نهج جديد للتسجيل المتزامن لنشاط العصب متعاطفة مع الكلي وضغط الدم مع التسريب الوريدي في واعية، الفئران غير المقيد.

Summary

معرض تخديره من الفئران غير الفسيولوجية ضغط الدم النظامية، مما يحول دون تقييم حقيقي للهجة اللاإرادي ونظرا للعلاقة الحميمة بين ضغط الدم والجهاز العصبي اللاإرادي. وهكذا يرد طريقة جديدة لنشاط العصب متعاطفة مع الكلي في وقت واحد تسجيل وضغط الدم مع التسريب الوريدي في الفئران واعية.

Abstract

الأعصاب متعاطفة الكلوي تساهم الظواهر الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية على حد سواء. تقييم نشاط العصب متعاطفة الكلوي (رسنا) ذو أهمية كبيرة في العديد من مجالات البحوث مثل مرض الكلي المزمن وارتفاع ضغط الدم، وقصور القلب، والسكري والسمنة. وهكذا لا لبس فيه تقييم لدور النظام العصبي الودي أمر حتمي للتفسير السليم للنتائج التجريبية وفهم عمليات المرض. وقد تم قياس رسنا تقليديا في تخديره من القوارض، بما في ذلك الفئران. ومع ذلك، الفئران عادة ما يحمل ضغط الدم الجهازية منخفضة جداً وعدم الاستقرار الفسيولوجية لعدة ساعات أثناء التخدير والجراحة. هو مرتبك تفسير معنى رسنا بهذه الدولة غير الفيزيولوجية، ونظرا للعلاقة الحميمة بين لهجة متعاطفة مع الجهاز العصبي ومركز القلب والأوعية الدموية. لمعالجة هذا القيد من النهج التقليدية، قمنا بتطوير أسلوب جديد لقياس رسنا في الفئران واعية، وتتحرك بحرية. تم تجهيزها الفئران مزمنة مع راديو-تيليميتيرس للرصد المتواصل لضغط الدم، فضلا عن قسطرة الحقن الوريدي جوجولار أ والقطب القطبين مصممة خصيصا للتسجيل المباشر رسنا. وعقب فترة استرداد 48-72 ساعة، معدل البقاء على قيد الحياة 100% وتصرف جميع الفئران عادة. في هذه النقطة الزمنية، سجلت رسنا بنجاح في 80 في المائة فئران، مع إشارات قابلة للحياة الحصول على ما يصل إلى 4 و 5 أيام ما بعد الجراحة في 70% و 50% من الفئران، على التوالي. سجلت فسيولوجية الدم الضغوط في جميع الفئران (ملم زئبق 116±2; n = 10). زيادة رسنا مسجل مع الأكل والاستمالة، كما الراسخة في الأدب. وعلاوة على ذلك، تم التحقق من صحة رسنا بالحصار جانجليونيك والتحوير لضغط الدم مع وكلاء الدوائية. ويرد هنا، طريقة فعالة وقابلة للإدارة لتسجيل واضح من رسنا في الفئران واعية، وتتحرك بحرية.

Introduction

الاهتمام باستخدام الفئران في العديد من مجالات البحوث الطبية الحيوية يواصل توسيع مع تطوير نماذج المهندسة وراثيا لا حصر لها. للجزء الأكبر، التقدم التقني قد تواكب الزيادة في استخدام الفئران في علم وظائف الأعضاء، وهناك الآن مجموعة رائعة من الأجهزة المنمنمة التي وضعت خصيصا لقياس البارامترات الفيزيولوجية الهامة في الفئران. على الرغم من توجيه أجهزة القياس البعدي لقياس اللاإرادي لهجة العصبية في الفئران واعية كانت متاحة لأكثر من عقد، والأجهزة المنمنمة لتقييم نشاط العصبية في الفئران واعية غير متوفرة حاليا. المحققون عادة الالتفاف حول هذا القيد بتقييم إسهام العصبي المستقل بطرق غير مباشرة (أي الكاتيشولامين البلازما أو البول، الحصار اللاإرادي الدوائية، والتحليل الطيفي لأنماط من الدم معدل الضغط/القلب)¹.

في حين توفر هذه النهج معلومات قيمة، والنتيجة صورة عالمية للهجة اللاإرادي عموما، بدلاً من الكشف عن مساهمة متميزة للسكان المعزولين للأعصاب للظاهرة قيد التحقيق. بدلاً من ذلك، تم تنفيذ التسجيل المباشر للنشاط من أعصاب محددة في تخديره من الفئران، التي يشكل عدد وافر من الشواغل. من الصعب جداً للحفاظ على استقرار ضغط الدم ضمن نطاق الفسيولوجية في ماوس أنيسثيتيزيد لعدة ساعات بعد الجراحة. وفي الواقع، في هذه الأنواع من التجارب، ضغط الدم غالباً ما غير المنظم أو عرضت على مستويات منخفضة للغاية (أي 60-80 مم زئبق مقابل > 100mmHg في ماوس واعية)². هشاشة الأوعية الدموية معروضة في إعداد ماوس تخديره وكثيراً ما يحول دون تقييم حقيقي لنشاط العصب اللاإرادي، نظراً للعلاقة كوديبيندينت بين ضغط الدم ولهجة متعاطفة مع^{3، 4}.

لمعالجة هذا القيد، أسلوب جديد للتسجيل المباشر لنشاط العصب متعاطفة الكلوي (رسنا) في واعية، وضعت الفئران غير المقيد، دون عائق داخل اقفاصها المنزل. يتم وصف كل النهج الجراحية والتجريبية لتنفيذ هذه التقنية بنجاح بالتفصيل. يمكن إعداد هذا المحقق تسجيل الضغط الشرياني عن طريق راديوتيليميتري بالإضافة إلى رسنا، مع القدرة على إضافة لبث وكلاء للفائدة عن طريق الوريد دون الإخلال بالماوس في وقت واحد.

أربع وعشرين ساعة بعد الجراحة، الفئران تتصرف بشكل طبيعي ولا يحمل علامات الألم أو المعاناة. ويجوز أن تبدأ التسجيلات التجريبية ثم 48 إلى 72 ساعة بعد عملية جراحية حين تقع الماوس بشكل مريح في قفصة المنزلية بالوصول غير المقيد إلى الغذاء والماء والإثراء البيئي. تعرض آثار رسنا واضحة وأظهرت الردود المميزة من هذا السكان العصب للحركات البدنية العادية للحيوان (مثل الأكل والاستمالة) بالإضافة إلى تعديل الدوائية لضغط الدم النظامية. كذلك صحة نوعية وخصوصية إشارة رسنا بالحصار جانجليونيك. وتشمل هذه المخطوطة تكملة السمعي البصري لوصف نشرت في البداية لهذا الأسلوب⁵.

Protocol

كافة الإجراءات التجريبية وفقا "المعاهد الوطنية للصحة دليل" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وأقرتها لجنة الاستخدام من المركز الطبي في جامعة ميسيسيبي ورعاية الحيوان المؤسسية.

1-الحيوانات والإسكان

1. بيت الفئران (24-35 غ) لدى وصوله إلى مرفق الحيوانات المختبرية المؤسسية.
2. توفر الفئران تشاو القوارض القياسية وماء الصنبور ad متواصلة في جميع مراحل البروتوكول التجريبي في بيئة تسيطر عليها درجة الحرارة والرطوبة.

2-تخصيص تلفيق مسرى رسنا القابلة للغرس

ملاحظة: بناء مسرى رسنا القابلة للغرس على الأقل بضعة أيام قبل العملية الجراحية المقررة لاستيعاب وقت المعالجة والتعقيم (الموصوفة أدناه).

1. قطع ثلاثة أطوال متساوية من الفولاذ المقاوم للصدأ معزول الأسلاك متعددة-الذين تقطعت بهم السبل، 250 ملم (قطر السلك مم 0.0254 العارية، 0.14 ملم المغلفة). استخدام شفرة المبضع (يفضل أن يكون #11) إلى تجريد حوالي 15 ملم المواد العازلة للكشف عن المعادن الأساسية من طرف واحد لكل من أطوال الأسلاك.
   1. لحام موصل واحد دبوس ذكور (النحاس الأواني المطلية بالذهب) إلى نهاية البارد سوى اثنين من الأسلاك لإنشاء يؤدي ثنائي القطب الكهربائي (الشكل 1A). إجازة نهاية الثالثة طول الأسلاك العارية. هذا وسوف تعمل كالسلك الأرض.
   2. كشف قصيرة (~2.0-2.5 سم) قطعة من أنابيب انكماش قطرها 1.6 ملم على دبوس موصل والأسلاك تغطي كامل المشترك ملحوم حديثا بين موصل سلك ورقم التعريف الشخصي.
      ملاحظة: يجب أن تظل مكشوفة غيض الموصل pin الذي سوف يكون موصول هيدستاجي مكبر للصوت.
   3. أمسك السلك أعلاه بندقية حرارة مع زوج من كماشة صغيرة أو هيموستاتس إلى تقليص أنابيب حساسة للحرارة وعزل الاتصال بين الموصل pin والسلك الكهربائي. كرر هذه العملية لموصل سلك/دبوس الثاني.
2. قص بطول 200 ملم من أنابيب البولي إيثيلين (PE 90؛ والقطر الداخلي 0.86 مم، القطر الخارجي 1.27 ملم). تجميع الأسلاك الثلاثة (اثنان يؤدي + سلك الأرضي) وإدخال نهايات متأثر في الأنبوب PE 90، خيوط لهم معا عن طريق إلى النهاية المفتوحة للأنابيب (الشكل 1B).
   ملاحظة: 90 PE أنابيب مهام غمد المجموعة وحماية مسرى يؤدي وسلك الأرضي.
   1. تحديد السلك الأرض وتسحبه عن طريق غمد PE 90 قليلاً إضافية لتمييزه عن العملاء المتوقعين ثنائي القطب الكهربائي.

3-بناء طرف القطب

1. تصور نهايات الأسلاك الكهربائي متأثر مجهر تشريح. الموضوع ينتهي فضفاض ثلاثة القطب من خلال 5 مم-قطعة طويلة أصغر الأنابيب المصنوعة من البولي إيثيلين (PE 10، القطر الداخلي 0.28 ملم، القطر الخارجي مم 0.61) لربط الأسلاك الكهربائي معا.
   1. الخيط قطعة 1.5 مم من هذه الأنابيب PE 10 على الأسلاك الثلاثة القطب. النهوض بهذه الأنابيب لبقية 2.0 ملم بعيداً عن قطعة الأولية 5 مم من PE 10.
   2. الموضوع ثاني قطعة 1.5 مم من أنابيب PE 10 على النصائح من العملاء المتوقعين القطبين القطب اثنين لتغطية وعزل النصائح وفصلها عن الأسلاك الأرضية (الشكل 1).
2. تقليم أي الطول الزائد للأسلاك مع المقص.
3. الصق القطع الفردية من الأنابيب PE 10 إلى الأسلاك الكهربائي مع قطره صغيرة من الغراء السائل cyanoacrylate الصيغة. ضع إبرة قياس 25 يتثلم في نهاية أنبوب الغراء لتحسين المراقبة والحد من الانسكاب.
   1. ضع طرف الإبرة على مفترق الطرق بين PE 10 والأسلاك، ثم الاستغناء عن قطره صغيرة من الغراء ووضع تصور للغراء طلاء داخل الأنبوب PE.
   2. تسمح الغراء تماما علاج بين عشية وضحاها.

4-غرامة إعداد طرف القطب للتسجيل

1. قطاع الطلاء العازلة من نصائح القطب الثنائي القطب وغيض من السلك الأرض مع شفرة المبضع #11. عدم الإزعاج أو الأضرار الكامنة وراء أسلاك تقطعت بهم السبل متعددة كهذا سوف يؤثر جودة الإشارة رسنا.
2. قبضة مسرى شيدت بين 5.0 ملم والمراسي 1.5 ملم PE 10 مع منحنى ملقط والانحناء الأسلاك لتشكل زاوية 90 درجة (الشكل 1).
   ملاحظة: ينبغي أن موقف هذه المناورة يؤدي ثنائي القطب الكهربائي أعلاه السلك الأرض، في وضع أمثل لمهد حزمة الأعصاب.

5-بناء قاعدة التمثال ترسيخ

1. بناء قاعدة التمثال لتحقيق الاستقرار الكهربائي يؤدي إلى منطقة منتصف المنكب الماوس عند اكستيريوريزيشن بقطع قطعة 3 سم من أنابيب البولي إيثيلين (القطر الداخلي 2.70 ملم، القطر الخارجي 4.00 ملم).
   1. قبضة الأنابيب مع الملقط وتذوب نهاية واحدة على بندقية حرارة. اضغط end ساخنة من أنابيب خط عمودي على سطح معدني بارد لإنشاء سلسلة من التلال مدورة أو "الحافة".
   2. مؤشر الترابط هذا التمثال على مسرى المركبة، مثل أن يشير الشفة تجاه طرف القطب.
      ملاحظة: التركيبة من غمد PE 90 ورمي ستحمي يؤدي القطب اكستيريوريزيد مرة من الحيوان.

6-تعقيم مسرى القابلة للغرس المكتملة

1. حزمة مسرى المنجزة فردياً في أكياس التعقيم والأوزون تعقيم (تسو₃) قبل غرس.
   ملاحظة: التشاور مع مرفق تعقيم المستشفى المحلي فيما يتعلق بنوع معين من التعقيم الحقيبة وإجراء كهذا يختلف بين المؤسسات.

7-التخدير والتحضير لعملية جراحية

1. إدارة التسكين 20 دقيقة قبل بدء الجراحة (ميلوكسيكام 2 مغ/كغ، الليبي). ضع الماوس في دائرة التعريفي يملؤه الأكسجين الطبي الصف 100%. ضبط إعدادات المبخر لزيادة النسبة المئوية ل isoflurane مخدر في زيادات بمقدار 0.5 لتصل إلى 4%. تقييم الطائرة الجراحية بتقييم استجابة منعكس لضغط لطيف تطبيقه على أصابع القدم أو منصات القدم للصدارة وهند الأطراف فضلا عن تباطؤ في معدل التنفس.
   1. نقل الحيوانات إلى طاولة العمليات الجراحية والحفاظ على التخدير مع isoflurane 1.5 إلى 2 في المائة عن طريق نوسيكوني حالما وصلت الطائرة الجراحية ولم يعد يسلك منعكس تو-رشة. كرر الرد تو-رشة بشكل دوري وتقييم معدل التنفس طوال الإجراءات الجراحية بأكملها. تطبيق مرهم العيون إلى العيون لمنع جفاف.
   2. الحفاظ على درجة حرارة الجسم الطبيعية للحيوان في جميع الأوقات مع منصات مملوءة هلام الحرارة متحاور والجدول المقابل الجراحية. تخزين منصات متحاور في حمام مائي 37 درجة مئوية واستبدال منصات غالباً حسب الحاجة أثناء الجراحة للحفاظ على درجة حرارة الجسم الفسيولوجية.
   3. إدارة جليكوبيرولاتي (50-70 ميكروغرام/كغ، تحت الجلد (الليبي)) لمنع الإفراط في إنتاج من إفرازات مجرى الهواء فور التعريفي للتخدير. إدارة هذه الجرعة من جليكوبيرولاتي مرة ثانية في منتصف العملية الجراحية (9.1 الخطوة).
   4. إجراء جميع العمليات الجراحية تحت ظروف معقمة. ضمان جميع الأدوات الجراحية قد يعقم قبل الجراحة المجدولة. تنظيف الحقل الجراحي كما هو موضح أدناه (7.2.1) والحفاظ على العقم طوال فترة الإجراءات.
      1. ارتداء قناع لوجه وعزل يعقم بثوب وقفازات معقمة، وتستخدم مرة واحدة. قم بتنظيف جميع المعدات الكبيرة مثل مصباح gooseneck، تشريح النطاق والجدول الجراحية مع الإيثانول 70%. بشكل دوري أثناء الإجراء، تطبيق الإيثانول 70% للقفازات الجراحية لضمان العقم.
2. إزالة الشعر من الجناح الأيسر للحيوان ومنطقة الرقبة البطني ومنطقة ميدسكابولار الظهرية مع مقص الشعر الحيوانات الصغيرة تليها كريم مزيل الشعر (صيغة حساسية الجلد).
   1. تطهير الجلد من هذين الحقلين الجراحية مع 3 تطبيقات لحل التطهير الجراحي بالتناوب (10 ٪ اليود البوفيدون) و 70% إيثانول. إعداد الميدان الجراحية مع تطبيق نهائي لحل التطهير الجراحي.

8-العمليات الجراحية زرع مسرى رسنا

1. ضع الماوس على الجانب الأيمن مع نهاية روسترال مشيراً إلى اليسار للجراح، وفضح الجناح الأيسر للحيوان. جعل شق 5 ملم في جلد منطقة ميدسكابولار مشرط (رقم 11).
   ملاحظة: هذا هو الموقع الذي سوف اكستيريوريزيد رسنا القطب العملاء المتوقعين.
   1. جعل شق ثان (< 20 مم) في الجلد تغمر الجناح الأيسر، عمودي للعمود الفقري ووالذيليه إلى القفص الصدري 2 مم. نفق فولاذ المقاوم للصدأ ز 13 إبرة تحت الجلد من هذا الشق للشق في موقع خروج الظهرية.
      ملاحظة: ملف حواف حادة من الإبرة لمغادرة على نحو سلس، غير المتطورة.
   2. تمر الإبرة ز 13 مسرى رسنا القابلة للغرس معقمة (الخطوات 2-6). سحب الإبرة ز 13 مرة أخرى ترك تلميح القطب الكذب في عضلة البطن من الجهة اليسرى. ترك شريحة من العملاء المتوقعين القطب الكذب تحت الجلد، وترك أطوال المتبقية الخارجة من شق الظهرية.
2. ضع طرف القطب إلى الجانب. إجراء شق في عضلة البطن مباشرة الكامنة وراء شق الجلد في 8.1.1. فصل الدهون والنسيج الضام على طول العضلات مرة أخرى مع قضيب القطن ذات الرؤوس الصغيرة تطبيق لفضح الكلي اليسرى.
   1. فتح الحقل الجراحي مع مايكرو-الكامشات وسحب الكلي. القيام به لا لتمتد الباقة neurovascular الكلي، الذي لا رجعة فيه تلف الأعصاب الكلوية ويحول دون تسجيل إشارة رسنا قابلة للحياة.
      ملاحظة: يمكن أن تصاغ الصلب الصغيرة-الكامشات من قصاصة ورق قياسية وطول من الحرير 4-0. ضمان هذه الكامشات يتم تعقيمها أيضا مع الأدوات الجراحية حفاظا على الأسلوب العقيم.
3. تصور حزمة neurovascular الكلي مع المعونة من قوة عالية تشريح مجهر. تحديد حزمة العصب الكلوي، الذي يمتد عادة (ولكن ليس دائماً) إلى جانب الشريان الكلوي والوريد. تشريح العصب حزمة من الأنسجة المحيطة بالملقط غرامة، على التوالي.
   ملاحظة: حزمة العصب الكلوي تظهر معتمة، مع "حبل مثل" تعكس مظهر، فريدة من نوعها مقارنة بالأوعية اللمفاوية، التي تبدو واضحة.
   1. معالجة حزمة الأعصاب بأقل قدر ممكن. لا تعمل باللمس، وتمتد أو التقاط الحزمة العصبية في أي وقت. عدم تعطيل غرامة الأوعية الدموية تمد العصب، أو القناة اللمفاوية الكلوية لأن هذا سوف يعرض للخطر بقاء العصبي وتنتج تجميع السوائل الليمفاوية المستمر حول العصب/مسرى، التي سوف تعرقل أو طمس تماما الإشارة العصبية.
   2. إجازة حزمة الأعصاب الكلوية سليمة، مما سيساعد على الحفاظ على الاستمرار في الأجل الطويل للعصب، فضلا عن البقاء على اتصال مستقرة بين العصب ومسرى (أي قد كشف عصب مقطعة الخروج من أقطاب مع الوقت وحركات الجسم الطبيعية).
4. إدخال تلميح القطب رسنا في البطن. تعديل موقفها أن السلك نصيحة والأرض ثنائي القطب الكهربائي متعامدة حزمة neurovascular الكلوي. كذلك ضبط موضع القطب أن السلك الأرض لديها اتصالات جيدة مع الأنسجة الكامنة ومسرى لا ضغط الأوعية الكلوية، المساس بالتداول الكلي (الشكل 1).
5. رفع الحزمة العصبية الكلوية مع الملقط الزاوية. كشف طرف القطب تحت العصب، ترك العصب في اتصال مباشر مع كل الأسلاك.
   1. تنزلق قطعة صغيرة من الفيلم البارافين بين الأسلاك العصبية/القطبين والسلك الثالث (الأرض) (الشكل 1).
      ملاحظة: تعقيم نقع الفيلم البارافين في الإيثانول 70% لمدة 24 ساعة والشطف في المحلول الملحي الفيزيولوجي معقمة قبل غرس.
   2. إزالة أي الدم أو السائل من حول العصب/مسرى مع ماصة صغيرة سبيرز كأي سائل غادر حول العصب أو أسلاك الكهربائي سوف تعرقل أو إطفاء الإشارة العصبية.
   3. اختبار جودة الإشارة رسنا بسرعة إذا رغبت (الإعداد المبينة أدناه).
      ملاحظة: يجب أن يتم هذا بسرعة التعرض للهواء سوف الجاف للأعصاب وخرق قدرته على البقاء.
   4. تطبيق الاستومر سيليكون المكون الثاني الوحدة العصبية/القطب، ضمان أن مجمعات سيليكون تحت وحول العصب لتوفير العزل الكهربائية كاملة (أي ليس مجرد قطره على رأس العصب).
      ملاحظة: تأكد من نصائح القطب أيضا المغلفة في السيليكون. السلك الأرض ينبغي أن تظل على اتصال بالانسجة الكامنة، وهكذا لا تحتاج الاستومر إلى تجمع تحت هذا السلك. تجنب تطبيق مبلغ كبير دون داع من الاستومر السيليكون، كهذا يمكن أن يحتمل أن تعرقل تدفق الدم الكلوي، أو تصبح فكها مع حركات الجسم الطبيعية مع مرور الوقت.
   5. يسمح 1-2 دقيقة الاستومر السيليكون لعلاج تماما، ثم بعناية مع الملقط رفع الحواف الخارجية سيليكون "غلوب" وتنطبق على كمية صغيرة من السائل اللاصق الجراحي الصيغة.
      ملاحظة: الحرص على عدم تطبيق كمية زائدة من هذا الغراء، كما أنه قد يضعف الدورة الدموية أو ينتشر إلى العصب وخرق قدرته على البقاء.
6. إغلاق شق البطن مع خيوط متقطع، قابلة للامتصاص (5-0). إغلاق الجلد السطحية بطريقة مماثلة مع مواد خياطة الجروح نفسها.

9-غرس راديوتيليميتير ضغط الدم

1. قم بتغيير موضع الماوس على ظهرها، مع نهاية روسترال مشيراً نحو الجراح. ضبط نوسيكوني التخدير حسب الحاجة. إدارة الجرعة الثانية من جليكوبيرولاتي عند هذه النقطة (انظر 7.1.3).
2. جعل خط الوسط شق في الجلد في منطقة الرقبة مع مشرط (رقم 11)، بدءاً من أسفل الفك السفلي للحيوان وتوسيع فقط أعلاه القفص الصدري. فصل الأنسجة الغدية لفضح عضلات الرقبة الكامنة. كشف الشريان السباتي المشترك الأيسر وفصل من الأنسجة المحيطة.
   ملاحظة: رعاية كبيرة لا إتلاف العصب المبهم وهذا يمكن أن يؤدي إلى زيادة في معدل الوفيات بعد الجراحة.
   1. تمرير ثلاث قطع من المادة 6-0 خياطة الحرير تحت الشريان. ضع خياطة واحدة روسترالي إلى أقصى حد ممكن، والتعادل على أوككلودي السفينة. وضع خياطة ثانية في منتصف الطريق على طول السفينة وربطه عنق فضفاضة. وضع خياطة الماضي كاودالي ممكن وربطه عنق فضفاضة.
   2. التراجع عن خياطة روسترال معظم وآمنة إلى نوسيكوني مع قطعة صغيرة من الشريط الحبل السري. التراجع عن خياطة والذيلية معظم مع الملقط الصغير-البعوض لتقييد تدفق الدم في السفينة.
   3. جعل شق صغير في جدار السفينة مع مقص الربيع الجميلة روسترالي قدر الإمكان. إدخال قسطرة راديوتيليميتير ضغط الدم الماوس في السفينة ومقدماً لخياطة والذيلية.
      1. التعادل خياطة الأوسط مؤقتاً لتثبيت القسطرة، والإفراج عن سحب والذيلية والنهوض بالقسطرة 10 مم. خياطة ربطه عنق حول القسطرة في مكان أمن.
   4. نفق للجسم تيليميتير لجيب تحت الجلد على طول الجناح الأيمن.

10-غرس واكستيريوريزيشن من القسطرة الوريدية جوجولار

1. استخدم قضيب تطبيق صغير القطن ذات الرؤوس لفضح الحق حبل الوريد. حول السفينة، تمرير قطعتين من مواد خياطة الحرير 6-0.
   1. وضع خياطة واحدة قدر روسترالي قدر الإمكان، والتعادل أوككلودي السفينة. وضع خياطة الثانية كودالي ممكن وتتراجع برفق لوقف تدفق الدم في السفينة.
   2. استخدام مقص الربيع الجميلة جعل شق صغير في جدار السفينة قريبة من خياطة روسترال قدر الإمكان. كاثيتيريزي في الوريد مع أنابيب تمتد الحرارة (نقلت 1.02 مم، امتدت إلى OD 0.64 ملم)، وهو ما قبل مليئة بالمحلول الملحي الفيزيولوجي معقمة.
      ملاحظة: تأكد من قطع طرف القسطرة مع مشرط لإنتاج المجسم مشطوف الحواف مدورة لمنع ثقب السفينة. تحديد حجم السائل في القسطرة (الفضاء الميت) للرجوع إليها (انظر الخطوات 14.4-14.6 أدناه).
      1. تقدم القسطرة ~ 8 ملم في هذا السياق. تأمين القسطرة بربط خيوط الحرير حول السفينة والقسطرة، فضلا عن تطبيق قطره صغيرة من هلام cyanoacrylate الصيغة الغراء.
2. ضع الماوس على جانبها الأيسر. نفق القسطرة الوريدية من الرقبة للخروج في المنطقة الظهرية ميدسكابولار باستخدام إبرة فولاذ المقاوم للصدأ ز 13.
3. تغيير موضع الماوس على ظهره. إغلاق شق الرقبة مع خيوط متقطع.
4. وضع الحيوان في موقف المعرضة. مؤشر ترابط زر صغير تحت الجلد على القسطرة الوريدية. تأمين الزر تحت الجلد بخياطة الجروح. الموضوع ربيع الفولاذ المقاوم للصدأ المقابلة عبر القسطرة الوريدية وتأمينه إلى زر الجلد لحماية القسطرة.

11-تأمين القطب اكستيريوريزيد يؤدي

1. تأمين حماية التمثال البولي إثيلين الكهربائي يؤدي إلى العضلات الأساسية مع لاصق الأنسجة. خياطة الجلد السطحية على شفة لمزيد من الدعم.

12-بعد الجراحة الانتعاش

1. تطبيق مرهم مضاد حيوي لجميع شقوق.
2. إدارة دواء مسكن. إدارة جرعة إضافية من دواء مسكن حسب الحاجة أثناء فترة الاسترداد إذا كان الحيوان تظهر علامات الألم أو المعاناة.
3. ضع الماوس في قفص ايضية مبطنة برقائق الخشب الفراش ومنشفة ورقية لاسترداد. مراقبة الحيوان بشكل مستمر ولا تترك غير المراقب حتى يستعيد وعيه ويمكن الحفاظ على ريكومبينسي القصية. إدخال الإثراء البيئي والأغذية والمياه (ad libitum) عند هذه النقطة.
4. ويؤدي اللولب الكهربائي خارج القفص حتى وقت التجربة.
5. ضع القفص على منصة حرارة دافئة خلال ال 24 ساعة الأولى من الانتعاش. قم بتوصيل الربيع الفولاذ المقاوم للصدأ والقسطرة الوريدية نظام قطب/ضخ للتسريب المستمر من المحلول الملحي الفسيولوجي أثناء فترة الاسترداد (0.5 مل/ساعة).
6. ضمان بقاء الحيوان مساكن منفردة في قفص مخصص نظراً لطبيعة القسطرة اكستيريوريزيد ويؤدي القطب.

13-التجريبية الإعداد لتسجيل ضغط الدم ورسنا

1. تجهيز فولاذ المقاوم للصدأ أعلى جدول المضادة اهتزاز مع قفص فاراداي بسيطة.
   ملاحظة: يمكن بناء قفص فاراداي هذا مع شبكة شاشة الإطار والألومنيوم خشبي. كهربائياً أرضية القفص الجدول/فاراداي للقضاء على أي الضوضاء الكهربائية.
2. ضع جهاز استقبال راديوتيليميتري ضغط الدم داخل قفص فاراداي.
3. الاتصال المتلقي راديوتيليميتري بمحول الإخراج الضغط المرتبطة بها. قم بتوصيل هذا المحول إلى نظام الحصول على بيانات لسجل ضغط الدم على الإنترنت.
4. لحام موصلات دبوس الإناث اثنين التي مجانية على موصلات دبوس الذكور قطب كهربائي (النحاس الأواني المطلية بالذهب) إلى نهايات البلاستيكية المزدوجة، محمية عزل الكابل. جندي طرفي نقيض من هذه الكابلات المزدوجة للموز المقابس. قم بتوصيل المقابس الموز هيدستاجي بريامبليفيكيشن (10 X التضخيم).
5. قم بتوصيل هذا المضخم مكبر للصوت تفاضلية. ضبط الإعدادات لتضخيم إشارة العصب x10، 000. ضبط إعدادات عامل التصفية على النحو التالي: قص منخفض، 100 هرتز؛ قص عالية، 1000 هرتز.
6. ضع القفص الصفحة الرئيسية التي تحتوي على الماوس على جهاز الاستقبال راديوتيليميتري تقع داخل قفص فاراداي 48 إلى 72 ساعة بعد الجراحة. قم بتشغيل المسبار راديوتيليميتري لتسجيل إشارات ضغط الدم.
   ملاحظة: التأقلم الماوس بوضع القفص المنزل في الإعداد على مدى أسبوع واحد قبل الجراحة الأمثل.
7. تفك يؤدي الكهربائي وقم بتوصيل موصلات دبوس القطبين القطب المقابل موصلات دبوس الإناث الموصوفة أعلاه (13.4) لبدء تسجيل رسنا.
8. عرض، وفي نفس الوقت تسجيل إشارات ضغط الدم على الإنترنت مع جهاز كمبيوتر، بينما غرس المحلول الملحي الفيزيولوجي أو الحل للفائدة. سجل البيانات بمعدل الحد أدنى من عينات 2500 في الثانية الواحدة.

14-نموذج البروتوكول التجريبي والتحقق من إشارة رسنا

1. ضمان الفئران مريحة في قفص المنزل بهم، غير المقيد مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء. اتبع المبادئ التوجيهية مؤسسات الرعاية الحيوانية للتحقق من المظهر الطبيعي والسلوك.
2. بيت الفئران في نفس درجة الحرارة والرطوبة الخاضعة للغرفة في رسنا التي سيجري تسجيل. ضمان استمرار التسريب الوريدي كما هو موضح أعلاه.
3. تسمح 30 دقيقة على الأقل لتحقيق الاستقرار بمجرد الحيوان يقع في تسجيل الإعداد المذكورة أعلاه قبل تسجيل ساعة واحدة لضغط الدم خط الأساس والبيانات رسنا. ضمان هو يستريح الحيوان بهدوء أثناء تسجيل منذ الحركة الطبيعية ويرتبط مع زيادة في لهجة متعاطفة. ملاحظة عندما يتحرك الحيوان مباشرة على التتبع الرقمي أثناء تسجيل حتى هذا يمكن تجاهلها أثناء التحليل.
4. اختبار استجابة باروريفليكس الأولى ببطء حقن بلعه من الصوديوم nitroprusside (2.5 ميكروغرام/غرام من وزن الجسم في وحدة تخزين 25 ميليلتر من المحلول الملحي) في السطر التسريب. بطء تدفق الخط مع ~ 50 ميليلتر فيزيولوجية المالحة. تأكد من مسح الفضاء قتيلا القسطرة. سجل ضغط الدم ورسنا لمدة 2 إلى 5 دقائق.
5. ببطء حقن بلعه phenylephrine (20 ميكروغرام/غرام من وزن الجسم في 25 ميليلتر من المحلول الملحي). مسح مع ~ 50 ميليلتر فيزيولوجية المالحة. تأكد من مسح الفضاء قتيلا القسطرة. سجل ضغط الدم ورسنا لمزيد من 10 إلى 15 دقيقة.
6. التحقق من طبيعة postganglionic إشارة العصب عن طريق حقن بلعه من مانع جانجليونيك، هيكساميثونيوم (50 ميكروغرام/غرام وزن في 25 ميليلتر الملحية) في خط ضخ ببطء. مسح مع ~ 50 ميليلتر المالحة. تأكد من مسح الفضاء قتيلا القسطرة. مواصلة التسجيل لعدة دقائق.
7. استخدم النشاط المتبقية التي لا تزال بعد الإدارة هيكساميثونيوم كتقدير للضوضاء الخلفية لاستخدامها في تحليل رسنا (الموصوفة أدناه).
8. Euthanize الماوس مع جرعة زائدة من إيسوفلوراني (الجرعة تدريجي في زيادات بمقدار 0.5 ما يصل إلى 5 في المائة) ومواصلة تسجيل رسنا زيادة 30 دقيقة. ملاحظة: إشارة المتبقية كما يمكن استخدام كتقدير للضوضاء الخلفية لتحليل رسنا.

15-بيانات التحليل

1. استخدام البرمجيات اقتناء البيانات لتحليل ضغط الدم الخام وآثار رسنا.
   1. دمج رقمياً وتصحيح الموجه كامل التتبع رسنا الخام باستخدام هذا البرنامج. حدد "المطلقة" متكاملة "لإعدادات لا يتجزأ؛ تطبيق وقت اضمحلال مستمر 0.1 ثانية⁶.
   2. تحليل الإشارات رسنا المتكاملة (عرض) في وحدات µV·s لكل جزء من البروتوكول التجريبي. تجاهل قطاعات من التسجيل عندما حدث هذا الحيوان لتتحرك. أخذ قياسات على الأقل 3 لخط الأساس وأجزاء تجريبية للتجربة، على التوالي.
   3. تحليل رسنا على مستوى ضغط الدم الحد الأدنى والحد الأقصى يتحقق nitroprusside الصوديوم أو فينيليفريني، على التوالي، لتقييم حساسية baroreflex.
   4. متوسط القياسات الفردية المتخذة أعلاه لكل جزء من البروتوكول التجريبي تسفر عن قيمة مفردة.
   5. قياس الاستجابة رسنا بحساب النسبة المئوية للتغير من رسنا من الأساس، والذي تم تعيينه في 100%⁷. استكمال التحليل الإحصائي حسب الاقتضاء.
      ملاحظة: في هذا المثال، تم تحليل إحصائي لرد رسنا على nitroprusside الصوديوم و phenylephrine مع اختبار t للطالب؛ أهمية وقبلت بقيم P < 0.05.

النتائج

وبعد وصف البروتوكول، كان معدل البقاء على قيد الحياة 100%-جميع الفئران تجهيزها في هذه الدراسة ونجا وتعافي تماما بعد العملية الجراحية. خلال 24 ساعة إعداد العمليات الجراحية، الفئران كل تصرف عادة، نستعرض الأكل نموذجي، السلوكيات الاستمالة واستكشافية. الحيوانات لم تظهر أي علام?...

Discussion

هنا لدينا المبينة، وأظهر والتحقق من صحة طريقة جديدة للتقييم المستهدفة من رسنا في الفئران واعية، حرية الانتقال والراحة بشكل مريح في اقفاصها المنزل. وبعد الجراحية زرع راديوتيليميتير ضغط الشرياني، قسطرة تسريب الوريدي نائحين وقطب رسنا قطبين خصيصا، الفئران تعافي من جراحة وتركت دون عائق لمدة...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Teflon-coated stainless steel multiple stranded wire	A-M Systems	793200	0.001in diameter bare; 0.0055in diameter coated
#11 Scalpel Blade	Fisher Scientific	ALMM9011
Soldering Iron and solder			Any make or model suitable
Male miniature pin connectors	A-M Systems	520200	Brass with gold plating
Female miniature pin connectors	A-M Systems	520100	Brass with gold plating
Heat Shrink tubing	Radio Shack	Model #: 278-1610 | Catalog #: 2781610	1.6 mm diameter
Polyethylene 90 (PE90) tubing	VWR	CA-63018-703	0.86mm inner diameter; 1.27mm outer diameter
Dissecting microscope	Leica Microsystems	Leica M80	Any make or model also suitable
Polyethylene 10 (PE10) tubing	Braintree Scientific	PE10 50 FT	0.28mm inner diameter; 0.61mm outer diameter
Super Glue Liquid	Loctite	n/a	Liquid Formula; any brand suitable
Super Glue Gel	Loctite	n/a	Gel Formula; any brand suitable
Polyethylene tubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/13	For pedestal 2.7mm inner diameter; 4.0mm outer diameter
Hospital Sterilization Services & Ozone Sterilization packets			Contact local hospital sterilization services
Isoflurane anesthesia	Abbott	05260-05
Deltaphase isothermal heat pads & surgical table	Braintree Scientific	39OP	Keep heat pads warm in a 37°C water bath; Corresponding surgical table essential
Glycopyrrolate	Amdipharm Mercury Company Limited	n/a
Isoflurane vaporizer system & flow gauge	Braintree Scientific	VP I	Include medical grade oxygen supply
Tissue scissors	Fine Science Tools	14173-12
Fine spring scissors	Fine Science Tools	15006-09
Small cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23400100
Fine Straight Forceps	Fine Science Tools	11254-20	#5, FST by Dumont Biologie Tip
Angled Forceps	Fine Science Tools	11251-35	#5/45 FST by Dumont
Small Absorbent Spears	Fine Science Tools	18105-03
Parafilm	Sigma Aldrich	BR701605 ALDRICH
Kwik-Sil 2 component Silicone Polymer	World Precision Instruments (WPI)	KWIK-SIL	Purchase extra specialized tips from WPI
5-0 Polysorb Suture	Tyco Healthcare	n/a
6-0 Silk Suture	Braintree Scientific	SUT-S 104	Deknatel brand, spool
Radiotelemetry Probe	Data Sciences International (DSI)	TA11-PAC10
Radiotelemetry Receiver	Data Sciences International (DSI)	PhysioTel RPC-1
Ambient Pressure Reference	Data Sciences International (DSI)	Apr-01
Pressure Output Adapter	Data Sciences International (DSI)	R11CPA
Rena Pulse Tubing	Braintree Scientific	RPT-040
Infusion Swivel	Instech Solomon	375/D/22
Swivel Support Arm & Mount	Instech Solomon	SMCLA
Polysulfone button	Instech Solomon	LW62S/6
Stainless steel spring	Instech Solomon	PS62
Vetbond surgical adhesive	3M	n/a
Triple Antibiotic Ointment	Fougera	n/a
PowerLab 8 Channel Data Acquisition System & Software	ADInstruments	PowerLab 8/35
PVC Insulated Cable	Belden	PVC Audio Connection Cable 32 AWG
Preamplification Headstage	Dagan Corporation	Model 4002
Differential Amplifier	Dagan Corporation	EX4-400
Sodium Nitroprusside	Sigma Aldrich	71778-25G
Phenylephrine	Sigma Aldrich	P6126-5G
Sterile Physiological Saline 0.9% NaCl	Beckton Dickinson		Contact local hospital supplier
hexamethonium	Sigma Aldrich	H0879-5G
Stainless Steel top anti vibration table	n/a	n/a	Custom designed in-house; Solid steel plate on a benchtop is also suitable
Faraday cage	n/a	n/a	Custom designed and constructed in-house
Small animal hair trimmer	n/a	n/a	Drugstore, men's beard trimmer suitable
Dipilatory Cream	n/a	n/a	Veet brand, sensitive skin formula
10% Povidone Iodine	Purdue Products	Betadiene
70% Ethanol	n/a	n/a
Steel microretractors	n/a	n/a	Made in-house. Bend a steel paper clip & loop 4-0 silk to form a retractor
Hemostats	Fine Science Tools	13011-12
Heat Gun	Fisher Scientific	09-201-27