Mise en place d&#39;un programme d&#39;installation à haut débit pour le criblage de petites molécules qui modulent c-di-GMP Signalisation dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Résumé

Cet article décrit le dosage à haut débit qui a été établi avec succès à l' écran de grandes bibliothèques de petites molécules pour leur capacité potentielle à manipuler les niveaux cellulaires de cyclique di-GMP chez Pseudomonas aeruginosa, fournissant un nouvel outil puissant pour la découverte de médicaments antibactériens et les tests de composé.

Résumé

La résistance bactérienne aux antibiotiques traditionnels a conduit les tentatives de recherche pour identifier de nouvelles cibles médicamenteuses dans les voies réglementaires récemment découverts. Les systèmes de régulation qui utilisent cyclique intracellulaire di-GMP (c-di-GMP) comme second messager sont une telle classe de cible. c-di-GMP est une molécule de signalisation trouvé dans presque toutes les bactéries qui agit pour réguler une vaste gamme de processus, y compris la résistance aux antibiotiques, la formation de biofilm et de la virulence. La compréhension de la façon dont c-di-GMP signalisation contrôle aspects du développement antibiotique biofilm résistant a suggéré des approches par lequel la modification des concentrations cellulaires du nucléotide ou la perturbation de ces voies de signalisation peut conduire à la formation de biofilm réduit ou une sensibilité accrue des biofilms aux antibiotiques. Nous décrivons un protocole simple à haut débit biorapporteur, basé sur la protéine fluorescente verte (GFP), dont l' expression est sous le contrôle du promoteur sensible c-di-GMP CDRAPour cribler rapidement pour les petites molécules ayant le potentiel de moduler les niveaux cellulaires c-di-GMP dans Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Ce protocole simple peut cribler plus de 3500 composés dans les 48 heures et a la capacité d'être adapté à de multiples micro-organismes.

Introduction

Le développement rapide de la résistance bactérienne aux antibiotiques cliniquement importants est l'une des préoccupations majeures que connaît actuellement les professionnels de la santé dans le monde entier. Cet échec des antibiotiques traditionnels a entraîné de nouvelles recherches pour la matière chimique qui peut interférer avec les processus bactériens impliqués dans la virulence et la progression de la maladie ^1. Un tel système de régulation qui utilise le second messager intracellulaire cyclique di-GMP (c-di-GMP) est récemment devenu une cible avec une validité prometteuse ^2-4. Il a été établi que cette seconde molécule globale du signal de messager régule de nombreuses fonctions , y compris la résistance aux antibiotiques, l' adhérence, la formation du biofilm et la maladie de ^2-4.

On comprend maintenant que le niveau cellulaire de c-di-GMP dans la cellule bactérienne est contrôlée par la synthèse et à la dégradation par lequel deux molécules de GTP sont utilisées pour synthétiser c-di-GMP par GGDEF cyclases diguanylate contenant le domaine (DGCS) whEREA dégradation c-di-GMP est catalysée par phosphodiestérases (PDE) qui ont soit un EAL ou un domaine HD-GYP (revue en (3, 5)). Les protéines qui contiennent ces domaines contiennent souvent d' autres domaines de signalisation, ce qui suggère que leur activité dans le chiffre d' affaires de c-di-GMP est régulée directement ou indirectement par des signaux environnementaux ou cellulaires ^3,5. Par conséquent, c-di-GMP fonctions de signalisation pour relier la détection de divers signaux environnementaux à des modifications dans le phénotype bactérien. c-di-GMP exerce son effet régulateur dans des bactéries au niveau de la transcription, post-transcription et post-traduction par divers mécanismes ^4.

Une grande influence de c-di-GMP dans de nombreuses cellules bactériennes se trouve dans la détermination de «style de vie» des bactéries et, en particulier, dans le contrôle des transitions entre les cellules planctoniques motiles et les cellules sessiles attachées à des surfaces ou organisées dans les structures multicellulaires biofilms ^3,5. En général, haute cellulaireles niveaux de c-di-GMP sont associés à la formation de biofilm et sessility, tandis que les niveaux cellulaires faibles favorisent la motilité et de la synthèse de facteurs de virulence dans de nombreux pathogènes bactériens ^3,5. Ainsi, une connaissance plus détaillée du fonctionnement de la signalisation c-di-GMP pouvait se permettre des stratégies pour l'inhibition de la formation de biofilm et la virulence des bactéries pathogènes. Ceci est une tâche ardue étant donné que la plupart des génomes bactériens codent de nombreuses protéines avec GGDEF, EAL et / ou domaines HD-GYP (par exemple P. aeruginosa possède plus de 40 protéines) et de multiples effecteurs ^6,7.

Cependant, même avec cette complexité, des données récentes suggèrent que les stratégies de manipulation de signalisation c-di-GMP peuvent être développés soit prévenir les infections résistantes aux antibiotiques en développement ou les rendent sensibles au système immunitaire ou d'un traitement efficace par la co-administration d'antibiotiques classiques ^2. Conformément à cela, il a été démontré expérimentalement que la diminution artificielleintracellulaire c-di-GMP in vitro -grown P. aeruginosa entraîne une diminution de la formation de biofilm et une susceptibilité accrue aux antimicrobiens, tandis que P. Les biofilms aeruginosa sur des implants en silicone, situés dans la cavité péritonéale de souris, peuvent être dispersées d'une manière similaire ^11/08.

Ici, nous décrivons un débit élevé, un essai rapporteur basé sur la fluorescence pour cribler de petites molécules qui peuvent potentiellement moduler les niveaux de c-di-GMP cellulaire chez P. aeruginosa (figure 1). L'essai est basé sur la mesure de c-di-GMP niveaux cellulaires en utilisant un rapporteur GFP précédemment développé dont l' expression est transcriptionnel lié au promoteur de CDRA c-di-GMP sensible ^12. Ce protocole décrit la méthode utilisée pour l' expression de la construction rapporteur dans le P. souche aeruginosa d'intérêt, la préparation des plaques composé, la culture inoculation dans des plaques de 384 puits, les conditions de croissance, que nousll que les détails concernant la collecte de données, la gestion et l' analyse (Figure 1). Dans l' ensemble, ce protocole aidera les chercheurs à potentiellement identifier de nouveaux composés ciblant c-di-GMP de signalisation dans les bactéries, et pour une utilisation dans la recherche visant à comprendre la biologie de P. aeruginosa.

Protocole

Remarque: Les procédures de clonage et de transformation du c-di-GMP reporter plasmide purifié sont discutés ailleurs ^12.

1. Génération de la GFP Tagged c-di-GMP Reporter P. aeruginosa Strain

1. Inoculer 5 ml de bouillon de lysogénie (LB) avec une seule colonie de P. aeruginosa et incuber une nuit à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute.
2. Transfert 2 ml de la culture d'une nuit dans 200 ml de milieu LB frais dans une fiole de 1 L et on incube à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute.
3. Surveiller la densité optique à 600 nm (DO ₆₀₀₎ toutes les 30 minutes en prélevant un échantillon de 1 ml dans le ballon et on examine à l' aide d' un spectrophotomètre (comme décrit précédemment ^12).
4. Lorsque la _DO600 atteigne entre de 0,3 à 0,5, placer 40 ml de la culture dans un tube à centrifuger conique de 50 ml.
5. Sédimenter les cellules par centrifugation à 8000 tpm pendant 10 min à 4 ° C, jeter le surnageant et re les cellules en suspension dans 40 ml d'une solution de saccharose 300 mM refroidi à la glace, stérile.
6. Sédimenter les cellules une deuxième fois par centrifugation comme décrit dans l'étape 1.5 et remettre en suspension dans 20 ml de solution de saccharose 300 mM refroidi à la glace, stérile.
7. Sédimenter les cellules une dernière fois par centrifugation comme décrit dans l'étape 1.5 et remettre en suspension dans 400 ul de solution 300 mM de saccharose glacé, stérile.
   Note: La densité cellulaire à ce point devrait être d' environ 1 x 10 ¹¹ unités formant colonie par millilitre (UFC / ml).
8. Refroidir les cellules sur la glace pendant 30 min, après quoi ils sont prêts pour l'électroporation.
9. Ajouter 1 ul d'un / ul plasmidique ¹² solution à 0,2 pg pCdrA :: gfp ^C à 40 pi de P. des cellules électro-compétentes aeruginosa préparée ci - dessus dans un tube de 1,5 ml qui a été pré-refroidi sur de la glace. Mélanger la suspension et transférer dans un pré-réfrigéré, écartement des électrodes de 2 mm, cuvette d'électroporation.
   Note: pCdrA :: gfp ^C: pUCP22Not-P _CDRA -RBSII- gfp (Mut3) -T ₀ -T _1, ^AmpR Gm ^r, ce qui donne une lecture de fluorescence du taux intracellulaire de c-di-GMP dans P. souches aeruginosa, a été développé et validé par Rybtke et al. ^12.
10. Éliminer l'humidité à l'extérieur de la cuve avec du papier absorbant et placer la cuvette dans la chambre de l'électroporateur de l'échantillon. Impulsions avec une tension de 2,5 kV, 25 uF de capacité et de résistance de 200 Ω.
11. Retirer la cuvette et ajouter 1 ml de milieu LB. Ensuite, transférer les cellules à un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse stérile et incuber pendant 2 heures à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute.
12. Se propager 10 ul, 50 ul et 100 ul de parties aliquotes de la culture sur des plaques d'agar-LB stérile additionné d'ampicilline (à une concentration de 100 pg / ml), et on incube les plaques à 37 ° C pendant une nuit.
13. Confirmer l'expression de la GFP (excitatisur à 485 nm, émission à 520 nm) en examinant la plaque sous un microscope à fluorescence avec un canal de GFP standard et choisir une colonie unique pour inoculer 5 ml LB. Incuber une nuit comme décrit dans l'étape 1.1. Mélanger 0,5 ml de la culture d'une nuit avec 0,5 ml de 50% de glycérol dans un 2 ml vis tube supérieur et conserver à -80 ° C.

2. Préparation de la culture de départ pour inoculer

1. Deux jours avant l'écran, la plaque P. souche aeruginosa (contenant le pCdrA :: gfp ^C plasmidique) à partir de -80 ° C pâte sur une plaque LB-agar (additionné d'ampicilline à une concentration de 100 pg / ml) en écartant doucement les bactéries sur la plaque à l' aide d' une inoculation stérile boucle. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C.
2. Le soir avant la projection, inoculer une seule colonie de P. aeruginosa à partir de la plaque dans 10 ml de milieu LB (supplémenté avec de l' ampicilline à une concentration de 100 pg / ml) dans un tuêtre et incuber la nuit pré-culture à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute.
3. Le jour de l'écran, préparer une sous - culture de la pré-culture d'une nuit en diluant d'abord avec du milieu LB frais à une _DO600 de 1,0, puis en diluant avec en outre 5% LB à une _DO600 de 0,04 (rapport 01:25) .
   Remarque: Le volume total du milieu inoculé est fonction du nombre de plaques à tester. 5% LB est faite en diluant à 100% LB avec du tampon phosphate salin (PBS) à la concentration requise. Fait important, les médias (5% LB) permet une activation constitutive de pCdrA :: gfp ^C dans P. aeruginosa.
4. Ajouter un barreau magnétique stérile dans le récipient et agiter la culture à la vitesse minimale sur un agitateur magnétique pendant 30 min à température ambiante, ce qui permet aux bactéries de s'acclimater aux médias avant qu'ils ne soient distribués dans des plaques à 384 puits.

3. Inoculation et incubation des plaques à 384 puits contenantLes petites molécules

Note: Stérilité et de bonnes techniques d'asepsie sont primordiales pour les étapes suivantes.

1. Pour préparer le contrôle positif (100% d'inhibition), ajouter 20 pl tobramycine sulfate (25 mg / ml) à 10 ml (suffisant pour un maximum de 12 plaques) de la sous-culture préparé à l'étape 2.3 et mélanger doucement. Pipette 40 ul de la culture de contrôle positif dans les puits A23 - P23 (Figure 2).
2. Pour préparer le contrôle négatif (0% d'inhibition), ajouter 30 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 10 ml (suffisant pour un maximum de 12 plaques) de la sous-culture préparé à l'étape 2.3 et mélanger doucement. Pipette 40 ul de la culture de contrôle négatif dans les puits A24 - P24 (Figure 2).
3. Pour chacune des plaques embouties avec les petites molécules, inoculer un volume de 40 pi des cultures d'une nuit dilué (décrites à l' étape 2.3) dans les puits A1 - P22 (Figure 2).
   Note: Ceci peut être réalisé en utilisant un manipulateur de liquide robot. En raison des propriétés hétérogènes de cultures bactériennes, il est important de maintenir une agitation continue et modérée pour empêcher les bactéries systématiquement distribués dans les médias pendant la distribution. Pour ce faire, continuer à remuer la culture acclimatée à l'étape 2.4 magnétiquement pendant la distribution.
4. Sceller les plaques avec un joint de couverture perméable à l'air et incuber pendant 6 heures à 37 ° C.
   Remarque: Le joint perméable à l'air est essentielle pour maintenir des conditions immuables dans tous les 384 puits et de contourner le potentiel de développement de gradients d'oxygène à travers la plaque.

4. Mesure de la croissance (DO ₆₀₀₎ et intracellulaires c-di-GMP Level (GFP)

1. Environ 30 minutes avant la mesure spectrophotométrique, préchauffer le lecteur de plaque à 37 ° C pour éviter la condensation.
2. Retirez délicatement le joint du couvercle perméable à l'air avant de lire. Mesurer la densité optique à une longueur d'onde de 600 nm avec un réglage de 10 flashs par puits etun temps de décantation de 0,2 s.
3. Avant de mesurer la fluorescence, faire un gain automatique et un réglage focal basé sur le bien A24 (contrôle négatif) et définir la valeur cible de gain à 75% (figure 2).
   1. A partir du logiciel de contrôle de lecteur de plaque, cliquez sur la mesure de départ et cliquez sur le '' Focus et Gain de réglage ID / Plate onglet '.
   2. Sélectionnez '' Mise au point '' et '' Canal A '' sur la droite de la fenêtre.
   3. Sélectionnez '' Réglage du gain '' et '' bien sélectionné '', et tapez '' 75 '' comme '' Valeur cible ''. Enfin, choisissez bien A24 dans la disposition de la plaque avant de cliquer sur '' Lancer ajustement ''. Une fois le réglage effectué, cliquez sur '' Lancer la mesure ''.
   4. Mesurer la fluorescence du rapporteur GFP à un maximum d'excitation / émission de 485/520 nm avec un réglage de 10 flashs par puits et un settlitemps ng de 0,2 sec.
4. Recueillir des données de toutes les plaques examinées. Remarque: les lectures de données sont automatiquement enregistrées par défaut par le logiciel plaque de commande de lecteur.
   1. Voir les lectures en cliquant sur l'icône "Mars" dans le logiciel de commande pour ouvrir le logiciel d'analyse statistique.
   2. Récupérer des données par "double clic" sur le numéro de la plaque d'intérêt pour accéder aux données pour l'analyse.

Analyse 5. Données

1. Évaluer l'uniformité et la reproductibilité du test en utilisant z robuste 'analyse, ce qui est des mesures de qualité les plus fréquemment rapportés pour les écrans à haut débit. Calculer z robuste »selon la formule suivante:
   
   Où MAD (Median Absolute Deviation) est une estimation de l' écart type, p est le contrôle positif (100% d'inhibition) et n est le contrôle négatif (0% d' inhibition) pour les ₆₀₀ OD et GFP valeurs. Note: Un essai avec une «valeur de z robuste (calculé pour les ₆₀₀ OD et GFP données brutes) supérieure ou égale à 0,5 est considéré comme un excellent test.
2. Calculer le% d'inhibition de la croissance en utilisant la formule:
   
   Où Xi _DO600 est la itérative DO ₆₀₀ valeur de chaque échantillon. % D' inhibition _DO600> 0, un inhibiteur de la croissance; % Inhibition _DO600 <0, promoteur de croissance.
3. Évaluer l'inhibition% du taux intracellulaire de c-di-GMP en utilisant la formule (le changement dans les unités d'intensité de fluorescence arbitraires sont corrigées pour la variation de la densité cellulaire):
   
   Où Xi _GFP est la valeur de la GFP itérative de chaque puits d' échantillon. % Inhibition _GFP> 0, inhibiteur de c-di-GMP; % &# 160; Inhibition _GFP <0, promoteur c-di-GMP.
4. Définir un seuil de détection de succès à 3 MAD de la médiane (médiane ± 3 MAD), calculée à partir de l'échantillon bien lu-outs de chaque plaque, en supposant une distribution normale des points de données. Note: Cependant, ± 50% d'inhibition de coupure peut être sélectionné pour les essais de réponse à la dose plus reproductibles et précis, si nécessaire.

Résultats

L'approche décrite ici permet à un seul chercheur à l'écran de manière efficace et avec succès une moyenne de 3.500 composés dans un délai de 48 heures. Une vue d' ensemble du protocole de criblage à haut débit est illustré comme un organigramme de la figure 1. Pour l'article actuel, nous avons criblé une banque de composés règle de cinq conformes pour les composés potentiels modulant c-di-GMP à une concentration finale de 600 uM . Cependant, il y a beaucoup de disponibles dans le commerce de drogues similaires et non médicamenteux comme des ensembles composés qui pourraient être utilisés dans l'essai. Ces ensembles peuvent être des bactéries axées sur des composés ou des composés mis en commun au hasard, mais chaque bibliothèque auraient fondé des propriétés physico-chimiques et les caractéristiques assignées telles que l'ensemble projeté ici, qui avait des groupes fonctionnels polaires et de multiples centres stéréogènes. Dans ce protocole, les bactéries sont inoculées dans la plaque ainsi que des composés, un antibiotique témoin positif et un véhicule de DMSOle contrôle, selon le schéma de la figure 2. La figure 3 représente les résultats du criblage primaire illustré par une plaque seule bibliothèque. OD représentant les données brutes ₆₀₀ et GFP sont présentés sur la figure 3A et 3B, respectivement. Une carte thermique de gradient de couleur, avec eau chaude (rouge) pour refroidir (vert) couleurs indiquant croissant DO ₆₀₀ valeurs / GFP, a été appliquée aux valeurs de puits. Les cartes de chaleur ont été générées dans un logiciel de tableur en appliquant un 3-Color échelle mise en forme conditionnelle allant de la DO la plus basse ₆₀₀ / GFP lecture jusqu'à la plus haute OD ₆₀₀ / GFP lecture. Faible OD ₆₀₀ et GFP valeurs relatives au contrôle DMSO négative correspondent à une inhibition des niveaux c-di-GMP croissance et , respectivement, tandis que les valeurs élevées par rapport au témoin DMSO négative correspondent à une promotion dans les niveaux c-di-GMP croissance et respectivement . La z robuste 'valeurs de OD ₆₀₀ et GFP are calculé selon la formule figurant dans le protocole (5.1). Comme ils sont tous deux au-dessus de 0,5 (0,694 et 0,761, respectivement), la qualité de l'essai a été jugée solide et les données ont été analysées plus loin. L'inhibition% de la croissance (DO ₆₀₀₎ et au niveau de c-di-GMP intracellulaire (GFP) sont calculées par les formules figurant dans le protocole (5.2, 5.3). Des données représentatives sont montrées sur la figure 4A et 4B , respectivement. Une carte thermique de gradient de couleur, avec eau chaude (rouge) pour refroidir (vert) couleurs indiquant faible à% d'inhibition élevée, a été appliquée aux valeurs de puits. Un diagramme de dispersion du% d' inhibition _{(DO600 / GFP)} à partir de puits individuels en fonction de l'écran principal est représentée sur la figure 5A et 5B pour OD ₆₀₀ et les données de la GFP , respectivement. Une coupure de ± 50% (indiqué par des lignes en pointillés) est sélectionné pour la détection de succès. résultats potentiels basés sur cette coupure sont indiquées par des points rouges. Deux types de composés d'intérêt peuvent être discerned de l'essai. Résultats présentés à la figure 5A sont des composés qui inhibent la croissance bactérienne, tandis que les résultats présentés à la figure 5B sont des composés qui possèdent potentiellement la capacité de moduler les niveaux intracellulaires de c-di-GMP. Deux composés ont été identifiés comme résultats représentatifs pour ce test. Ce sont des composés A, un potentiel inhibiteur de la croissance et le composé B, un inhibiteur potentiel c-di-GMP. Le composé A correspond à F8 bien sur les figures 3 et 4 et il y avait une inhibition de 72,5% de la croissance. Il y avait une inhibition correspondante prévue dans les niveaux di-GMP cyclique. Le composé B correspond à K3 bien sur les figures 3 et 4 et il y avait une inhibition de 61% des niveaux de di-GMP cyclique sans changement dans la croissance. Sélectionnez composés de succès ont encore été testés par un essai dose-réponse de 10 points avec une concentration supérieure de 2 mM et des séries de dilution double. IC ₅₀ valeurs sont calculées en fonction de la dose-réponsecourbes (figure 6A et B).

Figure 1. Vue d' ensemble: le programme d' installation à haut débit pour le criblage des petites molécules pour leur potentiel à Moduler les niveaux cellulaires de c-di-GMP dans P. aeruginosa. Cette vue d' ensemble montre une représentation étape par étape du protocole utilisé dans cet essai. Une colonie bactérienne de P. aeruginosa est cultivé pendant une nuit dans une culture starter LB. À l'aide d'un distributeur de réactif, les cellules sont ensemencées dans des plaques à 384 puits contenant les composés sélectionnés. Les plaques sont incubées pendant 6 heures, après quoi les valeurs de DO ₆₀₀ et GFP sont mesurés. L' utilisation de ces-outs lire, des composés qui affectent les niveaux cellulaires de c-di-GMP peuvent être identifiés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir uneune plus grande version de ce chiffre.

. Figure 2. Une carte de plaque 384 puits Utilisé pour la petite molécule Test de criblage Les composés de la bibliothèque (bleu clair) sont aliquotes dans les puits A1 - P22. Le «témoin positif» (rouge) se composant d'une concentration finale de 50 pg / sulfate de tobramycine ml, on ajoute aux puits A23 - P23 et le "contrôle négatif" (vert) contenant une concentration finale de DMSO est ajouté aux puits A24 à 1% - P24. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Les résultats représentatifs pour une plaque de 384 puits de dépistage. Rdonnées brutes epresentative est pour OD ₆₀₀ (A) et la GFP (B). Une carte thermique de gradient de couleur, avec eau chaude (rouge: OD ₆₀₀ = 0,65 ou GFP = 250.000) pour refroidir (Vert: OD ₆₀₀ = 0,10 ou GFP = 40,000) couleurs indiquant bas à des valeurs élevées, a été appliquée aux valeurs de puits. Les puits qui ont inférieure OD ₆₀₀ / GFP lectures par rapport au témoin DMSO négative auront tendance à être en rouge tandis que les puits qui ont plus élevés OD lectures ₆₀₀ / GFP par rapport au témoin de DMSO ont tendance à être en vert. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

Figure 4. Les résultats représentatifs pour Pourcentage Inhibition Calculé pour une plaque de 384 puits. Les données% d'inhibition analysé est représenté à la fois de la DO ₆₀0 (A) et la GFP (B) lu-outs. Une carte de dégradé de couleur de la chaleur, avec eau chaude (rouge: OD ₆₀₀ = -150% ou GFP = -20%) pour refroidir (Vert: GFP = 100% OD ₆₀₀ = 100% ou) des couleurs indiquant une faible à des valeurs élevées d'inhibition, a été appliqué aux valeurs de puits. Les petites molécules qui inhibent potentiellement la croissance et intracellulaire c-di-GMP auront tendance à être en vert tandis que les petites molécules qui potentiellement favorisent des niveaux c-di-GMP intracellulaires croissance et auront tendance à être en rouge. S'il vous plaît , cliquez ici pour afficher une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5. Diagrammes de dispersion représentatifs pour% d' inhibition _{(DO600 / GFP)} obtenus de chaque petite molécule. Chaque petite molécule testée est représentée par un point et la distribution% d'inhibitionpour chacun des OD ₆₀₀ (A) et la GFP (B) lecture outs est affiché. Une coupure de ± 50% est sélectionné pour l'identification de succès. Résultats potentiels sont surlignés en rouge. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6. Les résultats représentatifs d'une dose -. Réponse Assay Deux composés (inhibiteur de la croissance potentielle A et le potentiel c-di-GMP inhibiteur B) identifiés à partir des écrans précédents sont ensuite testées dans un essai dose-réponse de 10 points avec une concentration supérieure de 2 mM et deux fois une série de dilutions. Montage d' une fonction logistique à quatre paramètres pour les données a abouti à des valeurs de _CI50 de 158 uM et 193 uM , respectivement. Please cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Afin d'améliorer le traitement des infections bactériennes, il est clair qu'une meilleure compréhension du comportement des bactéries au niveau réglementaire moléculaire est nécessaire. La procédure décrite ici sera bénéfique pour les microbiologistes, biochimistes et cliniciens qui veulent découvrir de petites molécules qui ont le potentiel pour manipuler ou interférer avec les concentrations cellulaires de c-di-GMP dans les bactéries. La méthode utilise un biorapporteur GFP récemment mis au point pour surveiller les niveaux cellulaires de c-di-GMP dans P. aeruginosa ^12. Cette biorapporteur a été validé et montré important de ne pas affecter la croissance de la souche utilisée lorsqu'elle est cultivée dans 5% de LB dans du PBS. L'utilisation d'un écran de cellules entières pour identifier de petites molécules qui modifie les niveaux de c-di-GMP in vivo permet de surmonter les difficultés majeures de découverte de médicaments basée sur la cible en termes de pénétration molécule à travers les membranes bactériennes, en particulier par ceux des bactéries à Gram négatif . Surtout, til analyse apparaît très robuste comme une «valeur de z robuste constamment au-dessus de 0,5 a été observée dans tous les écrans à ce jour. Le dépistage en utilisant ce protocole va révéler un certain nombre de petites molécules qui inhibent et / ou favorisent des niveaux intracellulaires c-di-GMP dans P. aeruginosa. De plus, cet essai a également la possibilité d'identifier des composés bactériostatiques ou bactéricides aboutissant à une diminution du diamètre extérieur ₆₀₀ de lecture.

Bien que non indiqué dans la section de protocole, il existe plusieurs considérations importantes pour la préparation de l'expérience. Il est essentiel de garder à l'esprit que la biorapporteur GFP est basé sur un plasmide. Bien que le plasmide rapporteur est connu pour être très stable dans P. aeruginosa, il peut être perdu après re-placage continu, d' où la nécessité d'utiliser des souches fraîchement plaquées d'un -80 ° C stock de glycérol, et de vérifier l' expression de fluorescence est critique. Il est également très utile pour maintenir des conditions de croissance uniformes à travers l'écranétant donné que les fluctuations de ces conditions pourraient avoir des effets d'entraînement sur l'écran. Cela comprendrait faire certains que les médias et les antibiotiques sont premade en batch et utilisé tout au long de l'écran. Les cultures bactériennes ne se développe pas (basé sur OD _600-outs lire) de manière uniforme est un problème commun à la plupart des écrans à haut débit de cette nature. Cela peut être dû à des effets de bord ou la distribution d'une culture bactérienne non homogène dans les plaques. Pour les premiers, en vous assurant un joint perméable au gaz est utilisé pendant l'incubation est vitale. Tandis que, pour ces derniers, l'amorçage de la tubulure de manipulateur de liquides avec un volume de la culture au moins trois fois le volume mort du tube lui-même est recommandée. Il est essentiel de garder l'agitateur magnétique à vitesse minimale pendant la distribution. Bien que le suivi et le stockage des plaques de 384 puits pour une croissance constante au cours des expériences est primordiale, une situation à éviter est l'empilement de plaques pendant l'incubation car il peut causer nonvoulu gradients d'oxygène conduisant à un biais dans le modèle de croissance. Il est également important de veiller à ce que le véhicule DMSO utilisé comme témoin négatif n'a pas un impact négatif sur la croissance de la souche d'intérêt. Beaucoup de ces problèmes liés à la croissance peuvent être évités en effectuant un écran simulée avec la souche bactérienne d'intérêt avant le dépistage. L'interprétation des données mérite également considération étant donné que les résultats d'inhibition c-di-GMP sont calculées par le changement arbitraire des unités d'intensité de fluorescence qui doit être corrigée pour la modification de la densité cellulaire. Avec cela à l'esprit différentes formules mathématiques pour évaluer la sortie de données à partir de ces expériences devrait également être envisagée. Par exemple, un composé pourrait apparaître comme un inhibiteur de c-di-GMP, mais en fait être un inhibiteur de croissance ou vice versa, ce qui nécessite une interprétation prudente des résultats identifiés.

Il y a plusieurs inconvénients et limitations qui doivent être considérés lors de l'élaboration et de la performance de cetteÀ haut débit cellulaire sur écran. Par exemple, les fonctions bio-rapporteurs sur une mesure indirecte des niveaux c-di-GMP cellulaires en utilisant une sonde fluorescente dont les propriétés de détection pourraient potentiellement être affectées par de petites molécules utilisées dans un écran. Un problème tangentielle est le fait que le dosage à base de cellules ne donne aucune information en ce qui concerne le mécanisme derrière les changements dans les niveaux de intracellulaire c-di-GMP. Par conséquent, les observations importantes des expériences doivent être confirmés à l'aide d'un liquide approche de spectrométrie de chromatographie en masse à haute performance, qui est considéré comme la méthode «étalon-or» pour mesurer intracellulaires fluctuations c-di-GMP dans les bactéries. De plus, notre procédé ne peut fournir des informations concernant le comportement des bactéries cultivées in vitro, les cellules bactériennes cultivées dans le cadre de l'hôte (in vivo) modifier rapidement leurs activités en raison de cet environnement. En outre, le processus d'utilisation d'un biorapporteur GFP signifie que l'écran ne prend pastenant compte de l'état physiologique des cellules bactériennes. Cependant, le protocole peut être adapté à un contrôle microscopique des puits individuels au cours de l'écran.

Même avec ces considérations et limitations, ce dosage à haut débit est encore un écran robuste pour de petites molécules capables d'interférer avec les niveaux c-di-GMP intracellulaires. Depuis de nombreuses espèces microbiennes, y compris de nombreux agents pathogènes bactériens ont été étudiés afin de caractériser la modulation des niveaux c-di-GMP intracellulaires, notre protocole pourrait être appliquée à diverses espèces bactériennes et élargi à l'étude des modèles plus complexes de bactéries multispécifiques. Le dosage peut être facilement optimisée pour les autres espèces bactériennes en modifiant les conditions de croissance utilisées, ou peuvent être adaptés pour lire d'autres produits en utilisant différents bioreporters. Différentes durées d'incubation peuvent être appliqués en fonction de la phase d'intérêt de croissance. Cependant, lors du redimensionnement ou de plus en plus par le biais-vente, il est importan t à garder à l'esprit que les bactéries seront toujours de plus en plus lors de la préparation des plaques et des mesures de lecture. Par conséquent, il est recommandé de dépister un maximum de 15 plaques à la fois en utilisant ce protocole. De plus, en utilisant des plaques avec plus de 384 puits peut ne pas permettre une croissance uniforme, ce qui nécessite une optimisation plus poussée. Lorsque mise à l'échelle vers le bas le nombre de plaques, il peut être plus approprié pour inoculer manuellement à l'aide d'une pipette électronique au lieu d'un robot de manipulation de liquide. Il est clair que ce protocole pourrait être utilisé pour étudier les petites molécules qui se dispersent biofilms, étant donné que les composés anti-biofilm interfèrent avec la signalisation c-di-GMP. Le protocole pourrait également être réaménagé pour comprendre les divers aspects de la physiologie bactérienne. Etant donné que la signalisation de c-di-GMP est très répandue dans la plupart des bactéries, en étudiant les physiologies de ces organismes en utilisant ce protocole on peut identifier différents stimuli chimiques pour déterminer si oui ou non leurs mécanismes de fonctionnement exigent une signalisation de c-di-GMP.

_content "> En résumé, la robustesse et la polyvalence de l'approche présentée dans ce protocole facilitera l'identification des modulateurs chimiques de c-di-GMP signalisation dans de nombreux systèmes biologiques.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysogeny Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-1KG
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-1KG
Lysogeny Broth with Agar (Lennox)	Sigma Aldrich	L2897-1KG
Ampicillin sodium	Sigma Aldrich	A0166-25G
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516-1L
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4	Life technologies	10010-056
Tobramycin sulfate	Sigma Aldrich	T1783-100MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	276855-250ML
Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer	Thermoscientific	840-208100
2 mm gap electroporator cuvette	Bio-Rad	1652092
BioRad GenePulser XCell electroporator	Bio-Rad	1652662
Leica Fluorescent Stereomicroscope	Leica Microsystems	MZ16FA
BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilize by autoclaving before use)	Sigma Aldrich	Z328952-10EA
384-well, white-walled, clear-bottom plates	Greiner	781098
Multidrop Combi reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300
Multidrop Combi tubing	Thermo Scientific	24073290
VIAFLO II 16-channel electronic pipette	Integra Biosciences	4642
100 ml sterile disposable reagent reservoirs	Fisher Scientific	12399175
AeraSeal air-permeable membranes	Sigma Aldrich	MKBQ1886
Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13)	BMG Labtech	Pherastar FS