בגישה חדשנית עבור הקלטה בו זמנית של פעילות העצבים הסימפתטית כליות, לחץ דם עם עירוי תוך ורידי, בהכרה, עכברים ערככם.

Summary

עכברים ומורדמת התערוכה-פיזיולוגיים לחץ דם סיסטמי, שמונע את הערכה משמעותי של הטון האוטונומית נתון את הקשר האינטימי בין לחץ הדם ואת מערכת העצבים האוטונומית. לפיכך, התווה שיטה פעילות במקביל להקליט העצבים הסימפתטית כליות, לחץ דם עם עירוי תוך ורידי בעכברים בהכרה.

Abstract

העצבים הסימפתטית כליות לתרום באופן משמעותי תופעות פיזיולוגיות וגם pathophysiological. הערכת פעילות העצבים הסימפתטית כליות (RSNA) הוא עניין רב בתחומים רבים של מחקר כגון מחלת כליות כרונית, לחץ דם, אי ספיקת לב, סוכרת והשמנה. הערכת חד-משמעית של התפקיד של מערכת העצבים הסימפתטית הכרחי ובכך לפרשנות הראויה תוצאות ניסויית והבנה של תהליכי מחלה. RSNA היה נמדד באופן מסורתי בחולדות מרדימים, לרבות עכברים. עם זאת, עכברים בדרך כלל התערוכה לחץ דם סיסטמי מאוד נמוך וחוסר יציבות והמודינמיקה למשך מספר שעות במהלך הרדמה וניתוח. משמעות הפרשנות RSNA הוא מבולבל על ידי המדינה-פיזיולוגיים, בהתחשב הקשר האינטימי בין בטון עצבני סימפטי מצב הלב וכלי הדם. כדי לטפל מגבלה זו של הגישות המסורתיות, פיתחנו שיטה חדשה למדידת RSNA בעכברים בהכרה, לנוע בחופשיות. עכברים היו כרוניים שעברו אינסטרומנטציה עם רדיו-telemeters עבור ניטור רציף של לחץ דם וכן קטטר עירוי ורידי צוואר ו אלקטרודה דו-קוטבי שעוצב עבור הקלטה ישירה של RSNA. לאחר תקופת החלמה של 48-72 שעות, שיעור ההישרדות היה 100%, כל העכברים התנהגו כרגיל. בשלב זה הזמן-, תצורתן של RSNA הוקלט בהצלחה ב- 80% של עכברים, עם אותות קיימא רכשה עד 4 ו- 5 ימים לאחר הניתוח 70% ו- 50% של עכברים, בהתאמה. לחץ דם פיזיולוגיים נרשמו בעכברים כל (מ מ כספית 116±2; n = 10). RSNA מוקלטות גדל עם אכילת וטיפוח, כמו ומבוססת בספרות. יתר על כן, RSNA אומתה על ידי המצור ganglionic ו אפנון של לחץ דם עם סוכנים תרופתי. במסמך זה, מתוארת שיטה לניהול ויעילים עבור הקלטה ברורה של RSNA בעכברים בהכרה, לנוע בחופשיות.

Introduction

עניין שימוש בעכברים במספר תחומים של המחקר הביו-רפואי ממשיכה להתרחב עם הפיתוח של אינספור מודלים מהונדס גנטית. ברוב המקרים, ההתקדמות הטכנית לשמור בקצב עם שימוש מוגבר של עכברים בפיזיולוגיה, ויש עכשיו מבחר מרשים של התקנים ולמחקר שפותחה במיוחד עבור מדידת פרמטרים פיזיולוגיים חשובים בעכברים. למרות telemetric מכשירי מדידה של אוטונומי ישיר בטון עצבני בחולדה בהכרה היו זמינים עבור למעלה מעשור, התקנים ולמחקר להערכת פעילות העצבים בעכברים בהכרה אינם כיום זמינים. החוקרים בדרך כלל לעקוף מגבלה זו על-ידי הערכת התרומה של מערכת העצבים האוטונומית עם שיטות עקיפות (דהיינו פלזמה או שתן catecholamines, המצור תרופתי אוטונומי, ניתוח ספקטרלי של דפוסים של דם לחץ/דופק)¹.

בעוד גישות אלה מספקים מידע רב ערך, התוצאה היא תמונה גלובלית של הטון הכללית אוטונומי, במקום לחשוף את התרומה דיסקרטית של אוכלוסיות מבודדות של העצבים לתופעה תחת חקירה. לחלופין, הקלטה ישירה של פעילות מתוך עצבים ספציפיים בוצע בעכברים מרדימים, אשר מהווה המון חששות. . זה קשה מאוד לשמור על לחץ הדם יציב בטווח פיזיולוגיים עכבר anesthetized עבור מספר שעות לאחר הניתוח. למעשה, אלו סוגים של ניסויים, לחץ דם לעיתים קרובות בלתי מדווחות או הציג ברמות נמוכות מאוד (קרי 60-80 מ מ כספית לעומת > 100mmHg ב עכבר בהכרה)². השבריריות של מערכת הלב וכלי הדם באורה של העכבר ומורדמת הכנה לעתים קרובות מונע הערכת משמעותי של הפעילות במערכת העצבים הרצונית, נתן את תלות בין לחץ הדם בטון סימפטי^{3, 4}.

כדי לטפל מגבלה זו, שיטה חדשה עבור הקלטה ישירה של פעילות העצבים הסימפתטית כליות (RSNA) בהכרה, פותחה ערככם עכברים, ללא הפרעה בתוך הכלובים הביתה. הן הגישה הכירורגית ו ניסיוני עבור יישום מוצלח של טכניקה זו מתוארת בפירוט. הכנה זו מאפשרת לחוקר ובו-זמנית להקליט לחץ הדם בעורק ויה radiotelemetry בנוסף RSNA, בעזרת היכולת הוסיף לווריד להחדיר סוכנים עניין מבלי להפריע את העכבר.

עשרים וארבע שעות לאחר הניתוח, עכברים מתנהגים בצורה נורמלית, לא מפגינים סימנים של כאב או מצוקה. הקלטות ניסיוני ואז אולי להתחיל 48 עד 72 שעות לאחר הניתוח בעוד העכבר נח בנוחות בכלוב בבית שלה עם גישה בלתי מוגבלת אוכל ומים, העשרה סביבתית. נקה עקבות RSNA מוצגים, התגובות האופייניות של אוכלוסייה זו חוצפה לתנועות גופניות נורמלי של החיה (כגון אכילה וטיפוח) מודגמות בנוסף אפנון תרופתי בלחץ דם מערכתית. איכות וספציפיות של האות RSNA תאומת רחוק על-ידי המצור ganglionic. כתב יד זה כולל את המשלים אורקולי את תיאור שפורסם בתחילה של טכניקה זו⁵.

Protocol

כל ההליכים ניסיוני הינם בהתאם מוסדות לאומיים של בריאות המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה והמרכז הרפואי של אוניברסיטת מיסיסיפי.

1. בעלי חיים ודיור

1. הבית עכברים (24-35 גר') עם ההגעה במתקן חיות מעבדה מוסדיים.
2. מציעים עכברים תקן האוכל מכרסמים, מי ברז ad libitum בשלבים השונים של פרוטוקול נסיוני בסביבה מבוקרת טמפרטורה ולחות.

2. אישית פבריקציה נוספת של האלקטרודה RSNA מושתלת

הערה: לבנות האלקטרודה RSNA מושתלת לפחות כמה ימים לפני הליך כירורגי מתוזמנת כדי להכיל את זמן אשפרה, סטריליזציה (יפורט בהמשך).

1. חותכים שלושה שווים באורכם של פלדת אל-חלד מבודד גדילי מרובים חוט, 250 מ מ (קוטר חוט חשוף 0.0254 מ"מ, 0.14 מ"מ מצופה). להשתמש באזמל להב (רצוי #11) להתפשט כ- 15 מ מ של חומר בידוד ולחשוף את המתכת הבסיסית מקצה אחד של כל האורכים של חוט.
   1. הלחמה יחידה פין זכר מחבר (פליז עם ציפוי זהב) לסוף חשופות רק שני החוטים כדי ליצור הפניות אלקטרודה הפרעה דו קוטבית (איור 1 א'). להשאיר לסוף האורך השלישי של חוט חשוף. זה יפעל כמבצע הקרקע.
   2. להחליק קצר (~2.0 - 2.5 ס מ) פיסת 1.6 מ מ קוטר לכווץ אבובים על פינים מחבר ועל חוט לכסות לגמרי את המפרק מולחם לאחרונה בין המחבר תיל וסיכה.
      הערה: קצה המחבר pin זה להיות פקוק לתוך headstage מגבר חייבת להישאר חשוף.
   3. החזק את החוט מעל אקדח חום עם זוג פלייר קטן או ועוצרי דימום לכווץ את הצנרור רגיש לחום, חשמלית לבודד את הקשר בין המחבר pin את החוט. חזור על המחבר השני חוט של חשבונך.
2. לחתוך באורך 200 מ מ של צינורות פוליאתילן (PE 90; הקוטר הפנימי 0.86 מ מ, הקוטר החיצוני 1.27 מ מ). לקבץ את החוטים שלוש (שניים מוביל + קרקע חוט), להציג את הקצוות שלא נגעו לתוך צינורות PE 90, להשחיל אותם יחד דרך לקצה הפתוח של הצנרת (איור 1B).
   הערה: ה-90 PE צינורות פונקציות כמו נדן לקבץ ולהגן על האלקטרודה מוביל ולקרקע תיל.
   1. לזהות את החוט הקרקע, מושך אותו מהנרתיק PE 90 קצת יותר רחוק כדי להבדילה ללידים אלקטרודה הפרעה דו קוטבית.

3. בנייה של קצה האלקטרודה

1. דמיינו את קצות החוטים אלקטרודה לא נגעה עם מיקרוסקופ ויבתר. החוט הקצוות שלושה של האלקטרודה דרך 5 מ מפיסה מוארכת של צינורות פוליאתילן קטנים יותר (PE 10, הקוטר הפנימי 0.28 מ מ, הקוטר החיצוני 0.61 מ"מ) לקשור את החוטים אלקטרודה ביחד.
   1. שרשור פיסת זה צינורות PE 10 אל החוטים אלקטרודה 3 1.5 מ מ. מראש זה אבובים לנוח 2.0 מ מ מן היצירה הראשונית 5 מ מ של PE 10.
   2. שרשור חתיכה 1.5 מ מ השני של צינורות PE 10 אל קצות ללידים אלקטרודה דו קוטבי שני מכסים לבודד את הטיפים ולהפריד ביניהם מן החוט הקרקע (איור 1C).
2. לקצץ בכל אורך עודפי החוטים עם מספריים.
3. הדבק יצירות בודדות של צינורות PE 10 לרדיו אלקטרודה עם טיפה קטנה של דבק נוזלי cyanoacrylate נוסחה. הצב מחט מד 25 קהות על קצה הצינור בדבק כדי לשפר שליטה הישפכות.
   1. מקם את מחט בצומת בין PE 10 דוקרני, אז לוותר על טיפה קטנה של דבק והמחש דבק ציפוי הפנימי של הצנרת PE.
   2. לאפשר הדבק לרפא לחלוטין למשך הלילה.

4. בסדר הכנה של קצה האלקטרודה הקלטה

1. רצועת ציפוי בידוד העצות אלקטרודה הפרעה דו קוטבית, קצה החוט הקרקע עם להב #11 ומהדקים. לא להפריע או לפגום הבסיסית חוטים נטושים מרובים כמו זה ישפיע על איכות האות RSNA.
2. גריפ האלקטרודה נבנה בין 5.0 מ מ 1.5 מ מ PE 10 עוגנים עם מעוקל מלקחיים ולכופף את החוטים כדי ליצור זווית 90 מעלות (איור 1D).
   הערה: זה תמרון צריכים למקם את ההפניות אלקטרודה דו-קוטבי מעל הכבל הקרקע, במצב אופטימלי על ערש את הצרור עצב.

5. בניית המעמד עגינת

1. לבנות הדום לייצב את האלקטרודה מוביל באזור השכמה באמצע של העכבר על כיציאה מתוך הגוף על ידי חיתוך חתיכה 3 ס מ של צינורות פוליאתילן (הקוטר הפנימי 2.70 מ מ, קוטר חיצוני מ מ 4.00).
   1. לאחוז את הצנרור עם מלקחיים, להמיס קצה אחד על אקדח חום. לחץ על הקצה מחוממת של אבובים מאונך משטח מתכת קריר ליצירת רכס מעוגל או "flange".
   2. לשרשר את המעמד הזה אל האלקטרודה נבנה, כך והסתיר מצביע לכיוון קצה האלקטרודה.
      הערה: השילוב של PE 90 נדן, הדום יגנו את ההפניות אלקטרודה אוזני פעם מהחיה.

6. עיקור של האלקטרודה מושתלת שהושלמו

1. חבילת האלקטרודה שהושלמו בנפרד על עיקור תיקים, האוזון לחטא (TSO₃) לפני ההשתלה.
   הערה: התייעץ עם מתקן עיקור החולים המקומי לגבי סוג מסוים של עיקור התיק ואת הליך עוד זה שונה בין מוסדות.

7. לקראת ניתוח והרדמה

1. לנהל נגד כאבים 20 דקות לפני תחילת הניתוח (meloxicam 2 מ"ג/ק"ג, ספורטינג). מקם את העכבר תא אינדוקציה רווי חמצן 100% יש לזה סיווג רפואי. כוונן הגדרות מכשיר אידוי כדי להגדיל את האחוז של איזופלוריין הרדמה, במרווחים של 0.5 עד לרמה של 4%. להעריך את המטוס כירורגי על-ידי הערכת תגובת רפלקס לחץ עדין אצבעות הרגליים או רפידות הרגל של הפורה, בגפיים האחוריות וכן האטה של קצב נשימה.
   1. להעביר את החיה שולחן הניתוחים ולתחזק הרדמה עם 1.5-2% איזופלוריין ויה nosecone ברגע שזה הגיע המטוס כירורגי ומוצגים כבר לא את רפלקס הבוהן-קורט. חזור על התגובה הבוהן-קמצוץ מעת לעת, להעריך את קצב נשימה לאורך כל תהליך כירורגי. להחיל משחה אופטלמולוגיות עיניים למניעת יובש.
   2. לשמור על טמפרטורת גוף נורמלית של החיה בכל עת עם רפידות ג'ל מלא חום איזותרמי, שולחן הניתוחים המתאימים. לאחסן רפידות איזותרמי באמבט מים 37° C, להחליף רפידות לעתים קרובות לפי הצורך במהלך הניתוח כדי לשמור על טמפרטורת הגוף פיזיולוגיים.
   3. ניהול glycopyrrolate (50-70 µg/kg, subcutaneously (ש)) כדי למנוע ייצור יתר של דרכי הנשימה הפרשות מיד עם אינדוקציה של הרדמה. לנהל את המינון של glycopyrrolate בפעם השנייה אל נקודת האמצע של הליך כירורגי (שלב 9.1).
   4. לנהל את כל הניתוחים בתנאים אספטי. ודא שכל כלי ניתוח היה בלוק לפני הניתוח מתוזמנת. לנקות את השדה הכירורגי כמפורט להלן (7.2.1) ולשמור על עקרות לאורך כל ההליך.
      1. לובשים מסיכת פנים, בלוק בידוד חלוק וכפפות חד-פעמיים, סטרילי. לנקות את כל הציוד גדולים כגון מנורה מתכווננת, לנתח שולחן הניתוחים עם אתנול 70% והיקף. מעת לעת במהלך ההליך, להחיל 70% אתנול כפפות כירורגי כדי להבטיח עקרות.
2. להסיר שיער מן האגף השמאלי של החיה, באזור הצוואר הגחון הגבי האזור midscapular עם קוצץ שיער בעלי חיים קטנים ואחריו קרם depilatory (נוסחת לעור רגיש).
   1. לנקות את העור שני שדות כירורגי אלה עם 3 לסירוגין יישומים של פתרון טיהור כירורגי (10% Povidone יוד) ו-70% אתנול. הכינו את השדה כירורגית עם יישום הסופי של הפתרון ניקוי כירורגי.

8. ניתוח ההשתלה של האלקטרודה RSNA

1. מיקום העכבר בצד ימין שלה עם תום rostral הצבעה לשמאל של המנתח, לחשוף את האגף השמאלי של החיה. עושים חתך 5 מ מ בעור של האזור midscapular עם איזמל (11).
   הערה: זהו האתר שבו אוזני ללידים אלקטרודה RSNA.
   1. עושים חתך השני (< 20 מ מ) של העור המכסים את האגף השמאלי, בניצב עמוד השדרה ואת 2 מ מ סימטרית כדי קשת הצלעות. המנהרה מחט נירוסטה 13G subcutaneously מן החתך כדי החתך באתר יציאה הגבי.
      הערה: קובץ את קצוות חדים של המחט לעזוב חלקה, ללא חיתוך קצה.
   2. עוברים המחט 13G האלקטרודה RSNA מושתלת סטיריליים (שלבים 2 - 6). . תחזיר את המחט 13G להשאיר את הטיפ אלקטרודה שוכב על שריר הבטן של האגף השמאלי להשאיר קטע ההפניות אלקטרודה שוכב מתחת לעור, ולהשאיר את אורך הנותרים העולה מן החתך הגבי.
2. מקם את הטיפ אלקטרודה לצד. לעשות חתך בשריר הבטן ישירות שבבסיס החתך בעור שנעשה 8.1.1. הפרד את השומן ורקמות לאורך השריר האחורי באמצעות applicators שקצהו כותנה קטן כדי לחשוף את הכליה השמאלית.
   1. פתח את השדה כירורגית עם מיקרו-רטרקטורים ומשכו את הכליה. לא למתוח את הצרור נוירו-וסקולריים כליות, אשר העצבים כליות נזק בלתי הפיך, למנוע הקלטות של אות RSNA קיימא.
      הערה: יכול להיות מיושן פלדה מיקרו-רטרקטורים מהדק נייר רגיל, באורך של 4-0 משי. ודא שרטרקטורים אלה גם סטריליים עם מכשירי הניתוח על מנת לשמר את הטכניקה aseptic.
3. דמיינו את הצרור כליות נוירו-וסקולריים בעזרת כוח גבוהה לנתח מיקרוסקופ. לזהות את הצרור עצב כליות, אשר בדרך כלל (אך לא תמיד) פועל לצד עורק הכליות ואת הווריד. לנתח את הצרור העצבים מן הרקמות הסובבות עם מלקחיים בסדר, ישר.
   הערה: הצרור עצב כליות יופיע אטום, עם "כמו חבל" רעיוני מראה ייחודי לעומת כלי הלימפה, אשר מופיעים ברורה.
   1. לתפעל את הצרור עצב מעט ככל האפשר. לא לגעת, למתוח או לאסוף את הצרור עצב בכל עת. לא לא לשבש את כלי הדם בסדר ויישם את האומץ או את צינור הלימפה כליות כי זה לסכן את הכדאיות של העצב ולייצר הלימפה רציפה באגירת נוזלים סביב העצב/האלקטרודה, לעכב או להשמיד לחלוטין את האות העצבי.
   2. עזוב הצרור עצב כליות ללא פגע, אשר יסייעו לשמר את הכדאיות לטווח הארוך של העצב, כמו גם לשמור על קשר יציב בין העצב האלקטרודה (קרי בעצב משרטוטי עלול להחליק ממני אלקטרודות עם הזמן ותנועות גוף טבעי).
4. להציג את הטיפ אלקטרודה RSNA לתוך הבטן. התאם את מיקומו כך החוט עצה ועל קרקעי אלקטרודה דו-קוטבי ניצבים על הצרור כליות נוירו-וסקולריים. להתאים את המיקום של האלקטרודה כך החוט הקרקע יש קשר טוב עם שבבסיס הרקמות, האלקטרודה לא לדחוס את כלי הדם כליות, להתפשר על כליות זרימת הדם (איור 1D).
5. הרם את הצרור עצב כליות עם מלקחיים בזווית. להחליק את הטיפ אלקטרודה מתחת העצב, עוזב את העצב במגע ישיר עם שני חוטים.
   1. להחליק חתיכה קטנה של פרפין הסרט בין החוטים עצב/ביפולר החוט (הקרקע) השלישי (איור 1D).
      הערה: להשרות לעקר את הסרט פרפין אתנול 70% במשך 24 שעות ולאחר מכן לשטוף בתוך תמיסת מלח פיזיולוגית סטרילית לפני ההשתלה.
   2. להסיר דם או נוזלים האלקטרודה/העצב עם ספיגה קטן ספירס כמו נוזלים סביב העצב או חוטים אלקטרודה יהיה לעכב או לכבות את האות העצבי.
   3. לבדוק את איכות האות RSNA במהירות במידת הצורך (התקנה המתוארים להלן).
      הערה: זה חייב להתבצע במהירות כמו חשיפה לאוויר יבש העצב ולסכן את יכולת הקיום שלה.
   4. אלסטומר שני סיליקון חלות על יחידת עצב/אלקטרודה, להבטיח כי הבריכות סיליקון מתחת וליד העצב לספק בידוד חשמלי מלא (כלומר לא פשוט טיפה מעל העצב).
      הערה: ודא שהטיפים אלקטרודה הם גם מצופה שהסיליקון. החוט הקרקע צריכה להישאר במגע עם הרקמה הבסיסית, ובכך elastomer אינו צריך בריכה מתחת החוט הזה. המנע ממריחת כמות אלסטומר סיליקון, שלא לצורך גדול כמו זה שעלולים לטרפד את זרימת הדם כליות, או להפוך רופף בתנועות גוף טבעי עם הזמן.
   5. אפשר 1-2 דקות אלסטומר סיליקון לרפא לחלוטין, ואז בזהירות להרים את הקצוות החיצוניים של שהסיליקון "גוש" עם מלקחיים ולהחיל כמות קטנה של דבק כירורגי נוסחה נוזלי.
      הערה: לטפל לא כדי להחיל כמות מוגזמת של דבק הזה, כפי שהוא עשוי לפגום מחזור או להתפשט האומץ לסכן את יכולת הקיום שלה.
6. סגירת החתך בבטן עם התפרים מקוטע, שנספג (5-0). סגור צמוד העור באופן דומה עם תפר באותו החומר.

9. ההשתלה של לחץ דם Radiotelemeter

1. למקם מחדש את העכבר על גבו, עם תום rostral מופנות לכיוון המנתח. התאם הרדמה nosecone לפי הצורך. לנהל את. מנה שנייה של glycopyrrolate בשלב זה (ראה 7.1.3).
2. עושים קו האמצע חתך בעור של אזור הצוואר עם איזמל (#11), החל מתחת לסת תחתונה של החיה והארכת מעל קשת הצלעות. הפרד בין רקמת בלוטות לחשוף את שרירי הצוואר המשמשות כבסיס. לחשוף את עורק תרדמני השמאלי, להפריד בין הרקמות הסובבות.
   הערה: שמור על עצמך שלא יגרמו נזק התועה משום שזה יכול לגרום תמותה מוגברת לאחר ניתוח.
   1. לעבור שלוש חתיכות של 6-0 חומר תפרים משי מתחת העורק. למקם תפר אחד עד rostrally ככל האפשר, תקשור את זה כדי occlude את כלי הקיבול. הצב של מידוויי התפר השני לאורכו של כלי השיט, לקשור באופן רופף. מקם את התפר האחרון הקליפה ככל האפשר, לקשור באופן רופף.
   2. . משכי את התפר rostral ביותר ולאבטח את nosecone עם חתיכה קטנה של משתובב. משכי את התפר סימטרית ביותר עם מלקחיים מיקרו-יתושים כדי להגביל את זרימת הדם בתוך הכלי.
   3. עושים חתך קטן בדופן כלי במספריים אביבי נאה rostrally ככל האפשר. מציגים את הצנתר radiotelemeter העכבר לחץ הדם לתוך כלי הקיבול להתקדם התפר סימטרית.
      1. לקשור את התפר באמצע כדי לייצב את הצנתר באופן זמני, לשחרר את התנצלות סימטרית ולקדם את הקטטר 10 מ"מ. העניבה התפר סביב קטטר לאבטח במקום.
   4. המנהרה מד מרחק לגוף כיס תת עורית לאורך באגף הימני.

10. ההשתלה, כיציאה מתוך הגוף של הקטטר ורידי צוואר

1. להשתמש applicators שקצהו כותנה קטן כדי לחשוף ומוחלף על נכון. להעביר שתי פיסות חומר תפרים משי 6-0 כלי הקיבול.
   1. הצב בתפר אחד עד rostrally ככל האפשר, עניבה כדי occlude את כלי הקיבול. מקם את התפר השני הקליפה ככל האפשר ומשכו בעדינות כדי לעצור את זרימת הדם בתוך הכלי.
   2. להשתמש במספריים אביבי נאה לעשות חתך קטן בדופן הכלי הכי קרוב התפר rostral ככל האפשר. Catheterize את הווריד עם אבובים נמתח-חום (יתר מ מ 1.02, נמתח יתר 0.64 מ מ), אשר קדם מלא עם תמיסת מלח פיזיולוגית סטרילית.
      הערה: ודא שקצה הצנתר נחתך עם איזמל לייצר שיקוע מעוגלות למניעת כלי מחורר. לקבוע את כמות הנוזלים הקטטר (שטח מת) לעיון (ראה שלבים 14.4-14.6 להלן).
      1. לקדם הקטטר ~ 8 מ מ לווריד. מאובטחים הצנתר על ידי קשירת התפרים משי סביב כלי השיט קטטר, וכן יישום של טיפה קטנה של דבק ג'ל cyanoacrylate נוסחה.
2. הנח את העכבר בצד שמאל שלו. המנהרה הקטטר תוך ורידי מן הצוואר יציאה ב האזור הגבי midscapular באמצעות מחט נירוסטה 13G.
3. למקם מחדש את העכבר על גבו. סגור את הצוואר החתך בתפרים מקוטע.
4. מקם את החיה במצב שכיבה. שרשור כפתור תת-עורי קטן על הצנתר ורידים. אבטח את לחצן מתחת לעור עם תפרים. החוט המעיין מפלדת המתאימים על הצנתר ורידים ואבטח אותו על הלחצן העור כדי להגן על הצנתר.

11. אבטחת אלקטרודה יהיו Exteriorized מוביל

1. לאבטח הדום פוליאתילן מגן שהאלקטרודה שמוביל השריר שמתחת עם דבק רקמות. תפר צמוד העור מעל-והסתיר לקבלת תמיכה.

12. ההחלמה שלאחר הניתוח

1. אנטיביוטית חלות על כל החתכים.
2. מחלקים תרופות להרגעה. מחלקים נוספים מינונים של תרופות להרגעה לפי הצורך במהלך תקופת ההחלמה, אם החיה מראה סימנים של כאב או מצוקה.
3. הנח את העכבר בכלוב מטבולי מרופדת עם שבב עץ מצעים ומגבת נייר כדי לשחזר. ללא הרף לנטר את החיה, לא להשאיר אותו ללא השגחה עד שהיא תשוב להכרה יכול לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. מציגים העשרה סביבתית. ומזון ומים (ad libitum) בשלב זה.
4. סליל אלקטרודה מוביל מחוץ לכלוב עד הזמן של הניסוי.
5. הצב את הכלוב מעל משטח חום חם במשך 24 השעות הראשונות של התאוששות. לחבר האביב פלדת אל-חלד, קטטר תוך ורידי מערכת המסתובב/אינפוזיה עבור תקינות של תמיסת מלח פיזיולוגית במהלך תקופת ההחלמה (0.5 מ"ל לשעה).
6. להבטיח שבעל החיים נשאר ביחידים שוכן בתוך כלוב ייעודי בשל אופיו של הקטטר יהיו exteriorized ומוביל אלקטרודה.

13. ניסיוני ההתקנה עבור ההקלטה לחץ הדם ואת RSNA

1. לצייד טבלה רטט נגד העליון פלדת אל-חלד עם כלוב פאראדיי פשוטה.
   הערה: ניתן לבנות כלוב פאראדיי הזה עם רשת מסך מסגרת, אלומיניום עץ. חשמלית הקרקע הכלוב טבלה/פאראדיי לחסל כל רעש חשמלי.
2. מקום מקלט radiotelemetry לחץ דם בתוך הכלוב פאראדיי.
3. לחבר את המקלט radiotelemetry המתאם פלט לחץ המשויך. לחבר מתאם זה מערכת רכישת נתונים ללחץ דם רשומה באינטרנט.
4. הלחמה שני מחברים pin נקבה כי הם ללא תשלום למחברים פין זכר אלקטרודה (פליז עם ציפוי זהב) בקצוות של PVC ששויך, חדרנו ומבודדים כבל. הלחמה את קצוות נגדיים של הכבלים לזווג את אטמי בננה. להתחבר השתלים בננה headstage preamplification (הגברה X 10).
5. להתחבר זה מגבר קדם מגבר דיפרנציאלי. להתאים את ההגדרות כדי להגביר את האות העצבי x10, 000. התאמת הגדרות המסנן כדלקמן: מחשוף, 100 הרץ; גבוהה לחתוך, 1000 הרץ.
6. למקם את הכלוב הביתה המכילה את העכבר אל המקלט radiotelemetry ממוקם בתוך כלוב פאראדיי 48 עד 72 שעות לאחר הניתוח. הפעל את המכשיר radiotelemetry להקליט אותות לחץ דם.
   הערה: הסתגלות העכבר על-ידי הצבת את הכלוב הביתה בכיוונון במהלך שבוע אחד לפני הניתוח הוא אופטימלי.
7. Uncoil את ההפניות אלקטרודה, חבר את מחברי ה-pin של האלקטרודה דו-קוטבי למחברים המתאימים pin נקבה שתוארו לעיל (13.4) כדי להתחיל בהקלטת RSNA.
8. להציג, ובו-זמנית להקליט אותות לחץ דם באינטרנט במחשב, תוך החדרת תמיסת מלח פיזיולוגית או פתרון מעניין. נתוני הרשומה בשיעור מזערי של 2500 דגימות לשניה.

14. לטעום נסיוני ובדיקת RSNA אות

1. ודא עכברים הינם נוחים בכלוב שלהם הביתה, ערככם עם גישה חופשית מזון ומים. בצע את הנחיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים אימות נורמלי המראה וההתנהגות.
2. בית העכברים אותה טמפרטורה ובחדר לחות הנשלט אשר RSNA הקלטה יתקיים. ודא עירוי תוך ורידי ממשיך כמתואר לעיל.
3. אפשר לפחות 30 דקות של ייצוב ברגע החיה ממוקם בכיוונון הקלטה שתוארו לעיל לפני הקלטת שעה אחת של לחץ דם בסיסית ונתונים RSNA. ודא שהחיה נחה בשקט במהלך ההקלטה מאז התנועה הטבעית קשורה עם עלייה בטון סימפטי. הערה כאשר החיה עוברת ישירות על המעקב דיגיטלי במהלך ההקלטה אז זה יכול להיות התעלמו במהלך ניתוח.
4. מבחן התגובה baroreflex מאת הראשון לאט הזרקת סם חמצן (2.5 µg/g של משקל הגוף באמצעי אחסון של 25 µL של תמיסת מלח) לתוך קו אינפוזיה. לאט לאט אשטוף את תמיסת מלח פיזיולוגית ~ 50 µL ודא שטח מת קטטר נוקתה. לחץ דם הרשומה, RSNA במשך 2-5 דקות.
5. לאט לאט להחדיר סיילין phenylephrine (20 µg/g של משקל הגוף ב 25 µL של תמיסת מלח). לשטוף עם תמיסת מלח פיזיולוגית ~ 50 µL. ודא שטח מת קטטר נוקתה. לחץ דם הרשומה, RSNA עבור 10-15 דקות נוספות.
6. ודא הטבע postganglionic של האות העצבי בהזרקת לאט החוסם ganglionic, hexamethonium (50 µg/g משקל הגוף בתוך תמיסת מלח µL 25) לתוך הקו עירוי סיילין. לשטוף עם מי מלח µL ~ 50. ודא שטח מת קטטר נוקתה. המשך הקלטה למשך מספר דקות.
7. השתמש הפעילות שיורית שנשאר אחרי hexamethonium ניהול כמו הערכת רעש רקע לשימוש בהניתוח של RSNA (יפורט בהמשך).
8. המתת חסד את העכבר עם מנת יתר של איזופלוריין (stepwise המינון במרווחים של עד 0.5 5%) ולהמשיך מהקלטה RSNA 30 דקות נוספות. הערה: האות הנותרים עשוי לשמש גם הערכה של רעש רקע לניתוח של RSNA.

15. ניתוח נתונים

1. שימוש תוכנה רכישת נתונים, לנתח לחץ דם raw ועקבות RSNA.
   1. דיגיטלית משלבים ולתקן מלא-גל המעקב RSNA raw באמצעות תוכנה זו. בחר "מוחלט אינטגרלית עבור הגדרות נפרד; חלה דעיכה קבוע הזמן של 0.1 שניות⁶.
   2. לנתח את האות RSNA משולב (מוצג ביחידות של µV·s) עבור כל אחד מהמקטעים של פרוטוקול נסיוני. להתעלם מקטעים של ההקלטה החיה קרה לעבור דירה. לקחת לפחות 3 מידות עבור הבסיס לבין חלקים ניסיוני של הניסוי, בהתאמה.
   3. לנתח RSNA באותה רמת לחץ הדם המינימלי והמקסימלי מושגת חמצן או phenylephrine, בהתאמה כדי להעריך baroreflex רגישות.
   4. ממוצע של מדידות נלקח מעל כל חלק של פרוטוקול נסיוני להניב ערך יחיד.
   5. לכמת את התגובה RSNA על-ידי חישוב השינוי באחוזים של RSNA מקו, אשר מיועד ב 100%⁷. ניתוח סטטיסטי מלאה לפי הצורך.
      הערה: בדוגמה זו, ניתוח סטטיסטי של תגובת RSNA חמצן, phenylephrine הושלמה, למבחן t של סטודנט; משמעות התקבלה עם P ערכים < 0.05.

תוצאות

בעקבות פרוטוקול המתואר, שיעור ההישרדות היה 100% - כל העכברים שעברו אינסטרומנטציה במחקר זה שרד. והחרמתי גם בעקבות הליך כירורגי. תוך 24 שעות הכנה כירורגי, עכברים כל התנהגה בדרך כלל, מפגין מסעדות טיפוסי, טיפוח והתנהגויות גישוש. חיות לא הראה שום סימן של כאב או מצוקה בשלב זה. 48 שעות...

Discussion

בזאת יש המתוארים, הפגינו ואנו אימות שיטה להערכה יישוב של RSNA בעכברים בהכרה, חינם לזוז לנוח בנוחות בכלובים שלהם הביתה. בעקבות ניתוח ההשתלה של radiotelemeter של לחץ הדם בעורק, קטטר שכנה של עירוי תוך ורידי אישית מעוצבת דו-קוטבי RSNA אלקטרודה עכברים התאושש מהניתוח, נותרו ללא הפרעה במשך 48 עד 72 שעות. עכברים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Teflon-coated stainless steel multiple stranded wire	A-M Systems	793200	0.001in diameter bare; 0.0055in diameter coated
#11 Scalpel Blade	Fisher Scientific	ALMM9011
Soldering Iron and solder			Any make or model suitable
Male miniature pin connectors	A-M Systems	520200	Brass with gold plating
Female miniature pin connectors	A-M Systems	520100	Brass with gold plating
Heat Shrink tubing	Radio Shack	Model #: 278-1610 | Catalog #: 2781610	1.6 mm diameter
Polyethylene 90 (PE90) tubing	VWR	CA-63018-703	0.86mm inner diameter; 1.27mm outer diameter
Dissecting microscope	Leica Microsystems	Leica M80	Any make or model also suitable
Polyethylene 10 (PE10) tubing	Braintree Scientific	PE10 50 FT	0.28mm inner diameter; 0.61mm outer diameter
Super Glue Liquid	Loctite	n/a	Liquid Formula; any brand suitable
Super Glue Gel	Loctite	n/a	Gel Formula; any brand suitable
Polyethylene tubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/13	For pedestal 2.7mm inner diameter; 4.0mm outer diameter
Hospital Sterilization Services & Ozone Sterilization packets			Contact local hospital sterilization services
Isoflurane anesthesia	Abbott	05260-05
Deltaphase isothermal heat pads & surgical table	Braintree Scientific	39OP	Keep heat pads warm in a 37°C water bath; Corresponding surgical table essential
Glycopyrrolate	Amdipharm Mercury Company Limited	n/a
Isoflurane vaporizer system & flow gauge	Braintree Scientific	VP I	Include medical grade oxygen supply
Tissue scissors	Fine Science Tools	14173-12
Fine spring scissors	Fine Science Tools	15006-09
Small cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23400100
Fine Straight Forceps	Fine Science Tools	11254-20	#5, FST by Dumont Biologie Tip
Angled Forceps	Fine Science Tools	11251-35	#5/45 FST by Dumont
Small Absorbent Spears	Fine Science Tools	18105-03
Parafilm	Sigma Aldrich	BR701605 ALDRICH
Kwik-Sil 2 component Silicone Polymer	World Precision Instruments (WPI)	KWIK-SIL	Purchase extra specialized tips from WPI
5-0 Polysorb Suture	Tyco Healthcare	n/a
6-0 Silk Suture	Braintree Scientific	SUT-S 104	Deknatel brand, spool
Radiotelemetry Probe	Data Sciences International (DSI)	TA11-PAC10
Radiotelemetry Receiver	Data Sciences International (DSI)	PhysioTel RPC-1
Ambient Pressure Reference	Data Sciences International (DSI)	Apr-01
Pressure Output Adapter	Data Sciences International (DSI)	R11CPA
Rena Pulse Tubing	Braintree Scientific	RPT-040
Infusion Swivel	Instech Solomon	375/D/22
Swivel Support Arm & Mount	Instech Solomon	SMCLA
Polysulfone button	Instech Solomon	LW62S/6
Stainless steel spring	Instech Solomon	PS62
Vetbond surgical adhesive	3M	n/a
Triple Antibiotic Ointment	Fougera	n/a
PowerLab 8 Channel Data Acquisition System & Software	ADInstruments	PowerLab 8/35
PVC Insulated Cable	Belden	PVC Audio Connection Cable 32 AWG
Preamplification Headstage	Dagan Corporation	Model 4002
Differential Amplifier	Dagan Corporation	EX4-400
Sodium Nitroprusside	Sigma Aldrich	71778-25G
Phenylephrine	Sigma Aldrich	P6126-5G
Sterile Physiological Saline 0.9% NaCl	Beckton Dickinson		Contact local hospital supplier
hexamethonium	Sigma Aldrich	H0879-5G
Stainless Steel top anti vibration table	n/a	n/a	Custom designed in-house; Solid steel plate on a benchtop is also suitable
Faraday cage	n/a	n/a	Custom designed and constructed in-house
Small animal hair trimmer	n/a	n/a	Drugstore, men's beard trimmer suitable
Dipilatory Cream	n/a	n/a	Veet brand, sensitive skin formula
10% Povidone Iodine	Purdue Products	Betadiene
70% Ethanol	n/a	n/a
Steel microretractors	n/a	n/a	Made in-house. Bend a steel paper clip & loop 4-0 silk to form a retractor
Hemostats	Fine Science Tools	13011-12
Heat Gun	Fisher Scientific	09-201-27