Estabelecimento de um programa de configuração de alta capacidade para a triagem de pequenas moléculas que modulam c-di-GMP Sinalização<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Resumo

Este artigo descreve o ensaio de elevado débito que foi estabelecida com sucesso para o rastreio de grandes bibliotecas de moléculas pequenas para a sua potencial capacidade de manipular os níveis celulares de cíclica di-GMP em Pseudomonas aeruginosa, proporcionando uma nova ferramenta poderosa para a descoberta de drogas anti-bacteriano e os testes de compostos.

Resumo

A resistência das bactérias aos antibióticos tradicionais tem impulsionado tentativas de pesquisa para identificar novos alvos de drogas em vias reguladoras recentemente descobertos. sistemas reguladores que utilizam intracelular cíclica di-GMP (c-di-GMP) como um segundo mensageiro são um tal classe de alvo. c-di-GMP é uma molécula de sinalização encontrada em quase todas as bactérias que actua para regular uma vasta gama de processos, incluindo a resistência a antibióticos, a formação de biofilme e virulência. A compreensão de como c-di-GMP sinalização controla os aspectos do desenvolvimento de biofilme resistente aos antibióticos sugeriu abordagens em que a alteração das concentrações celulares de nucleótidos ou perturbações destas vias de sinalização podem levar à formação de biofilme reduzida ou um aumento da susceptibilidade dos biofilmes aos antibióticos. Descreve-se um protocolo de alto rendimento Bioreporter simples, com base na proteína fluorescente verde (GFP), cuja expressão está sob o controlo do promotor responsivo a c-di-GMP Cdra, Para rastrear rapidamente para as moléculas pequenas com o potencial para modular os níveis celulares c-di-GMP em Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Este protocolo simples pode tela para cima de 3.500 compostos dentro de 48 horas e tem a capacidade de ser adaptado para vários microorganismos.

Introdução

O rápido desenvolvimento da resistência bacteriana a antibióticos clinicamente importantes é uma das principais preocupações que enfrentam atualmente os profissionais de saúde em todo o mundo. Esta falha de antibióticos tradicionais tem impulsionado novas pesquisas para a matéria química que pode interferir com os processos bacterianos envolvidos na virulência ea progressão da doença ^1. Um tal sistema de regulação que utiliza a intracelular segundo mensageiro cíclica di-GMP (c-di-GMP) tornou-se recentemente um alvo com validade promissor ^2-4. Estabeleceu-se que esta segunda molécula mensageira sinal global, regula muitas funções, incluindo a resistência a antibióticos, a aderência, a formação de biofilme e de doença ^2-4.

Compreende-se agora que o nível celular de c-di-GMP na célula bacteriana é controlado por síntese e degradação em que duas moléculas de GTP são utilizados para sintetizar c-di-GMP contendo o domínio ciclases diguanylate (PED) WH GGDEFereas degradação C-di-GMP é catalisada por fosfodiesterases (PDE), que têm quer uma EAL ou um domínio de HD-GYP (revisto em (3, 5)). As proteínas que contêm estes domínios, muitas vezes contêm outros domínios de sinalização, o que sugere que a sua actividade em volume c-di-GMP é regulada, quer directa ou indirectamente por estímulos ambientais ou celulares ^3,5. Consequentemente, c-di-GMP sinalização funções para ligar a detecção de diversos estímulos ambientais para modificações no fenótipo bacteriano. c-di-GMP exerce o seu efeito regulador em bactérias ao nível da transcrição e pós-transcrição e pós-tradução por vários mecanismos ^4.

Uma grande influência de c-di-GMP em muitas células bacterianas é na determinação de 'vida' bacteriano e, em particular, no controlo de transições entre as células planctônicas motilidade e células sésseis ligados a superfícies ou organizadas em estruturas multicelulares de biofilmes ^3,5. Em geral, alta celularníveis de c-di-GMP estão associados à formação de biofilme e sessility, enquanto os níveis celulares de baixo incentivar a mobilidade e síntese fator de virulência em muitos patógenos bacterianos ^3,5. Assim, um conhecimento mais detalhado sobre o funcionamento da sinalização de c-di-GMP podia pagar as estratégias para a inibição da formação de biofilme e virulência em bactérias patogênicas. Esta é uma tarefa difícil dado que a maioria dos genomas bacterianos codificar várias proteínas com GGDEF, EAL e / ou domínios HD-GYP (por exemplo P. aeruginosa tem mais de 40 proteínas) e múltiplas efetores ^6,7.

No entanto, mesmo com esta complexidade, evidências recentes sugerem que as estratégias de manipulação de sinalização de c-di-GMP pode ser desenvolvida para prevenir infecções, quer resistentes ao antibiótico ou o desenvolvimento tornam-nos susceptíveis ao sistema imune ou tratamento eficaz por co-administração de antibióticos clássicos ^2. Em linha com esta, tem sido experimentalmente demonstrado que diminuição artificialintracelular de c-di-GMP em in vitro -grown P. aeruginosa conduz a uma diminuição da formação de biofilme e aumento da susceptibilidade a agentes antimicrobianos, enquanto P. biofilmes aeruginosa -desenvolvida sobre os implantes de silicone, localizados na cavidade peritoneal de ratinhos, pode ser disperso de um modo semelhante ^8-11.

Aqui, descrevemos um de alto rendimento, ensaio de repórter baseada em fluorescência para rastrear moléculas pequenas que podem potencialmente modulam os níveis de c-di-GMP celulares em P. aeruginosa (Figura 1). O ensaio é baseado na medição de c-di-GMP níveis celulares utilizando um repórter GFP, anteriormente desenvolvido, cuja expressão é transcricionalmente ligado ao promotor Cdra c-di-GMP-responsivo ^12. Este protocolo descreve a metodologia para a expressão da construção repórter na P. estirpe aeruginosa de interesse, placa preparação composto, a inoculação da cultura em placas de 384 poços, condições de crescimento, como nósll como detalhes sobre a coleta de dados, gestão e análise (Figura 1). No geral, este protocolo vai ajudar os pesquisadores a identificar novos compostos potencialmente alvo c-di-GMP sinalização em bactérias, e para uso em investigação que visam a compreensão da biologia do P. aeruginosa.

Protocolo

Nota: Os procedimentos de clonagem e transformação do plasmídeo purificado repórter c-di-GMP são discutidos noutro local ^12.

1. Geração de GFP Tagged c-di-GMP Reporter P. aeruginosa Strain

1. Inocular meio 5 ml de caldo lysogeny (LB) com uma única colónia de P. aeruginosa e incubar durante a noite a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
2. Transferência de 2 ml da cultura durante a noite em 200 ml de meio LB fresco num balão de 1 L e incubar a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
3. Monitorar a densidade óptica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ a cada 30 minutos, tomando uma amostra de 1 ml a partir do frasco e analisar usando um espectrofotómetro (como descrito anteriormente ^12).
4. Quando a _DO600 atinge entre 0,3-0,5, colocar 40 ml da cultura para um tubo de centrífuga de 50 mL cónico.
5. Agregar as células por centrifugação a 8000 rpm durante 10 min a 4 ° C, descartar o sobrenadante e re a suspender as células em 40 ml de solução 300 mM de sacarose arrefecido em gelo, estéril.
6. Agregar as células uma segunda vez através de centrifugação, tal como descrito no passo 1.5 e re-suspensão em 20 ml de solução 300 mM de sacarose arrefecido em gelo, estéril.
7. Agregar as células de um tempo final por centrifugação como descrito no passo 1.5 e re-suspensão em 400 ul de solução de sacarose 300 mM arrefecida em gelo, estéril.
   Nota: A densidade celular neste ponto deverá ser de aproximadamente 1 x 10 ¹¹ unidades formadoras de colónias por mililitro (UFC / ml).
8. Relaxar as células em gelo durante 30 min, após o que eles estão prontos para electroporação.
9. Adicionar 1 ml de A / ¹² ul solução de 0,2 ^ g de plasmídeo pCdrA :: GFP ^C a 40 ul de P. células eletro-competente aeruginosa preparado antes, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que foi pré-arrefecido em gelo. Misture a suspensão e transferir para um pré-gelada, folga entre os eléctrodos 2 mm, cuvete de electroporação.
   Nota: pCdrA :: GFP ^C: pUCP22Not-P _Cdra -RBSII- GFP (Mut3) -T ₀ -T _1, Amp ^{r r} Gm, que dá uma leitura de fluorescência do nível intracelular de c-di-GMP em P. cepas aeruginosa, foi desenvolvido e validado por Rybtke et al. ^12.
10. Remover a humidade do lado de fora da cuvete com lenço de papel e colocar a tina para a câmara de amostra do electroporador. Pulso com uma tensão de 2,5 kV, 25 uF de capacitância e resistência de 200 Ω.
11. Retirar a cuvete e adicionar 1 ml de meio LB. Em seguida, a transferência das células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril e incubar durante 2 horas a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
12. Espalhe 10 ul, 50 ul e 100 ul de aliquotas a cultura em placas de LB-agar suplementadas com ampicilina estéreis (a uma concentração de 100 ug / ml), e incubar as placas a 37 ° C durante a noite.
13. Confirmar a expressão GFP (excitatiem pelo 485 nm, emissão a 520 nm), examinando a placa sob um microscópio de fluorescência com um canal de GFP padrão e escolher uma única colónia para inocular 5 ml LB. Incubar durante a noite, tal como descrito na etapa 1.1. Misturar 0,5 ml da cultura durante a noite, com 0,5 ml de glicerol a 50% em 2 ml de um parafuso tubo superior e armazenar a -80 ° C.

2. Preparação da cultura de arranque para uma inoculação

1. Dois dias antes da tela, a chapa do P. estirpe aeruginosa (contendo o plasmídeo pCdrA :: GFP ^C) a partir do estoque de -80 ° C sobre uma placa de LB-agar (suplementado com ampicilina na concentração de 100 ug / ml), espalhando suavemente as bactérias através da placa utilizando uma inoculação estéril loop. Incubar a placa durante a noite a 37 ° C.
2. A noite antes da exibição, inocular uma única colónia de P. aeruginosa a partir da placa em 10 ml de meio LB (suplementado com ampicilina na concentração de 100 ug / ml) em uma TUser e incubar durante a noite a pré-cultura a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
3. No dia da tela, preparar uma subcultura a partir da pré-cultura durante a noite diluindo-a em primeiro lugar com meio LB fresco a um _OD600 de 1,0 e depois ainda diluição com 5% de LB para uma DO ₆₀₀ de 0,04 (razão de 1:25) .
   Nota: O volume total do meio inoculado depende do número de placas a ser testado. 5% lb é feita através da diluição de 100% LB com salina tamponada com fosfato (PBS) até à concentração desejada. É importante ressaltar que os meios de comunicação (5% LB) permite a activação constitutiva do pCdrA :: ^C GFP em P. aeruginosa.
4. Adicionar uma barra de agitação magnética estéril para dentro do recipiente e agita-se a cultura a uma velocidade mínima em um agitador magnético durante 30 min à temperatura ambiente, permitindo que as bactérias para aclimatar aos meios de comunicação, antes de serem dispensadas em placas de 384 poços.

3. A inoculação e incubação das placas com 384 cavidades que continhamMoléculas pequenas

Nota: Esterilidade e boas técnicas de assepsia são fundamentais para as etapas seguintes.

1. Para preparar o controlo positivo (100% de inibição), adiciona-se 20 ul de sulfato de tobramicina (25 mg / ml) a 10 ml (adequado para até 12 placas) da subcultura, preparada na etapa 2.3 e misturar suavemente. Pipetar 40 ul da cultura de controlo positivo em poços A23 - P23 (Figura 2).
2. Para preparar o controlo negativo (0% de inibição), adicionar 30 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) a 10 ml (adequado para até 12 placas) da subcultura, preparada na etapa 2.3 e misturar suavemente. Pipetar 40 ul da cultura de controlo negativo em poços A24 - P24 (Figura 2).
3. Para cada uma das placas estampadas com as pequenas moléculas, inocular um volume de 40 ul das culturas durante a noite diluídas (descritos no Passo 2.3) para os poços A1 - P22 (Figura 2).
   Nota: Isto pode ser conseguido utilizando um rob manipulador de líquidosot. Devido às propriedades heterogéneas de culturas bacterianas, é importante manter uma agitação contínua e moderada para manter as bactérias de forma consistente distribuídos nos meios de comunicação durante a dosagem. Para fazer isso, manter a agitação a cultura aclimatada a partir do passo 2.4 magneticamente durante a distribuição.
4. Selar as placas com uma vedação da tampa permeável ao ar, e incuba-se durante 6 h a 37 ° C.
   Nota: O selo permeável ao ar é fundamental para manter condições imutáveis ​​em todos os 384 poços e para contornar o potencial desenvolvimento de gradientes de oxigênio ao longo da placa.

4. Medição do crescimento _(OD600) e intracelulares de c-di-GMP Nível (GFP)

1. Aproximadamente 30 minutos antes da medição espectrofotométrica, pré-aquecer o leitor de placas a 37 ° C para evitar a condensação.
2. Remova cuidadosamente a vedação da tampa permeável ao ar antes da leitura. Medir a densidade óptica a um comprimento de onda de 600 nm com um ajuste de 10 flashes por poço eum tempo de sedimentação de 0,2 seg.
3. Antes da medição de fluorescência, fazer um ganho automático e ajuste focal com base no bem A24 (controle negativo) e defina o valor-alvo de ganho em 75% (Figura 2).
   1. A partir do software de controle leitor de placas, clique na medição de início e clique no botão '' Focus e Ajuste de Ganho / placa IDs 'tab'.
   2. Selecione '' Ajuste de foco '' e '' Canal A '' à direita na janela.
   3. Selecione '' Ajuste de Ganho '' e '' Selected bem '', e digite '' 75 '' como o '' valor Target ''. Finalmente, escolher bem A24 no layout da placa antes de clicar em '' iniciar o ajuste ''. Uma vez que o ajustamento a efectuar, clique em '' Inicie a medição ''.
   4. Medir a fluorescência do repórter GFP numa máximos de excitação / emissão de 485/520 nm com um ajuste de 10 flashes por poço e uma settlitempo ng de 0,2 seg.
4. Coletar dados de todas as placas examinadas. Nota: As leituras de dados são salvos automaticamente como padrão pelo software de controle leitor de placas.
   1. Veja as leituras, clicando no ícone "Mars" dentro do software de controle para abrir o pacote de análise estatística.
   2. Recuperar dados por "duplo clique" sobre o número da placa de interesse para acessar os dados para análise.

Análise 5. Os dados

1. Avaliar a uniformidade e reprodutibilidade do ensaio usando análise robusta z ', que é a métrica de qualidade mais comuns relatados para telas de alto rendimento. Calcule z robusta "utilizando a fórmula:
   
   Onde MAD (mediana desvio absoluto) é uma estimativa do desvio padrão, p é o controlo positivo (100% de inibição) e o símbolo n representa o controlo negativo (0% de inibição) para a OD ₆₀₀ e GFP valores. Nota: Um ensaio com um valor robusto Z '(calculado para ambos _DO600 e os dados em bruto GFP) maior do que ou igual a 0,5 é considerada como uma excelente ensaio.
2. Calcular a% de inibição de crescimento utilizando a fórmula:
   
   Onde Xi é o valor _{DO600 DO600} iterado de cada poço de amostra. % Inibição _DO600> 0, inibidor de crescimento; % Inibição _DO600 <0, promotor de crescimento.
3. Avaliar a% de inibição do nível intracelular de c-di-GMP utilizando a fórmula (a mudança em unidades de fluorescência arbitrárias de intensidade são corrigidos para a variação da densidade celular):
   
   Onde Xi é o valor _GFP GFP iterado de cada poço de amostra. % Inibição _GFP> 0, inibidor de c-di-GMP; % &# 160; Inibição _GFP <0, promotor de c-di-GMP.
4. Definir um limite para detecção de ocorrências em 3 MAD da mediana (média ± 3 MAD), calculado a partir da amostra bem ler-outs de cada placa, assumindo uma distribuição normal dos pontos de dados. Nota: No entanto, uma ± 50% de inibição de corte podem ser seleccionados para os ensaios de resposta à dose mais reprodutível e preciso, se necessário.

Resultados

A abordagem aqui descrita permite que um único pesquisador para pesquisar eficientemente e com êxito uma média de 3.500 compostos dentro de um período de 48 horas. Uma visão geral do protocolo de rastreio de alto rendimento é ilustrada como um fluxograma na Figura 1. Para o artigo actual, nós rastreada uma biblioteca de compostos regra-de-cinco compatível para potenciais compostos moduladores C-di-GMP com uma concentração final de 600 uM . No entanto, existem muitas drogas disponíveis comercialmente semelhante e não-droga como conjuntos de compostos que podem ser utilizados no ensaio. Estes conjuntos podem ser compostos bactérias focada ou compostos agrupados aleatórios, mas cada biblioteca teria predicado propriedades físico-químicas e características atribuídas, tais como o conjunto exibido aqui, que tinha grupos funcionais polares e vários centros estereogénicos. Neste protocolo, as bactérias foram inoculadas em placa juntamente com compostos, um controlo positivo antibiótico e um veículo DMSOde controlo, de acordo com o esquema mostrado na Figura 2. A Figura 3 representa os resultados da despistagem primária exemplificado por uma placa única biblioteca. OD representativas ₆₀₀ e dados brutos GFP são mostrados na Figura 3A e 3B, respectivamente. Um mapa de calor gradiente de cor, com água quente (vermelho) para esfriar (verde) cores que indicam baixo para alto OD ₆₀₀ valores / GFP, foi aplicado aos valores bem. Os mapas de calor foram gerados em um software de planilha, aplicando um 3-Color escala formatação condicional que vão desde o menor OD ₆₀₀ / GFP ler-out até ao mais alto OD ₆₀₀ / GFP ler-out. Baixa OD ₆₀₀ e GFP valores relativos ao controlo de DMSO negativa corresponde a uma inibição do crescimento e níveis de c-di-GMP, respectivamente, enquanto que os valores elevados relativos ao controlo de DMSO negativa corresponde a uma promoção de crescimento e níveis de c-di-GMP, respectivamente . Os valores de z robusta "para OD ₆₀₀ e ar GFPe calculado de acordo com a fórmula fornecida no protocolo (5.1). Como eles são ambos acima de 0,5 (0,694 e 0,761, respectivamente), a qualidade de ensaio foi considerada robusta e os dados foram posteriormente analisados. A% de inibição de crescimento (DO ₆₀₀₎ e o nível de c-GMP-di intracelular (GFP) são calculados pelas fórmulas fornecidas no protocolo (5.2, 5.3). Os dados representativos são apresentados na Figura 4A e 4B, respectivamente. Um mapa de calor gradiente de cor, com água quente (vermelho) para esfriar (verde) cores que indicam baixa à inibição elevada%, foi aplicado aos valores bem. Um gráfico de dispersão de A% de inibição _{(DO600 / GFP)} a partir de poços individuais com base no ecrã primário está representada na Figura 5A e 5B para a OD ₆₀₀ e os dados de GFP, respectivamente. Uma ± 50% de corte (indicadas com linhas a tracejado) é seleccionado para a detecção de ocorrências. visitas de potenciais com base nesta cut-off são indicadas com pontos vermelhos. Dois tipos de compostos de interesse pode ser de discerned a partir do ensaio. Acessos identificados na Figura 5A são compostos que inibem o crescimento de bactérias, enquanto visitas identificados na Figura 5B são compostos que potencialmente possuem a capacidade de modular os níveis intracelulares de c-di-GMP. Dois compostos foram identificados como visitas representativos para este ensaio. Estes são o composto A, um potencial inibidor de crescimento e o composto B, um potencial inibidor de c-di-GMP. Composto A corresponde a F8 bem nas Figuras 3 e 4 e tinha uma inibição de 72,5% no crescimento. Houve uma inibição correspondente esperada em níveis de di-GMP cíclico. O composto B corresponde à K3 bem nas Figuras 3 e 4 e que teve uma inibição de 61% nos níveis de di-GMP cíclico, sem qualquer alteração no crescimento. Compostos seleccionados de sucesso foram ainda testados por um ensaio de dose-resposta de 10 pontos com uma concentração superior de 2 mM e séries de diluição de duas vezes. Os valores de _IC50 são calculados com base na relação dose-respostacurvas (Figura 6A e B).

Figura 1. Visão geral: Configuração de alta capacidade para a triagem de pequenas moléculas por seu potencial para modular os níveis celulares de c-di-GMP em P. aeruginosa. Esta síntese mostra uma representação passo-a-passo do protocolo utilizado neste ensaio. Uma colônia de bactérias P. aeruginosa é cultivada durante a noite em LB uma cultura de arranque. Utilizando um dispensador de reagente, as células são inoculadas em placas de 384-poços contendo os compostos seleccionados. As placas são incubadas durante 6 horas, após o que os valores de _DO600 e GFP são medidos. Usando esses-outs ler, compostos que afetam os níveis celulares de c-di-GMP pode ser identificado. Por favor clique aqui para ver umaversão maior desta figura.

. Figura 2. Um mapa da placa de 384 poços Usado para a molécula pequena Ensaio de Triagem Os compostos da biblioteca (azul claro) são aliquotadas em poços A1 - P22. O "controlo positivo" (vermelho) que consiste de uma concentração final de 50 ug / sulfato de tobramicina ml é adicionado aos poços A23 - P23 e o "controlo negativo" (verde) contendo uma concentração final de 1% de DMSO é adicionado às cavidades A24 - P24. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Os resultados representativos para uma placa de 384 poços de triagem. Rdados brutos representativa é a OD ₆₀₀ (A) e GFP (B). Um mapa de calor gradiente de cor, com água quente (vermelho: OD ₆₀₀ = 0,65 ou GFP = 250.000) para se refrescar (Verde: OD ₆₀₀ = 0,10 ou GFP = 40.000) cores que indicam baixa para valores elevados, tem sido aplicado aos valores bem. Wells que têm menor OD ₆₀₀ / GFP leituras relativamente ao controlo de DMSO negativo tenderá a ser em vermelho, enquanto poços que têm maior OD leituras ₆₀₀ / GFP em relação ao controlo DMSO tenderá a ser em verde. Por favor clique aqui para ver uma maior versão desta figura.

Figura 4. Resultados representativos para a inibição percentual calculadas para uma placa de 384 poços. Os dados de% de inibição é representada analisados ​​para ambos o OD ₆₀0 (A) e GFP (B) read-outs. Um mapa gradiente de cor de calor, com água quente (vermelho: OD ₆₀₀ = -150% ou GFP = -20%) para se refrescar (Verde: = 100% GFP OD ₆₀₀ = 100% ou) cores indicando baixa para valores elevados de inibição, tem sido aplicado aos valores bem. Pequenas moléculas, o que potencialmente inibir o crescimento e intracelular c-di-GMP tenderá a ser em verde enquanto as pequenas moléculas que potencialmente promover o crescimento e os níveis de c-di-GMP intracelulares tenderá a ser em vermelho. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Gráficos de Dispersão representativos para% de inibição _{(OD600 / GFP)} obtida de cada pequena molécula. Cada pequena molécula testada é representado por um ponto ea distribuição% de inibiçãopara cada um dos OD ₆₀₀ (A) e GFP (B) de leitura saídas é mostrado. A ± 50% de corte é selecionada para a identificação hit. Visitas de potenciais são destacadas em vermelho. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Os resultados representativos de dose - resposta do ensaio. Dois compostos (potencial inibidor de crescimento de um potencial e c-di-GMP inibidor B) identificadas a partir de telas anteriores são ainda testados num ensaio de dose-resposta com 10 pontos, com uma concentração superior de dois mM e séries de diluição de duas vezes. Montagem de uma função logística de quatro parâmetros para os dados resultantes valores de _IC50 de 158 uM e 193 uM, respectivamente. Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A fim de melhorar o tratamento das infecções bacterianas, é claro que é necessária uma melhor compreensão do comportamento bacteriana a nível molecular de regulamentação. O procedimento aqui descrito, será benéfico para microbiologistas, bioquímicos e médicos que querem descobrir moléculas pequenas que têm o potencial para manipular ou interferir com as concentrações celulares de c-di-GMP em bactérias. O método utiliza um GFP Bioreporter recentemente desenvolvidos para monitorizar os níveis celulares de c-di-GMP em P. aeruginosa ^12. Este Bioreporter foi validado e mostrado importante a não afectar o crescimento da estirpe utilizada quando cultivadas em LB 5% em PBS. O uso de uma tela de célula inteira para identificar moléculas pequenas que altera os níveis de c-di-GMP in vivo supera as principais dificuldades da descoberta de fármacos à base de alvo em termos de penetração molécula através das membranas bacterianas, em particular por aqueles de bactérias Gram-negativas . Importante, tele ensaio parece muito robusto como um valor robusto z 'consistentemente acima de 0,5 foi observada em todas as telas até à data. O rastreio utilizando este protocolo irá revelar uma série de pequenas moléculas que inibem e / ou promovem níveis intracelulares de c-di-GMP em P. aeruginosa. Além disso, este ensaio tem o potencial para identificar compostos bactericidas ou bacteriostáticos, resultando numa diminuição na _DO600 de leitura.

Embora não discutidos na secção protocolo, há várias considerações importantes para a preparação do experimento. É vital para ter em mente que o Bioreporter GFP é baseado em um plasmídeo. Embora o plasmídeo repórter é conhecido por ser muito estável em P. aeruginosa, ela pode ser perdida após re-plaqueamento contínua, por conseguinte, a necessidade de utilizar estirpes recentemente plaqueadas a partir de um estoque de -80 ° C glicerol, e verificar expressão de fluorescência é crítica. É também muito importante para manter as condições de crescimento uniformes em toda a telauma vez que quaisquer flutuações nessas condições poderia ter efeitos de arrastamento na tela. Isto incluiria assegurando que os meios e os antibióticos são premade em lote e usado durante todo o curso da tela. As culturas de bactérias não cresce (com base na DO ₆₀₀ read-outs) de um modo uniforme é um problema comum para a maioria das telas de elevado rendimento desta natureza. Isto pode ser devido ao efeito borda ou dispensar uma cultura bacteriana não homogénea nas placas. Para o primeiro, certificando-se de uma vedação estanque ao gás-permeável é usada durante a incubação é vital. Enquanto que para esta última, o tubo de priming manipulador de líquidos com um volume de cultura, pelo menos, três vezes recomenda-se o volume morto do próprio tubo. É crucial para manter o agitador magnético a uma velocidade mínima, durante a distribuição. Enquanto monitoriza e armazenamento das placas de 384 pos para crescimento consistente ao longo das experiências é primordial, uma situação é para evitar o empilhamento de placas durante a incubação, uma vez que pode causar unqueria gradientes de oxigénio conduzem a uma inclinação no padrão de crescimento. É também importante para garantir que o veículo DMSO utilizado como controlo negativo não está a afectar negativamente o crescimento da estirpe de interesse. Muitos destes problemas associados com o crescimento pode ser evitada através da realização de um ecrã de simulação com a estirpe bacteriana de interesse antes da triagem. A interpretação dos dados também merece consideração dado que os resultados de inibição de c-di-GMP são calculados pela mudança em unidades de fluorescência arbitrárias de intensidade que deve ser corrigida para a mudança na densidade de células. Com isto em mente diferentes fórmulas matemáticas para avaliar a saída de dados a partir destas experiências, também deve ser considerado. Por exemplo, um composto pode aparecer como um inibidor de c-di-GMP mas, na verdade, ser um inibidor do crescimento ou vice-versa, o que requer interpretação prudente de acessos identificados.

Existem várias desvantagens e limitações que devem ser consideradas durante o desenvolvimento e execução destecélula baseada em high-throughput tela. Por exemplo, as funções de bio-repórter sobre uma medida indirecta de níveis de c-di-GMP celulares utilizando uma sonda fluorescente, cujas propriedades de detecção poderia ser potencialmente afectados por pequenas moléculas utilizadas numa tela. Um problema tangencial é o facto de o ensaio baseado em células não dá nenhuma informação sobre o mecanismo subjacente a alterações nos níveis de intracelular de c-di-GMP. Por isso, as observações importantes a partir de experiências deve ser confirmada utilizando uma abordagem de espectrometria líquida de alta eficiência A cromatografia em massa, que é considerada o método "gold standard" para medir as flutuações intracelulares de c-di-GMP em bactérias. Além disso, o nosso procedimento só pode proporcionar informação sobre o comportamento de bactérias cultivadas in vitro, como células bacterianas cultivadas no contexto do hospedeiro (in vivo) modificar rapidamente as suas actividades devido a este ambiente. Além disso, o processo de utilização de um Bioreporter GFP significa que a tela não tomarem conta o estado fisiológico das células bacterianas. No entanto, o protocolo pode ser adaptado para monitorização microscópica dos poços individuais durante o curso da tela.

Mesmo com estas considerações e limitações, este ensaio de elevado débito ainda é uma tela robusta para as pequenas moléculas capazes de interferir com os níveis de c-di-GMP intracelulares. Uma vez que muitas espécies microbianas incluindo muitos agentes patogénicos bacterianos foram estudadas a fim de caracterizar a modulação dos níveis de c-di-GMP intracelulares, o nosso protocolo pode ser aplicado a espécies bacterianas diferentes e expandiu-se para o estudo de modelos mais complexos multispecies bactérias. O ensaio pode ser facilmente optimizado para as outras espécies bacterianas mudando as condições de crescimento utilizado, ou pode ser adaptado para ler outras saídas usando diferentes bioreporters. Diferentes tempos de incubação pode ser aplicada, dependendo da fase de crescimento de interesse. No entanto, quando a escala para cima ou para aumentar through-put, é importan t ter em mente que as bactérias ainda estará crescendo durante as preparações de pratos, e medições de leitura. Portanto, recomenda-se para a tela um máximo de 15 placas de cada vez usando esse protocolo. Além disso, usando placas com mais de 384 poços podem não permitir o crescimento uniforme, exigindo uma maior optimização. Quando da redução do número de placas, que pode ser mais apropriado para inocular manualmente usando uma pipeta electrónico em vez de um robot de manuseamento de líquidos. É claro que este protocolo pode ser utilizado para investigar as moléculas pequenas que se dispersam biofilmes, dado que os compostos anti-biofilme interferem com a sinalização de c-di-GMP. O protocolo também poderia ser redesenhada para compreender vários aspectos da fisiologia bacteriana. Dado que a sinalização de c-di-GMP é predominante na maioria das bactérias, através do estudo dos fisiologias desses organismos utilizando este protocolo podemos identificar diferentes estímulos químicos para determinar se ou não os seus mecanismos de trabalho requerem sinalização de c-di-GMP.

_content "> Em resumo, a robustez e a versatilidade da abordagem apresentada neste protocolo irá auxiliar a identificação de moduladores químicos de c-di-GMP sinalização em muitos sistemas biológicos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysogeny Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-1KG
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-1KG
Lysogeny Broth with Agar (Lennox)	Sigma Aldrich	L2897-1KG
Ampicillin sodium	Sigma Aldrich	A0166-25G
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516-1L
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4	Life technologies	10010-056
Tobramycin sulfate	Sigma Aldrich	T1783-100MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	276855-250ML
Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer	Thermoscientific	840-208100
2 mm gap electroporator cuvette	Bio-Rad	1652092
BioRad GenePulser XCell electroporator	Bio-Rad	1652662
Leica Fluorescent Stereomicroscope	Leica Microsystems	MZ16FA
BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilize by autoclaving before use)	Sigma Aldrich	Z328952-10EA
384-well, white-walled, clear-bottom plates	Greiner	781098
Multidrop Combi reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300
Multidrop Combi tubing	Thermo Scientific	24073290
VIAFLO II 16-channel electronic pipette	Integra Biosciences	4642
100 ml sterile disposable reagent reservoirs	Fisher Scientific	12399175
AeraSeal air-permeable membranes	Sigma Aldrich	MKBQ1886
Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13)	BMG Labtech	Pherastar FS