبض مع الجهد من 2.5 كيلو فولت، والسعة من 25 μF ومقاومة من 200 Ω.
11. إزالة كفيت وإضافة 1 مل من LB المتوسطة. ثم، ونقل الخلايا إلى العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
12. نشر 10 ميكرولتر، 50 ميكرولتر و 100 مكل من الثقافة على العقيمة لوحات LB-أجار تستكمل مع الأمبيسلين (بتركيز 100 ميكروغرام / مل)، واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
13. تأكيد التعبير GFP (excitatiعلى في 485 نانومتر، والانبعاثات في 520 نانومتر) عن طريق فحص لوحة تحت المجهر مضان مع قناة GFP القياسية واختيار مستعمرة واحدة لتطعيم 5 مل LB. احتضان بين عشية وضحاها كما هو موضح في الخطوة 1.1. خلط 0.5 مل من الثقافة بين عشية وضحاها مع 0.5 مل 50٪ الجلسرين في 2 مل رأس المسمار أنبوب ومخزن في -80 درجة مئوية.

2. إعداد ثقافة كاتب للتلقيح

1. قبل يومين من الشاشة، لوحة للP. الزنجارية سلالة (التي تحتوي على pCdrA :: GFP ^C البلازميد) من -80 ° C الأسهم على لوحة LB-أجار (تستكمل مع الأمبيسلين بتركيز 100 ميكروغرام / مل) من خلال نشر بلطف البكتيريا على لوحة باستخدام التلقيح المعقمة حلقة غيرمنتهية. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
2. في المساء قبل عرض الفيلم، تطعيم مستعمرة واحدة من P. الزنجارية من لوحة إلى 10 مل من LB المتوسطة (تستكمل مع الأمبيسلين بتركيز 100 ميكروغرام / مل) في توأن تكون واحتضان بين عشية وضحاها قبل الثقافة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
3. في يوم من الشاشة، وإعداد ثقافة فرعية من ليلة أمس قبل الثقافة عن طريق تمييع لأول مرة مع متوسط ​​LB الطازجة إلى OD ₆₀₀ من 1.0 ومن ثم يزيد من إضعاف مع 5٪ LB إلى OD ₆₀₀ 0.04 (1:25 نسبة) .
   ملاحظة: الحجم الكلي للمتوسط ​​تلقيح يعتمد على عدد من لوحات لفحصها. يرصد 5٪ LB عن طريق تمييع 100٪ LB مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى التركيز المطلوب. الأهم من ذلك أن وسائل الإعلام (5٪ LB) يسمح تفعيل التأسيسي pCdrA :: GFP ^C في P. الزنجارية.
4. إضافة شريط مغناطيسي العقيمة في وعاء ويحرك الثقافة في الحد الأدنى للسرعة على محرك مغناطيسي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مما يسمح للبكتيريا لتأقلم على وسائل الإعلام قبل أن يتم الاستغناء أنهم في لوحات 384 جيدا.

3. التلقيح والحضانة من لوحات 384 جيد يحتوي علىالجزيئات الصغيرة

ملاحظة: العقم وتقنيات العقيم جيدة لها أهمية قصوى للخطوات التالية.

1. لإعداد مراقبة إيجابية (100٪ تثبيط)، إضافة 20 ميكرولتر التوبراميسين كبريتات (25 ملغ / مل) إلى 10 مل (كافية لمدة تصل إلى 12 لوحات) من ثقافة فرعية أعدت في الخطوة 2.3 وتخلط بلطف. ماصة 40 ميكرولتر من ثقافة مراقبة إيجابية في الآبار A23 - P23 (الشكل 2).
2. لإعداد السيطرة السلبية (0٪ تثبيط)، إضافة 30 ميكرولتر ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى 10 مل (كافية لمدة تصل إلى 12 لوحات) من ثقافة فرعية أعدت في الخطوة 2.3 وتخلط بلطف. ماصة 40 ميكرولتر من ثقافة السيطرة السلبية في الآبار A24 - P24 (الشكل 2).
3. لكل من لوحات ختمها مع جزيئات صغيرة، تطعيم وبلغ حجم التداول 40 ميكرولتر من الثقافات بين عشية وضحاها المخفف (موضح في الخطوة 2.3) في الآبار A1 - P22 (الشكل 2).
   ملاحظة: يمكن تحقيق ذلك باستخدام معالج السائل سرقةبعد التمديد. ويرجع ذلك إلى خصائص غير متجانسة من الثقافات البكتيرية، فمن المهم للحفاظ على التحريض المستمر ومعتدلة للحفاظ على البكتيريا وزعت باستمرار في وسائل الإعلام في حين الاستغناء. للقيام بذلك، والحفاظ على اثارة ثقافة متأقلمة من الخطوة 2.4 مغناطيسيا خلال الاستغناء.
4. ختم لوحات مع غطاء ختم نفاذية الهواء واحتضان لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: ختم نفاذية الهواء أمر بالغ الأهمية للحفاظ على ظروف متغيرة في جميع الآبار 384 والالتفاف على إمكانات تطوير التدرجات الأوكسجين عبر لوحة.

4. قياس النمو (OD ₆₀₀₎ وبين الخلايا ج-دي-GMP مستوى (GFP)

1. قبل ما يقرب من 30 دقيقة القياس الطيفي، قبل تدفئة قارئ لوحة إلى 37 درجة مئوية لتجنب التكثيف.
2. إزالة بلطف غطاء ختم نفاذية الهواء قبل القراءة. قياس الكثافة البصرية في طول موجي 600 نانومتر مع إعداد 10 ومضات لكل بئر وفترة تسوية من 0.2 ثانية.
3. قبل قياس مضان، وجعل الربح التلقائي وتعديل البؤري على أساس جيد A24 (المراقبة السلبية) وتعيين القيمة المستهدفة تحقيق مكاسب في 75٪ (الشكل 2).
   1. من لوحة تحكم البرنامج القارئ، انقر على قياس بداية وانقر على '' التركيز وكسب تعديل / لوحة معرفات "علامة التبويب".
   2. اختر '' تركز تعديل '' و '' قناة A '' على الحق في النافذة.
   3. اختر '' كسب تعديل 'و' 'المحددة جيدا' '، واكتب في' '75' 'باسم' 'قيمة الهدف' '. وأخيرا، واختيار جيد A24 في تخطيط لوحة قبل النقر على '' ابدأ تعديل '. مرة واحدة يتم تنفيذ تسوية للخروج، انقر على '' بدء قياس ''.
   4. قياس مضان من مراسل GFP في لماكسيما الإثارة / انبعاث 485/520 نانومتر مع إعداد 10 ومضات لكل بئر وsettliالوقت نانوغرام من 0.2 ثانية.
4. جمع البيانات من جميع لوحات فحص. ملاحظة: يتم حفظ قراءات البيانات تلقائيا الافتراضي من قبل البرنامج لوحة تحكم القارئ.
   1. عرض قراءات عن طريق النقر على أيقونة "المريخ" ضمن برنامج حاسوبي لمراقبة لفتح الحزمة التحليل الإحصائي.
   2. استرداد البيانات عن طريق "النقر المزدوج" على رقم لوحة من الاهتمام للوصول إلى البيانات لتحليلها.

تحليل 5. البيانات

1. تقييم التوحيد واستنساخ للفحص باستخدام التحليل ض قوي "، وهو مقاييس الجودة الأكثر شيوعا ذكرت لشاشات عالية الإنتاجية. حساب ض قوية "باستخدام المعادلة التالية:
   
   حيث MAD (الوسيط المطلق الانحراف) هو تقدير الانحراف المعياري، ص هو السيطرة الايجابية (100٪ تثبيط) وn هو السيطرة السلبية (0٪ تثبيط) لكل ₆₀₀ OD وGFP الخامسalues. ملاحظة: ويعتبر الفحص مع قيمة قوية ض '(محسوبة لكل ₆₀₀ OD وGFP البيانات الخام) أكبر من أو يساوي 0.5 كما مقايسة ممتازة.
2. احسب٪ تثبيط نمو باستخدام المعادلة التالية:
   
   حيث شي _OD600 هو التكرارية قيمة OD ₆₀₀ من كل عينة جيدا. ٪ تثبيط _OD600> 0، مثبط النمو. ٪ تثبيط _OD600 <0، المروج النمو.
3. تقييم تثبيط٪ من مستوى داخل الخلايا ج-دي-جي إم بي باستخدام الصيغة (يتم تصحيح والتغيير في وحدات كثافة مضان التعسفي للتغيير في كثافة الخلية):
   
   حيث شي _GFP هو القيمة GFP التكرارية من كل عينة جيدا. ٪ تثبيط _GFP> 0، ج-دي-GMP المانع. ٪ &# 160؛ تثبيط _GFP <0، ج-دي-GMP المروج.
4. تحديد عتبة للكشف عن ضرب في 3 درهم من المتوسط ​​(متوسط ​​± 3 درهم)، وتحسب من العينة جيدا للقراءة عموميات من كل لوحة، على افتراض التوزيع الطبيعي من نقاط البيانات. ملاحظة: ومع ذلك، ± 50٪ تثبيط قطع يمكن اختيار لفحوصات الاستجابة للجرعة أكثر استنساخه ودقيقة إذا لزم الأمر.

النتائج

النهج وصفها هنا يسمح للباحث واحد لبكفاءة ونجاح فحص ما معدله 3500 مركبات خلال فترة 48 ساعة. ويتضح لمحة عامة عن بروتوكول فحص عالية الإنتاجية كما مخطط في الشكل 1. وبالنسبة للمادة الحالية، ونحن فحص مكتبة مجمع متوافقة مع سيادة الخمسة المحتملة المركبات تحوير ج-دي-GMP في تركيز النهائي من 600 ميكرومتر . ومع ذلك، هناك العديد من المتاحة تجاريا المخدرات مثل وغير دوائية مثل مجموعات المركب الذي يمكن استخدامه في فحص. ويمكن لهذه المجموعات أن تكون المركبات التي تركز البكتيريا أو المركبات المجمعة عشوائية ولكن كل مكتبة وينبني الخصائص والصفات الفيزيائية والكيميائية المعينة مثل مجموعة فحص هنا، والتي كان لمجموعات وظيفية القطبية ومراكز stereogenic متعددة. في هذا البروتوكول، وتلقيح البكتيريا في لوحة جنبا إلى جنب مع المركبات، ومراقبة إيجابية للمضادات الحيوية وسيارة DMSOالسيطرة، وفقا للتخطيط هو مبين في الشكل 2 الشكل 3 يصور نتائج الفرز الأولية التي تجسدت لوحة مكتبة واحدة. يتم عرض تمثيلي OD ₆₀₀ والبيانات الخام GFP في الشكل 3A و 3B، على التوالي. خريطة الحرارة التدرج اللوني، مع حار (أحمر) لتبريد (الأخضر) الألوان تشير الأقل إلى الأعلى OD ₆₀₀ القيم / GFP تم تطبيق، إلى القيم أيضا. تم إنشاء خرائط الحرارة في برنامج جداول البيانات عن طريق تطبيق 3-لون نطاق التنسيق الشرطي الذي يمتد من أدنى OD ₆₀₀ / GFP قراءة ما يصل إلى أعلى OD ₆₀₀ / GFP قراءة المغادرة. انخفاض OD ₆₀₀ و GFP القيم النسبية للسيطرة سلبية DMSO تتوافق مع تثبيط النمو ومستويات ج-دي-GMP على التوالي، في حين أن القيم العالية نسبيا للسيطرة سلبية DMSO تتوافق إلى تعزيز النمو ومستويات ج-دي-GMP على التوالي . قيم ض القوي "لOD ₆₀₀ وع GFPالبريد تحسب وفقا لصيغة المنصوص عليها في البروتوكول (5.1). كما هي على حد سواء فوق 0.5 (0،694 و0.761 على التوالي)، اعتبرت جودة فحص قوي وحلل المزيد من البيانات. وتحسب تثبيط٪ من النمو (OD ₆₀₀₎ والخلايا مستوى ج-دي-GMP (GFP) من خلال الصيغ المنصوص عليها في البروتوكول (5.2، 5.3). وأظهرت بيانات تمثيلية في الشكل 4A و 4B على التوالي. خريطة الحرارة التدرج اللوني، مع حار (أحمر) لتبريد (الأخضر) الألوان تشير الأقل إلى الأعلى٪ تثبيط تم تطبيق، إلى القيم أيضا. يتم رسم مؤامرة مبعثر من٪ تثبيط _{(OD600 / GFP)} من الآبار الفردية القائمة على الشاشة الرئيسية في الشكل 5A و5B للOD ₆₀₀ والبيانات GFP على التوالي. يتم اختيار ± 50٪ قطع (المشار إليها مع الخطوط المنقطة) للكشف عن الضرب. يشار إلى الزيارات المحتملة بناء على هذا قطع مع النقط الحمراء. نوعين من المركبات من الفائدة يمكن أن دiscerned من الفحص. الفعالية التي تم تحديدها في الشكل 5A هي المركبات التي تمنع نمو البكتيريا، في حين يضرب المحددة في الشكل 5B هي المركبات التي يحتمل أن تمتلك القدرة على تعديل مستويات الخلايا من ج-دي-GMP. وقد تم تحديد اثنين من المركبات كما يضرب تمثيلية لهذا الاختبار. هذه هي مركب A، محتمل المانع النمو ومجمع باء، وهو محتمل المانع ج-دي-GMP. مجمع ليتوافق مع F8 بشكل جيد في أرقام 3 و 4، وكان لها تثبيط 72.5٪ في النمو. كان هناك كبت المقابل من المتوقع في مستويات دى GMP دوري. مجمع B يتوافق مع K3 جيدا في أرقام 3 و 4، وكان لها تثبيط 61٪ في مستويات دى GMP دوري مع أي تغيير في النمو. تم اختبار تحديد المركبات ضرب أبعد من ذلك 10 نقطة فحص الاستجابة للجرعة مع تركيز أكبر من 2 مم وسلسلة التخفيف شقين. تم احتساب IC ₅₀ القيم على الاستجابة للجرعةمنحنيات (الشكل 6A و B).

الشكل 1. نظرة عامة: إعداد إنتاجية عالية لفحص الجزيئات الصغيرة لقدرتها على تعدل مستويات الخلايا من ج-دي-جي إم بي في بي الزنجارية. يبين هذا الاستعراض تمثيل خطوة بخطوة من البروتوكول المستخدم في هذا الاختبار. مستعمرة بكتيرية من P. يزرع الزنجارية بين عشية وضحاها في ثقافة بداية LB. باستخدام موزع الكاشف، وتلقيح الخلايا في لوحات 384 جيدا تحتوي على مركبات المحدد. يتم تحضين لوحات لمدة 6 ساعات، وبعد ذلك يتم قياس القيم OD ₆₀₀ و GFP. باستخدام هذه الرافضة قراءة، والمركبات التي تؤثر على مستويات الخلايا من ج-دي-GMP يمكن تحديدها. الرجاء انقر هنا لعرضنسخة أكبر من هذا الرقم.

وaliquoted الشكل 2. خريطة لوحة 384 جيدا تستخدم لجزيء صغير الفحص الفحص المركبات من المكتبة (الضوء الأزرق) في آبار A1 - P22. "السيطرة الإيجابية" (أحمر)، ويتألف من تركيز النهائي من 50 ميكروغرام يضاف / مل سلفات التوبراميسين إلى الآبار A23 - P23 و "مراقبة سلبية" (الأخضر) التي تحتوي على تركيز النهائي من 1٪ يضاف DMSO إلى الآبار A24 - P24. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. ممثل النتائج لأحد الفحص 384 جيدا لوحة. Rالبيانات الخام epresentative هو OD ₆₀₀ (أ) و GFP (B). والتدرج اللون خريطة الحرارة، مع الساخن (الأحمر: OD ₆₀₀ = 0.65 أو GFP = 250000) لتبريد (الأخضر: OD ₆₀₀ = 0.10 أو GFP = 40000) الألوان تشير الأقل إلى القيم العالية التي تم تطبيقها، إلى القيم أيضا. والآبار التي لديها أقل OD ₆₀₀ / GFP قراءات نسبة إلى السيطرة السلبية DMSO تميل إلى أن تكون باللون الأحمر بينما الآبار التي لديها أعلى OD القراءات ₆₀₀ / GFP النسبية لسيطرة DMSO سوف تميل إلى أن تكون باللون الأخضر. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.

الشكل 4. ممثل النتائج لنسبة تثبيط المحسوبة لوحة 384 جيدا. وتتمثل البيانات٪ تثبيط تحليلها من أجل كل من OD ₆₀0 (A) وGFP (B) للقراءة الرافضة. خريطة التدرج اللوني الحرارة، مع الساخن (الأحمر: OD ₆₀₀ = -150٪ أو GFP = -20٪) لتبريد (الأخضر: OD ₆₀₀ = 100٪ أو GFP = 100٪) الألوان تشير إلى انخفاض في قيم تثبيط عالية، فقد كان تطبق على القيم أيضا. الجزيئات الصغيرة، التي يحتمل أن تعيق النمو وبين الخلايا ج-دي-GMP سوف تميل إلى أن تكون باللون الأخضر بينما الجزيئات الصغيرة التي يحتمل أن تكون تعزيز النمو ومستويات ج-دي-GMP الخلايا سوف تميل إلى أن تكون باللون الأحمر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5. المؤامرات مبعثر التمثيلية لل٪ تثبيط _{(OD600 / GFP)} التي يتم الحصول عليها من كل جزيء صغير. كل جزيء صغير اختبار يمثله نقطة وتوزيع٪ تثبيطلكل من OD ₆₀₀ (أ) و GFP (ب) الرافضة للقراءة هو مبين. يتم اختيار ± 50٪ قطع لتحديد ضرب. ويسلط الضوء على الزيارات المحتملة باللون الأحمر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وكذلك اختبار الاستجابة الفحص اثنين من المركبات (مثبطات النمو المحتمل ألف والمحتملين ج-دي-GMP المانع B) التي تم تحديدها من الشاشات السابقة في 10 نقطة بين الجرعة والاستجابة فحص مع تركيز أكبر من 2 - الشكل 6. ممثل النتائج من جرعة. ملي وذات شقين سلسلة التخفيف. تركيب وظيفة اللوجستية أربعة معلمة للبيانات أسفرت IC ₅₀ القيم من 158 ميكرومتر و 193 ميكرومتر على التوالي. التنوير القائلبورصة عمان انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

من أجل تحسين علاج الالتهابات البكتيرية، فمن الواضح أن فهم أفضل لسلوك البكتيريا على المستوى التنظيمي الجزيئي هو مطلوب. فإن الإجراء الموضح هنا تكون مفيدة لعلماء الأحياء المجهرية، الكيمياء الحيوية والأطباء الذين يرغبون في الكشف عن الجزيئات الصغيرة التي لديها القدرة على التلاعب أو التدخل مع تركيزات الخلوية ج-دي-جي إم بي في البكتيريا. طريقة يستخدم وضعت مؤخرا bioreporter GFP لمراقبة مستويات الخلايا من ج-دي-جي إم بي في بي الزنجارية ^12. وقد تم التحقق من صحة هذه bioreporter وأظهرت الأهم لا تؤثر على نمو السلالة المستخدمة عند المثقف في 5٪ LB في برنامج تلفزيوني. استخدام شاشة خلية كاملة لتحديد جزيئات صغيرة أن يغير مستويات ج-دي-GMP في الجسم الحي يتغلب على الصعوبات الكبرى من اكتشاف المخدرات القائم على الهدف من حيث اختراق جزيء من خلال الأغشية البكتيرية، لا سيما من خلال تلك البكتيريا سالبة الجرام . الأهم من ذلك، رانه فحص يبدو قويا جدا كقيمة قوية ض 'باستمرار فوق لوحظ 0.5 في جميع الشاشات حتى الآن. فحص باستخدام هذا البروتوكول سوف تكشف عن وجود عدد من الجزيئات الصغيرة التي تمنع و / أو تعزيز مستويات ج-دي-GMP الخلايا في P. الزنجارية. وعلاوة على ذلك، يحتوي هذا الاختبار أيضا القدرة على تحديد جراثيم أو مركبات للجراثيم مما أدى إلى انخفاض في OD ₆₀₀ قراءة المغادرة.

على الرغم من عدم مناقشته في القسم البروتوكول، وهناك عدة اعتبارات هامة لإعداد التجربة. ومن الأهمية بمكان أن نضع في اعتبارنا أن يستند bioreporter GFP على البلازميد. على الرغم من البلازميد مراسل هو معروف أن تكون مستقرة جدا في P. الزنجارية، فإنه يمكن أن تضيع بعد المستمر إعادة الطلاء، وبالتالي الحاجة إلى استخدام سلالات مطلية حديثا من -80 ° C الأسهم الجلسرين، والتحقق من التعبير مضان أمر بالغ الأهمية. بل هو أيضا قيمة للغاية للحفاظ على ظروف النمو موحدة في جميع أنحاء الشاشةلأن أي تقلبات في هذه الظروف يمكن أن يكون لها آثار ضرب على على الشاشة. ويشمل ذلك التأكد من أن وسائل الإعلام والمضادات الحيوية هي ولم يضف دفعة واحدة واستخدمت طوال الشاشة. الثقافات البكتيرية لا ينمو (على أساس OD ₆₀₀ قراءة الرافضة) بطريقة موحدة هي قضية مشتركة لمعظم شاشات عالية الإنتاجية من هذا النوع. وهذا يمكن أن يكون راجعا إلى حافة الآثار أو الاستغناء ثقافة البكتيرية غير متجانسة في لوحات. عن السابق، والتأكد من ختم المنفذة للغازات يستخدم أثناء الحضانة أمر حيوي. في حين لهذا الأخير، فتيلة أنابيب معالج السائل مع حجم ثقافة ما لا يقل عن ثلاث مرات وأوصى حجم القتلى من الأنبوب نفسه. ومن الأهمية بمكان للحفاظ على محرك مغناطيسي بأقل سرعة خلال الاستغناء. في حين رصد وتخزين لوحات 384 جيدا لنمو ثابت على مدار التجارب هو الهدف الأسمى، وهو وضع لتفادي هو التراص لوحات أثناء الحضانة لأنها يمكن أن تسبب الامم المتحدةأراد التدرجات الأكسجين مما يؤدي إلى انحراف في نمط النمو. ومن المهم أيضا لضمان أن السيارة DMSO تستخدم كعنصر تحكم السلبية لا تؤثر سلبا على النمو من سلالة من الفائدة. العديد من هذه القضايا المرتبطة بالنمو يمكن تجنبها عن طريق إجراء الشاشة وهمية مع سلالة بكتيرية من الفائدة قبل الفحص. تفسير البيانات أيضا اقتراح جدير بالنظر بالنظر إلى أن تحسب النتائج تثبيط ج-دي-GMP من التغيير في وحدات كثافة مضان التعسفية التي يجب تصحيحها للتغيير في كثافة الخلية. مع هذا في الاعتبار الصيغ الرياضية المختلفة لتقييم بيانات الناتج من هذه التجارب ينبغي النظر أيضا. على سبيل المثال، قد يظهر مركب كمانع ج-دي-GMP ولكن في الواقع ان يكون المانع النمو أو العكس بالعكس، مما يتطلب تفسير الحكمة من الزيارات التي تم تحديدها.

وهناك العديد من العوائق والقيود التي يجب مراعاتها أثناء وضع وأداء هذهإنتاجية عالية خلية القاعدة الشاشة. على سبيل المثال، وظائف مراسل الحيوي على مقياس غير مباشر من مستويات ج-دي-GMP الخلوية باستخدام مسبار الفلورسنت التي يحتمل أن تتأثر الجزيئات الصغيرة المستخدمة في شاشة خصائص الكشف. وهناك مسألة عرضية هو حقيقة أن فحص خلية القاعدة يعطي أي معلومات بشأن آلية وراء التغيرات في مستويات الخلايا ج-دي-GMP. لذلك، لا بد من تأكيد الملاحظات الهامة من التجارب باستخدام السائل نهج الطيف اللوني الشامل عالية الأداء، والتي تعتبر طريقة "الذهب القياسية" لقياس الخلايا تقلبات ج-دي-جي إم بي في البكتيريا. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء دينا فقط توفير المعلومات بشأن سلوك البكتيريا نما في المختبر، كما نمت الخلايا البكتيرية في سياق المضيف (في الجسم الحي) بسرعة تعديل أنشطتها بسبب هذه البيئة. وعلاوة على ذلك، فإن عملية باستخدام bioreporter GFP تعني الشاشة لا يأخذبعين الاعتبار الحالة الفسيولوجية للخلايا البكتيرية. ومع ذلك، يمكن تكييفها على بروتوكول لمراقبة مجهرية من الآبار الفردية خلال الشاشة.

حتى مع هذه الاعتبارات والقيود، وهذا الاختبار عالية الإنتاجية لا يزال شاشة قوية لجزيئات صغيرة قادرة على التدخل في مستويات ج-دي-جي إم بي داخل الخلايا. منذ العديد من الأنواع الميكروبية بما في ذلك العديد من مسببات الأمراض البكتيرية تم دراستها من أجل تميز تعديل مستويات ج-دي-جي إم بي داخل الخلايا، ويمكن تطبيق بروتوكول لدينا إلى الأنواع البكتيرية المختلفة وتوسيعها لدراسة نماذج البكتيريا المتعددة الأنواع الأكثر تعقيدا. الفحص يمكن أن يكون الأمثل بسهولة الأنواع البكتيرية الأخرى عن طريق تغيير ظروف النمو المستخدمة، أو يمكن تكييفها لقراءة مخرجات أخرى باستخدام bioreporters مختلفة. ويمكن تطبيق حضانة مرات مختلفة تبعا لمرحلة النمو من الفائدة. ومع ذلك، عندما التصعيد أو زيادة خلال-وضعت، فمن الاهميه ر أن نضع في اعتبارنا أن البكتيريا ستظل تنمو خلال الاستعدادات لوحة والقياسات تلا. ولذلك فمن المستحسن أن يحجب بحد أقصى 15 لوحات في وقت واحد باستخدام هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام لوحات مع أكثر من 384 بئرا قد لا تسمح النمو موحد، وتحتاج إلى مزيد من التحسين. عندما تقليص عدد لوحات، وأنه قد يكون من الأنسب لتطعيم يدويا باستخدام ماصة الإلكترونية بدلا من الروبوت معالجة السائل. ومن الواضح أن هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم للتحقيق في جزيئات صغيرة تفريق الأغشية الحيوية، بالنظر إلى أن المركبات المضادة للبيوفيلم تتداخل مع ج-دي-GMP الإشارات. ويمكن أيضا أن يتم إعادة تطوير بروتوكول لفهم الجوانب المختلفة لعلم وظائف الأعضاء البكتيرية. وبالنظر إلى أن الإشارات ج-دي-GMP هي السائدة في معظم البكتيريا، من خلال دراسة physiologies من هذه الكائنات باستخدام هذا البروتوكول يمكننا التعرف على المحفزات الكيميائية المختلفة لتحديد ما إذا كان أو لم يكن آليات عملها تتطلب ج-دي-GMP الإشارات.

_content "> وباختصار، فإن متانة وبراعة النهج الواردة في هذا البروتوكول سوف تساعد في تحديد جهري الكيميائية ج-دي-GMP يشير في كثير من النظم البيولوجية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysogeny Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-1KG
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-1KG
Lysogeny Broth with Agar (Lennox)	Sigma Aldrich	L2897-1KG
Ampicillin sodium	Sigma Aldrich	A0166-25G
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516-1L
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4	Life technologies	10010-056
Tobramycin sulfate	Sigma Aldrich	T1783-100MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	276855-250ML
Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer	Thermoscientific	840-208100
2 mm gap electroporator cuvette	Bio-Rad	1652092
BioRad GenePulser XCell electroporator	Bio-Rad	1652662
Leica Fluorescent Stereomicroscope	Leica Microsystems	MZ16FA
BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilize by autoclaving before use)	Sigma Aldrich	Z328952-10EA
384-well, white-walled, clear-bottom plates	Greiner	781098
Multidrop Combi reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300
Multidrop Combi tubing	Thermo Scientific	24073290
VIAFLO II 16-channel electronic pipette	Integra Biosciences	4642
100 ml sterile disposable reagent reservoirs	Fisher Scientific	12399175
AeraSeal air-permeable membranes	Sigma Aldrich	MKBQ1886
Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13)	BMG Labtech	Pherastar FS