Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Özet

Bu makalede, başarılı antibakteriyel ilaç keşfi ve bileşik testi için yeni bir güçlü bir araç sağlayarak, Pseudomonas aeruginosa siklik di-GMP hücresel seviyelerini işlemek için potansiyel yeteneği küçük moleküllerin büyük kütüphanelerinin taranması amacıyla kurulmuştur yüksek verimli deneyi anlatır.

Özet

Geleneksel bakterilerin antibiyotik direncidir yeni keşfedilen düzenleyici yollardaki yeni ilaç hedeflerini tanımlamak için araştırma girişimleri tahrik etmiştir. İkinci haberci olarak hücre içi siklik di-GMP (c-di-GMP) kullanan düzenleyici sistemlerin hedef böyle bir sınıf vardır. c-di-GMP antibiyotik direnci, biyofilm oluşumu ve virulans dahil süreçleri geniş bir yelpazede düzenleyen davranır hemen hemen tüm bakterileri bulunan bir sinyal molekülüdür. c-di-GMP antibiyotiklere dirençli biyofilm gelişimi kontrol yönlerini sinyalizasyon nasıl anlayış nükleotid veya bu sinyal yollarının bozulması hücresel konsantrasyonlarının değişiklik azaltılmış biyofilm oluşumu veya antibiyotiklere biyofilm artan duyarlılık yol açabilir sayede yaklaşımlar önerilmiştir. Yeşil floresan proteini ekspresyonu Cı-di-GMP tepkimeli yükseltici cdrA kontrolü altındadır (GFP), göre, basit bir yüksek verimli bioreporter protokol açıklarPseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) c-di-GMP hücresel seviyelerinin modüle edilmesi için potansiyele sahip küçük moleküller için hızlı bir şekilde taramak için. Bu basit protokol 48 saat içinde yukarı 3.500 bileşiklerin taranması ve çoklu mikroorganizmalar adapte edilmesi yeteneğine sahiptir.

Giriş

klinik olarak önemli antibiyotiklere karşı bakteriyel direnç hızla gelişmesi şu anda dünya çapında sağlık çalışanlarının karşılaştığı temel sorunlardan biridir. Geleneksel antibiyotikler Bu başarısızlık virülans ve hastalığın ilerlemesi ¹ katılan bakteriyel süreçler engelleyebilir kimyasal madde için yeni arayışları sürdü. Kullanan böyle bir düzenleyici sistemin hücre içi di-GMP (c-di-GMP) son zamanlarda umut verici geçerlilik ^2-4 ile bir hedef haline gelmiştir halkalı ikinci haberci. Küresel ikinci haberci sinyal molekülü antibiyotik direnci, yapışma, biyofilm oluşumu ve hastalık ^2-4 gibi birçok fonksiyonlarını düzenler tespit edilmiştir.

Artık, bakteriyel hücrede Cı-di-GMP hücresel düzeyde GTP iki molekül GGDEF etki alanı içeren diguanylate siklazlar (KEGM) wh C-di-GMP sentezlenmesi için kullanılmaktadır, böylece sentez ve indirgenme ile kontrol edilir anlaşılmalıdırereas Cı-di-GMP bozulması EAL veya HD-GYP alan ya sahip fosfodiesterazlar (PDE'ler) tarafından katalize edilir ((3 gözden, 5)). Bu alan ihtiva eden proteinler, sıklıkla Cı-di-GMP devir etkinliklerini çevresel veya hücre ipuçları ^3,5 ya doğrudan ya da dolaylı olarak düzenlendiğini düşündürmektedir diğer sinyal alanları içerir. Sonuç olarak, c-di-GMP bakteriyel fenotipe değişikliklere farklı çevresel ipuçlarını algılama bağlamak için fonksiyonları sinyal. Cı-di-GMP çeşitli mekanizmalarla ⁴ transkripsiyon, post-transkripsiyon ve translasyon sonrası seviyesinde bakterilerde düzenleyici etki gösterir.

Birçok bakteriyel hücrelerde c-di-GMP önemli bir etkisi biyofilm hücreli yapılar yüzeylerine bağlanmış veya organize hareketli planktonik hücreler ve sesil hücreler arasındaki geçişlerin kontrolünde, özellikle de bakteriyel 'yaşam tarzı' ve belirlenmesinde olan ^3,5. Genel olarak, yüksek bir gözenekdüşük hücresel düzeyleri pek çok bakteriyel patojenler ^3,5 hareketlilikten ve hastalık oluşturma faktörü sentezi teşvik ederken Cı-di-GMP seviyeleri, biyofilm ve sessility ile ilişkilidir. Böylece, c-di-GMP sinyalizasyon çalışmalarının daha ayrıntılı bilgi bakteriyel patojenler biyofilm oluşumu ve virulans engellenmesi için stratejiler göze olabilir. Bu birçok bakteriyel genomları GGDEF, EAL ve / veya HD-GYP etki (örneğin P. aeruginosa 40 proteinleri vardır) ve çoklu etkileyiciler ^6,7 ile çok sayıda proteinleri kodlayan verilen yıldırıcı bir iştir.

Ancak, bu bile karmaşıklığı ile, son kanıtlar c-di-GMP sinyalini manipüle stratejiler antibiyotiğe dirençli enfeksiyonlar gelişmekte önlemek veya klasik antibiyotik ² birlikte uygulanması ile bağışıklık sistemi ya da etkin tedaviye onları duyarlı hale birine geliştirilmiş olabileceğini düşündürmektedir. Buna paralel olarak, bu deneysel yapay bir azalma ortaya konmuşturin vitro -grown P. hücre içi c-di-GMP aeruginosa P. ise, biyofilm oluşumunu azalmış ve antimikrobik yatkınlığın artmasına yol açar farelerin peritonal boşluğuna bulunan silikon implantları aeruginosa yedirilerek biyofilm, benzer bir şekilde ^8-11 dağıtılabilir.

Burada, potansiyel olarak P. hücresel Cı-di-GMP seviyesini modüle küçük moleküller taranması için yüksek verimli, flüoresan bazlı raportör analizini tarif aeruginosa (Şekil 1). Deneme Bulunan: C-di-GMP sentezleme transkripsiyonel Cı-di-GMP-duyarlı cdrA promoteri ¹² bağlı olan, daha önce geliştirilmiş GFP raportör kullanılarak, hücresel seviyelerinin ölçülmesi esasına dayanır. Bu protokol, P. raportör yapısının ekspresyonu için bir metodoloji tarif eder Çevrede aeruginosa ırk, levha bileşik hazırlama, biz olarak 384 oyuklu plakalar, büyüme koşulları içine kültür aşılamaVeri toplama, yönetim ve analiz (Şekil 1) ile ilgili ayrıntılar olarak ll. Genel olarak, bu protokol bakterilerde sinyal c-di-GMP hedefleyen yeni bileşikler tespit potansiyel araştırmacıları yardım ve araştırma kullanılmak üzere P. biyolojisini anlamaya yönelik olacak aeruginosa.

Protokol

Not: Saflaştırılmış C-di-GMP raportör plasmidinin klonlama ve başkalaştırma için prosedürler başka ¹² tartışılmıştır.

C-di-GMP Muhabir P. Tagged GFP 1. Nesil aeruginosa'nın

1. P. tek bir koloni ile lizojeni suyu 5 ml (LB) ortamı aşılamakta aeruginosa 200 rpm'de çalkalanarak bir gece boyunca 37 ° C inkübasyon ve.
2. Transferi 2 1 L'lik bir şişe içinde, taze LB ortamında 200 ml, gece boyunca kültürün mi, 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edin.
3. 600 nm (OD _600), şişeden 1 ml numune alma ve (daha önce anlatıldığı gibi ¹²⁾ bir spektrofotometre kullanılarak incelenmesi ile her 30 dakikada optik yoğunluk izleyin.
4. OD ₆₀₀ 0.3 arasında ulaştığında - 0.5, 50 ml konik santrifüj tüpüne kültür 40 ml yerleştirin.
5. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 8000 rpm'de santrifüj hücreleri topak süpernatantı ve r atınbuz soğukluğunda steril, 300 mM sukroz çözeltisi 40 ml hücreleri, e askıya.
6. Aşama 1.5'te tarif edilen buz gibi soğuk, steril, 300 mM sukroz çözeltisi, 20 ml yeniden askıya olarak santrifüj hücreleri bir kez Pelet.
7. Aşama 1.5'te tarif edilen buz gibi soğuk, steril, 300 mM sukroz çözeltisi 400 ul içinde yeniden askıya olarak santrifüj hücreleri son bir kez Pelet.
   Not: bu noktada hücre yoğunluğu mililitre başına yaklaşık olarak 1 x 10 ¹¹ koloni oluşturan birim (CFU / ml) olması gerekir.
8. bunlar elektroporasyon hazır sonra, 30 dakika için, buz üzerinde hücreleri soğutun.
9. P. 40 ul 0.2 ug / ul pCdrA :: GFP ^Cı plazmid ¹² çözeltisi 1 ul ekle aeruginosa elektro-kompetan hücreler buz üzerinde önceden soğutulmuş olan bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde yukarıda hazırlanan. süspansiyon karıştırın ve önceden soğutulmuş 2 mm bir elektrot aralığı, elektroporasyon küvetine aktarılır.
   Not: pCdrA :: GFP ^C: P. Cı-di-GMP hücre içi seviyesinin bir flüoresan değerini gösterir pUCP22Not-P _cdrA -RBSII- GFP (Mut3) -T ₀ -T _1, Amp Gm ^{r r,} aeruginosa suşları, gelişmiş ve Rybtke ve ark., ¹² ile doğrulandı.
10. kağıt mendil ile küvetin dışına nem kaldırmak ve Elektroporatör örnek odası ve küvet. 2.5 kV, 25 | iF ve kapasitans ve 200 Ω direnç bir gerilim ile nabız.
11. küvet çıkarın ve LB ortamı içinde 1 ml. Daha sonra, steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü hücreleri transferi ve 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edilir.
12. 10 ul, 50 ul (100 ug / ml'lik bir konsantrasyonda) ampisilin ile desteklenmiş steril LB-agar plakaları üzerine kültürün 100 ul alikotları yayılmış ve bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
13. (Excitati GFP ifade onaylamaktek bir koloni, standart bir GFP kanalı ile bir floresan mikroskobu altında plaka incelenmesi ve çekme ile 485 nm, 520 nm emisyon), 5 mi kilodan aşılanması için aşama 1.1 'de tarif edildiği gibi, gece boyunca inkübe edin. -80 ° C üst boru ve mağaza vida 2 ml 0.5 ml% 50 gliserol ile bir gece boyunca kültür 0.5 ml karıştırın.

Aşılama için Starter Kültür 2. Hazırlık

1. İki gün ekran önce, P. plaka aeruginosa'nın den (pCdrA :: GFP ^Cı plasmid ihtiva eden) -80 LB-agar plakası üzerine Cı stokunun ° yavaşça steril bir aşı kullanılarak plaka üzerinde bakteri yayarak (100 ug / ml bir konsantrasyonda ampisilin ile desteklenmiş) döngü. 37 ° C'de gece boyunca inkübasyona bırakılır.
2. Tarama akşam önce, P. tek bir koloni aşılamak LB ortamında 10 ml plakadan aeruginosa'dan tu (100 ug / ml bir konsantrasyonda ampisilin ile desteklenmiş)olabilir ve 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de ön-kültür bir gece boyunca inkübe edilir.
3. Ekranın gün, ayrıca bir OD% 5 LB ile seyreltilerek bir OD daha sonra 1.0 ₆₀₀ ve taze LB ortamı ilk seyreltilmesi ile bir gece boyunca ön kültür bir alt kültür hazırlanması 0.04 (01:25 oranında) ₆₀₀ .
   Not: aşılanmış ortam toplam hacmi, test edilecek plakaların sayısına bağlıdır. % 5 LB gerekli konsantrasyona fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile% 100 LB seyreltilmesiyle yapılmıştır. Önemlisi, medya (% 5 LB) pCdrA kurucu aktivasyon :: P. GFP ^C veriyor aeruginosa.
4. bunlar 384 gözlü levhalar içine tevzi edilmeden önce bakteri ortam alışmasına izin oda sıcaklığında 30 dakika için bir manyetik karıştırıcı üzerinde en az bir hızda kültür kabı içine steril bir manyetik karıştırıcı çubuğu ilave edin ve karıştırın.

Ihtiva eden 384 çukurlu Plakalar 3. aşılama ve inkübasyonKüçük moleküller

Not: Kısırlık ve iyi aseptik teknikler aşağıdaki adımlara büyük önem taşımaktadır.

1. pozitif kontrol (% 100 inhibisyon) hazırlamak için, Aşama 2.3'te elde alt kültürü, 10 ml (en fazla 12 plakaları için yeterli) 20 ul tobramisin sülfat (25 mg / ml) ekleyin ve yavaşça karıştırın. Pipet kuyular A23 içine pozitif kontrol kültürünün 40 ul - P23 (Şekil 2).
2. negatif kontrol (% 0 inhibisyon) hazırlamak için, Aşama 2.3'te elde alt kültürü, 10 ml (en fazla 12 plakaları için yeterli) 30 ul dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin ve yavaşça karıştırın. Pipet kuyu A24, negatif kontrol kültürün 40 ul - P24 (Şekil 2).
3. P22 (Şekil 2) - küçük moleküller ile damgalanmış plakalarının her biri için, bir kuyu A1 (Kademe 2.3 anlatılan) ile seyreltildi, gece boyunca kültürün 40 ul hacmi inoküle.
   Not: Bu, bir sıvı tutucu rob kullanılarak elde edilebilirot. Bakteriyel kültürler heterojen özellikleri, dağıtma sırasında sürekli olarak ortam dağıtılan bakteri tutmak için sürekli ve orta ajitasyon sağlamak için önemlidir. Bunu yapmak için, manyetik dağıtım esnasında adım 2.4 acclimatized kültürü karıştırmaya devam edin.
4. bir hava-geçirgen, örtücü bir conta ile plakaları Seal ve 37 ° C de 6 saat inkübe edilir.
   Not: hava geçirgen mühür 384 kuyuların arasında değişmeyen koşulları sağlamak ve plaka boyunca oksijen geçişlerini potansiyel gelişimini engelleyecek önemlidir.

4. Büyüme (OD ₆₀₀₎ ve Hücre içi c-di-GMP Seviye Ölçümü (GFP)

1. Yaklaşık 30 dakika spektrofotometrik ölçümden önce, yoğunlaşmayı önlemek için 37 ° C plaka okuyucu önceden ısıtmak.
2. Yavaşça okumadan önce hava geçirgen kapak contası çıkarın. oyuk başına 10 yanıp ayarı ile 600 nm'lik bir dalga boyunda optik yoğunluk ölçme ve0,2 saniyelik bir yerleşme zamanı.
3. Floresan ölçüm önce de A24 (negatif kontrol) dayalı bir otomatik kazanç ve odak ayarı yapmak ve% 75 (Şekil 2) kazanç hedef değerini ayarlayın.
   1. plaka okuyucu kontrol yazılımından, başlangıç ​​ölçümü tıklayın ve 'tıklayın' Odak ve Kazanç Ayarı / Plate kimlikleri '' sekmesine gidin.
   2. penceresinde sağ tarafta '' Odak Ayarı '' ve '' Kanal A '' seçeneğini seçin.
   3. '' Kazanç Ayarı 'seçip' 'iyi seçilmiş' ve 'Hedef değeri' 'olarak' '75' 'yazın. Son olarak, '' Ayarı Başlat 'tıklamadan önce plaka düzeni de A24 almak. Ayar yapılır sonra, '' Ölçümü başlatın 'üzerine tıklayın.
   4. kuyu ve bir settli başına 10 yanıp ayarı ile 485/520 nm uyarma / emisyon maxima GFP muhabir floresan ölçmek0.2 saniye ng süresi.
4. incelenen tüm plakaları verileri toplayın. Not: Veri okumaları otomatik plaka okuyucu kontrol yazılımı tarafından varsayılan olarak kaydedilir.
   1. istatistiksel analiz paketini açmak için kontrol yazılımı içinde "Mars" ikonuna tıklayarak gör okumaları.
   2. analiz için verilere erişmek için ilgi plaka numarasına "çift tıklayarak" verileri almak.

5. Veri Analizi

1. yüksek verimli ekranlar için en sık bildirilen kalite ölçütleri olan sağlam z 'analizi kullanılarak tahlil tekdüzelik ve tekrarlanabilirlik değerlendirin. Sağlam z 'formülü kullanarak hesaplayın:
   
   MAD (Medyan Mutlak Sapma) standart sapmasının tahmini olduğunda, p pozitif kontrol (% 100 inhibisyon) ve n negatif kontrol hem OD ₆₀₀ ve GFP v (% 0 inhibisyon) 'diredilen değerler. Not: ya da daha büyük 0.5'e eşit (her ikisi de OD ₆₀₀ ve GFP ham veri için hesaplanan) sağlam bir Z 'değeri bir yöntemi mükemmel tahlil olarak kabul edilir.
2. formül kullanılarak büyüme% 'sinin hesaplanması:
   
   Nerede Xi _OD600 Her numunenin tekrarlanan OD ₆₀₀ değeri iyidir. İnhibisyon% 'si _OD600> 0, büyüme inhibitörü; % Önleme _OD600 <0, büyütme faktörü.
3. formül kullanılarak C-di-GMP hücre içi seviyesinin% inhibisyonunu değerlendirmek (keyfi floresan yoğunluğu birimleri değişim hücre yoğunluğundaki değişikliğin düzeltilmesi)
   
   Nerede Xi _GFP Her numunenin tekrarlanan GFP değeri iyidir. İnhibisyon% _{'si, GFP>} 0, c-di-GMP inhibitörü; %# 160; İnhibisyon _GFP <0, c-di-GMP destekleyicisi.
4. örnekten hesaplanan medyan (ortanca ± 3 MAD), 3 MAD de isabet tespiti için eşik değeri de veri noktaları normal dağılıma varsayarak, her plaka-çıkışları okuyun. Not: Ancak gerekirse ±% 50 inhibisyon kesme daha tekrarlanabilir ve hassas doz tepki deneyleri için seçilebilir.

Sonuçlar

Burada anlatılan yaklaşım verimli ve başarılı bir 48 saatlik süre içinde 3.500 bileşiklerin ortalama ekrana tek bir araştırmacı sağlar. Yüksek verimli bir tarama protokolü bir genel görünüşü Şekil 1'de, bir akış şeması tasvir edilmiştir. Mevcut madde sağlamak için, 600 uM'lik bir son konsantrasyon elde potansiyel Cı-di-GMP modüle bileşikler için üstünlüğü beş uyumlu bir bileşik kütüphanesi taranmıştır . Bununla birlikte, deneyde kullanılacak olan, bileşik setleri gibi pek çok ticari olarak temin edilebilir, ilaç benzeri ve ilaçsız vardır. Bu takımlar bakteri odaklı bileşikler ya da rastgele havuza bileşikleri olabilir ama her kütüphane polar fonksiyonel gruplar ve birden fazla stereojenik merkezler sahip Burada filtrelenmiş grubu olarak, atanan fizikokimyasal özellikleri ve karakteristikleri esas olur. Bu protokol, bakteri boyunca bileşikler ile levha, bir antibiyotik pozitif kontrol ve bir DMSO araç içine aşılanırKontrol, Şekil 2'de gösterilen düzenine göre yöntem. 3, tek bir kütüphane plaka ile örneklenen ana tarama sonuçlarını tasvir etmektedir. Örnek OD ₆₀₀ ve GFP ham veriler, sırasıyla Şekil 3A ve 3B'de gösterilmiştir. Yüksek OD ₆₀₀ / GFP değerlerine düşük gösteren sıcak (kırmızı) ile renk degrade ısı haritası, soğutmak için (yeşil) renk, iyi değerlerine uygulanmıştır. Isı haritaları düşük OD uzanan bir 3-Renk skalası koşullu biçimlendirme uygulayarak bir tablo yazılımında oluşturulan ₆₀₀ / GFP Okuması en yüksek OD ₆₀₀ / GFP okuması kadar. DMSO negatif kontrole göre yüksek değerler, büyüme ve Cı-di-GMP seviyeleri bir promosyon uygun ise DMSO negatif kontrole göre düşük OD ₆₀₀ ve GFP değerleri, büyüme ve Cı-di-GMP seviyeleri inhibisyonuna karşılık . OD ₆₀₀ ve GFP ar için sağlam z 'değerlerie protokolü (5.1) sağlanan formüle göre hesaplanır. onlar 0.5 (sırasıyla 0.694 ve 0.761) hem de yukarıda olduğu için, deney kalitesi sağlam görüldü ve veriler ayrıca analiz edildi. Büyüme (OD ₆₀₀₎ ve hücre içi c-di-GMP seviyesinin (GFP)% İnhibisyon Protokolü (5.2, 5.3) temin formüllerle hesaplanır. Temsili veriler sırasıyla Şekil 4A ve 4B gösterilmiştir. yüksek% inhibisyonuna düşük gösteren sıcak (kırmızı) ile renk degrade ısı haritası, soğutmak için (yeşil) renk, iyi değerlerine uygulanmıştır. Birinci eleme göre ayrı ayrı oyuklanndan% inhibisyon _{(OD600 / GFP)} saçılma grafiğidir Şekil 5A'da çizilen sırasıyla OD ₆₀₀ ve GFP veri 5B. ±% 50 kesme (noktalı çizgiler ile gösterilmiştir) isabet tespiti için seçilir. Bu cut-off dayalı potansiyel hit kırmızı noktalar ile gösterilir. ilgi çekici bir bileşik iki tür d edilebilirtahlilinden iscerned. Şekil 5B'de belirtilen isabetler potansiyel Cı-di-GMP hücre içi düzeylerini düzenleme yeteneğine sahip olan bileşikler, ise Şekil 5A'da tanımlanan isabetler, bakteriyel büyümeyi inhibe eden bileşiklerdir. İki bileşikler bu deney için Örnek isabetler olarak tespit edilmiştir. Bu bileşik A, potansiyel bir büyüme önleyicisi ve bileşik B, potansiyel bir Cı-di-GMP inhibitörü. Bileşik A, Şekil 3'te de F8 tekabül ve 4 büyümesinde% 72.5 inhibisyon vardı. siklik di- GMP seviyeleri beklenen karşılık gelen önlendi. Bileşik B, Şekil 3 de K3 tekabül 4 ve büyüme herhangi bir değişiklik siklik di- GMP seviyeleri% 61 önlemesine sahiptir. Seçin isabet bileşikleri bundan başka, 2 mM ve iki katlı bir seyreltme serisi üstten konsantrasyonu ile 10 noktalı doz-yanıt yöntemi ile test edildi. _IC50 değerleri doz-yanıt dayalı hesaplanıreğrileri (Şekil 6A ve B).

Şekil 1. Genel: P. c-di-GMP Hücresel Seviyeleri modüle Onların Potansiyeli Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur aeruginosa. Bu genel bakış Bu testte kullanılan protokolün adım adım bir temsilini göstermektedir. P. bir bakteri kolonisi aeruginosa LB başlatıcı kültür içinde bir gece boyunca yetiştirilir. Reaktif dağıtıcı kullanılarak, hücreler, seçilen bileşikleri ihtiva eden, 384-gözlü plakalara aşılanır. Plakalar OD ₆₀₀ ve GFP değerleri ölçülmüştür sonra 6 saat daha kuluçkalanmıştır. Bu okuma-çıkışları, tespit edilebilir c-di-GMP hücresel düzeylerini etkileyen bileşikler kullanılarak. Bir görmek için buraya tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonu.

. Şekil 2. Testi Tarama Küçük Molekül için kullanılır bir 384-Plate Harita kitaplığı (açık mavi) gelen bileşikler kuyular A1 bölünür - P22. DMSO kuyu A24 eklenir% 1 bir son konsantrasyon ihtiva eden P23 ve "Negatif kontrol" (yeşil) - "Pozitif kontrol" (kırmızı) 50 ug / ml tobramisin sülfat kuyu A23 eklenir ug bir son konsantrasyonda oluşan - P24. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bir 384-iyi Eleme Plate için Şekil 3. Temsilcisi Sonuçlar. Representative ham veri OD ₆₀₀ (A) ve GFP (B) içindir. Sıcak olan bir renk degrade ısı haritası, (Kırmızı: OD ₆₀₀ = 0.65 veya GFP = 250.000) soğutmak için (Yeşil: ₆₀₀ = 0.10 veya GFP = 40,000 OD) yüksek değerlere düşük gösteren renkler, iyi değerlerine uygulanmıştır. DMSO kontrolü göre daha yüksek OD ₆₀₀ / GFP okumalar var kuyular yeşil olma eğiliminde ise DMSO negatif kontrol alt OD ₆₀₀ / GFP okumaları akrabası olması kuyular kırmızı olma eğiliminde olacaktır. Bir büyük görmek için tıklayınız Bu rakamın sürümü.

384 plaka için hesaplanan engelleme yüzdesi Şekil 4. Örnek Sonuçlar. Analiz% Önleme verileri, OD ₆₀ her ikisi de temsil edilir0 (A) ve GFP (B) okumaları. Sıcak olan bir renk degrade ısı haritası, (Kırmızı: OD ₆₀₀ = -150% veya GFP = -20%) (Yeşil: OD ₆₀₀ =% 100 veya GFP =% 100) soğutmak için renkler, yüksek inhibisyon değerleri düşük gösteren olmuştur kuyu değerlerine başvurdu. Potansiyel büyüme ve hücre içi engelleyen küçük moleküller, c-di-GMP potansiyel büyüme ve hücre içi c-di-GMP düzeylerini desteklemek, küçük moleküller kırmızı olma eğiliminde ise yeşil olma eğiliminde olacaktır. Tıklayınız daha büyük bir versiyonunu görmek için bu rakamın.

Her test Küçük Molekül. Her küçük molekülün Elde Edilen% inhibisyonu _{(OD600 / GFP)} Şekil 5. Temsilcisi Dağılım Arsalar bir nokta ve% inhibisyon dağılımı ile temsil edilirOD ₆₀₀ (A) ve GFP (B) her biri için okumaları gösterilmiştir. A ±% 50 cut-off isabet belirlenmesi için seçilir. Potansiyel hit kırmızı vurgulanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bir doz, Şekil 6. Örnek Sonuçları -., Önceki ekranlarından tanımlanan yanıt Deney iki bileşik (potansiyel büyüme inhibitörü A ve potansiyel Cı-di-GMP inhibitörü B) ayrıca 2 üstten bir konsantrasyon ile 10 noktalı doz-yanıt deneyinde test edilir mM ve iki-kat seyreltme serisi. 158 uM ve 193 uM arasında _IC50 değerleri, sırasıyla veri dört parametreli bir lojistik fonksiyonun verim ile elde edildi takılması. Please bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayın.

Tartışmalar

Bakteriyel enfeksiyonların tedavisini geliştirmek amacıyla, moleküler bir düzenleyici seviyede bakteriyel davranışını daha iyi anlaşılması için açıktır. Burada açıklanan prosedür manipüle veya bakteriler c-di-GMP hücresel konsantrasyonları ile müdahale potansiyeline sahip küçük moleküller ortaya çıkarmak istiyorsanız mikrobiyolog, biyokimyacı ve klinisyenler için yararlı olacaktır. Yöntem P. c-di-GMP hücresel seviyelerini izlemek için yeni geliştirilen GFP bioreporter kullanır aeruginosa ^12. Bu bioreporter önemlisi kültürlendiğinde% 5 LB PBS kullanılan suşunun büyümesini etkileyen için geçerli ve gösterilmiştir. In vivo olarak, c-di-GMP seviyesini değiştiren küçük molekülleri tanımlamak için bir bütün hücre ekranın kullanılması, özellikle Gram-negatif bakterilere yoluyla bakteriyel zarlardan molekülü penetrasyonu hedef bazlı ilaç keşfi büyük zorluklar üstesinden . Önemli bir şekilde, To tahlil 0.5 bugüne kadar tüm ekranlarda gözlendi sürekli yukarıda sağlam z 'değeri olarak çok sağlam görünüyor. Inhibe eden ve / veya P. hücre içi c-di-GMP seviyesini geliştirmek küçük moleküllerin sayısı ortaya çıkaracaktır, bu protokol kullanılarak tarama aeruginosa. Ayrıca, bu deney de bakteri öldürücü ya da OD ₆₀₀ okuması bir azalma ile sonuçlanan bakteriyostatik bileşiklerin belirlenmesi için bir potansiyele sahiptir.

protokol bölümünde ele olmasa da, deney hazırlanması için birkaç önemli hususlar vardır. GFP bioreporter bir plazmid dayanmaktadır akılda tutmak hayati önem taşımaktadır. Reporter plazmid P. çok kararlı olduğu bilinmektedir, ancak aeruginosa, bu nedenle, sürekli yeniden sonra kaplama Cı gliserol stokundan ° 'den -80 taze kaplama suşlar kullanma ihtiyacı kaybetti ve floresans ekspresyonunu kontrol kritik olabilir. Ekranın boyunca üniform büyüme koşullarını sağlamak için de çok değerlidirBu koşullarda herhangi bir dalgalanma ekranda knock-etkileri olabilir çünkü. Bu medya ve antibiyotikler toplu premade ve ekranın boyunca kullanılmaktadır emin hale içerir. Bakteri kültürleri düzgün bir şekilde (OD ₆₀₀ okumaları göre) büyüyen değil, bu doğanın en yüksek verimli ekranlar için ortak bir sorundur. Bu etkileri veya tabak içine homojen olmayan bir bakteri kültürü dağıtım kenar bağlı olabilir. Eski için, inkübasyon sırasında kullanılan bir gaz geçirgen conta hayatidir emin. ikincisi, bir kültür hacmi ile sıvı işleyici boru priming birlikte en az üç kez, borunun kendisi ölü hacmi tavsiye edilmektedir. Dağıtım sırasında en az bir hızda manyetik karıştırıcı tutmak için çok önemlidir. izleme ve deney boyunca tutarlı bir büyüme 384 oyuklu plakaların saklanma çok önemlidir birlikte, önlemek için bir durum un neden olabilir inkübasyon sırasında levhalar istiflenmesinibüyüme modelinde bir çarpıklık giden oksijen gradyanlar istedi. Bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır DMSO aracı negatif ilgi suşunun büyümesini etkileyen olmadığından emin olmak için önemlidir. büyüme ile ilişkili bu sorunların çoğu tarama öncesinde ilgi bakteri suşu ile sahte bir ekran yaparak önlenebilir. Cı-di-GMP inhibisyon sonuçları, hücre yoğunluğundaki değişikliğin düzeltilmesi gerekir rasgele floresan yoğunluğu birimleri değişikliği hesaplanır verilen aynı zamanda veri yorumlama yararları göz. Bu akılda farklı matematiksel formüller Bu deneylerde elde edilen veriler çıkışı da dikkate alınmalıdır değerlendirmek. Örneğin, bir bileşik, bir C-di-GMP inhibitörü olarak görünebilir, ancak gerçekte belirlenen isabet ihtiyatlı yorumunu gerektiren büyüme önleyicisi ya da tam tersi olabilir.

Bu gelişim ve performansı sırasında dikkat edilmesi gereken birkaç sakıncaları ve sınırlamalar vardıryüksek yayılmalı hücre bazlı bir elek. Örneğin, algılama özellikleri ve potansiyel olarak ekranda kullanılan küçük moleküller etkilenebilir florasan bir sonda kullanarak, hücresel Cı-di-GMP seviyeleri dolaylı ölçüm biyo-muhabir işlevleriyle. Teğetsel konusu hücre bazlı deney, hücre içi c-di-GMP seviyelerindeki değişikliklerin arkasındaki mekanizma ile ilgili herhangi bir bilgi veren bir gerçektir. Bu nedenle, deneylerden elde edilen önemli gözlemler bakterilerde hücre içi c-di-GMP dalgalanmaları ölçmek için "altın standart" olarak kabul edilmektedir yüksek performanslı sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi yaklaşımı kullanarak teyit edilmelidir. Bakteri hücreleri (in vivo) ana bağlamında yetiştirilen Bunun yanı sıra, prosedür, sadece, in vitro büyümüş bakteriler davranışı ile ilgili bilgi sağlar hızla nedeniyle bu ortama faaliyetlerini değiştirin. Ayrıca, GFP bioreporter kullanarak işlem ekranı almaz anlamına gelirbakteri hücrelerinin dikkate fizyolojik durum. Bununla birlikte, iletişim kuralı ekran boyunca ayrı ayrı kuyuların mikroskopik izlenmesi için adapte edilebilir.

Hatta bu hususlar ve kısıtlamalarla, bu yüksek verimli bir deney de hücre içi c-di-GMP seviyeleri müdahale edebilen küçük moleküller için sağlam bir ekrandır. pek çok bakteriyel patojenler de dahil olmak üzere bir çok mikrobik tür hücre içi c-di-GMP seviyeleri modülasyonunu karakterize edilmesi için incelenmiştir için, protokol, çeşitli bakteri türlerinin uygulanır ve daha karmaşık olabilir çoklu bakteri modellerinin çalışma genişletilebilir. Deney kolay büyüme koşulları kullanılabilir veya farklı bioreporters kullanarak diğer çıkış almak için adapte edilebilir değiştirerek, diğer bakteri türleri için optimize edilebilir. Farklı inkübasyon süreleri ilgi büyüme aşamasına bağlı olarak uygulanabilir. ölçeklendirme veya through-put artan Ancak, bu importan olduğunu t bakteriler hala plaka hazırlıkları ve okuma-out ölçümler sırasında büyümeye devam edecektir akılda tutulması gereken. Bu nedenle, bu protokol kullanılarak bir seferde 15 plakaların en fazla taranması tavsiye edilmektedir. Ayrıca, birden fazla 384 kuyuları ile plakaları kullanılarak daha fazla optimizasyon gerektiren, düzgün büyümeyi izin vermeyebilir. plakaların sayısını aşağı ölçekleme zaman, el elektronik pipet yerine sıvı taşıma robotu kullanarak aşılamak için daha uygun olabilir. Protokol, anti-biyofilm bileşikler, c-di-GMP sinyalizasyon müdahale göz önüne alındığında, biyofilm dağıtmak küçük moleküller araştırmak için kullanılan olabilir açıktır. protokol aynı zamanda bakteri fizyolojisi çeşitli yönlerini anlamak için redeveloped olabilir. Verilen c-di-GMP sinyal biz onların çalışma mekanizmaları, c-di-GMP sinyalini ihtiyaç olup olmadığını belirlemek için farklı kimyasal uyaranlara belirleyebilir bu protokolü kullanarak bu organizmaların fizyolojileri inceleyerek, çoğu bakteri yaygındır.

_content "> Özetle, bu protokol sunulan yaklaşımın sağlamlığı ve çok yönlülük c-di-GMP birçok biyolojik sistemlerde sinyalizasyon kimyasal modülatörlerinin tanımlanmasına yardımcı olacaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysogeny Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-1KG
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-1KG
Lysogeny Broth with Agar (Lennox)	Sigma Aldrich	L2897-1KG
Ampicillin sodium	Sigma Aldrich	A0166-25G
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516-1L
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4	Life technologies	10010-056
Tobramycin sulfate	Sigma Aldrich	T1783-100MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	276855-250ML
Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer	Thermoscientific	840-208100
2 mm gap electroporator cuvette	Bio-Rad	1652092
BioRad GenePulser XCell electroporator	Bio-Rad	1652662
Leica Fluorescent Stereomicroscope	Leica Microsystems	MZ16FA
BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilize by autoclaving before use)	Sigma Aldrich	Z328952-10EA
384-well, white-walled, clear-bottom plates	Greiner	781098
Multidrop Combi reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300
Multidrop Combi tubing	Thermo Scientific	24073290
VIAFLO II 16-channel electronic pipette	Integra Biosciences	4642
100 ml sterile disposable reagent reservoirs	Fisher Scientific	12399175
AeraSeal air-permeable membranes	Sigma Aldrich	MKBQ1886
Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13)	BMG Labtech	Pherastar FS