Новаторский подход для одновременной записи активности почечной симпатических нервов и кровяного давления с помощью внутривенного вливания в сознании, безудержной мышей.

Резюме

Наркотизированных мышей экспонат-физиологические системного артериального давления, который исключает обоснованной оценки автономная тон, учитывая тесную взаимосвязь между кровяного давления и вегетативной нервной системы. Таким образом изложил новый метод одновременно записывать почечной симпатической нервной деятельности и кровяного давления с помощью внутривенного вливания в сознательных мышей.

Аннотация

Почечной симпатического нервов в значительной степени способствовать как физиологические, так и патофизиологические явлений. Оценки деятельности почек симпатических нервов (RSNA) представляет большой интерес во многих областях исследований, таких как хроническая болезнь почек, гипертонии, сердечной недостаточности, диабета и ожирения. Таким образом недвусмысленную оценку роли симпатической нервной системы необходимо для правильной интерпретации экспериментальных результатов и понимание процессов болезни. RSNA традиционно была измерена на наркотизированных грызунов, включая мышей. Однако мыши обычно exhibit очень низким системного артериального давления и нестабильности гемодинамики на несколько часов во время анестезии и операции. Значимые интерпретации RSNA confounded эта-физиологические государством, учитывая тесную взаимосвязь между симпатической нервной тон и сердечно-сосудистой статус. Чтобы устранить это ограничение традиционных подходов, мы разработали новый метод для измерения RSNA в сознательных, свободно перемещающихся мышей. Хронически мышей были инструментированы с радио телеметры для непрерывный мониторинг артериального давления, а также шейных вен настой катетера и специально биполярного электрода для прямой записи RSNA. После периода восстановления 48-72 часа выживаемость составила 100% и все мыши вели себя нормально. В этот момент времени RSNA был успешно записан в 80% мышей, с жизнеспособным сигналов, приобретенных до 4 и 5 дней после операции в 70% и 50% мышей, соответственно. У всех мышей были записаны физиологическое кровяное давление (116±2 мм рт.ст.; n = 10). Записанные RSNA увеличилась с питание и уход, как устоявшихся в литературе. Кроме того RSNA был подтвержден Ганглиозный блокады и модуляции артериального давления с фармакологическими агентами. Здесь описан метод эффективного и управляемого четкие записи RSNA в сознательных, свободно перемещающихся мышей.

Введение

Интерес к использованию мыши в ряде областей биомедицинских исследований продолжает расширяться с развитием бесчисленные генетически модифицированных моделей. По большей части технические достижения сохранили ногу с ростом использования мышей в физиологии и в настоящее время впечатляющий выбор миниатюрных устройств, разработанных специально для измерения важных физиологических параметров в мышах. Хотя телеметрические устройства для прямого измерения вегетативной нервной тон сознательного крыс были доступны для более десяти лет, миниатюрных устройств для оценки деятельности нерва в сознательных мышей в настоящее время не доступны. Исследователи обычно обойти это ограничение путем оценки вклада вегетативной нервной системы с косвенные методы (т.е. плазма или моче катехоламинов, фармакологические вегетативная блокада, спектральный анализ моделей крови ¹давление/сердечного ритма).

Хотя эти подходы обеспечивают ценную информацию, в результате получается глобальную картину в целом в вегетативной тон, а не раскрывая дискретных вклад изолированных популяций нервов к явлению под следствием. Кроме того прямой записи активности от конкретных нервы были казнены наркотизированных мышей, которая создает множество проблем. Это чрезвычайно трудно поддерживать стабильное артериальное давление в физиологических пределах наркотизированных мыши за несколько часов после операции. В самом деле, в эти виды экспериментов, кровяное давление часто нерегулируемый или представлены на крайне низком уровне (то есть 60-80 мм рт.ст vs > 100mmHg в сознательных мыши)². Хрупкость сердечно-сосудистой системы, выставлены в подготовке наркотизированных мыши часто исключает обоснованной оценки вегетативной нервной деятельности, учитывая codependent взаимосвязь между кровяного давления и симпатической тон^{3, 4}.

Для устранения этого ограничения, новый метод для прямой записи активности (RSNA) почечной симпатического нерва в сознании, была разработана безудержной мышей, спокойно в пределах их дома клетки. Подробно описан как хирургические и экспериментальный подход для успешной реализации этой методики. Такая подготовка позволяет следователю для одновременной записи артериального давления через манулами помимо RSNA, с дополнительной возможности внутривенно настаиваться агентов интерес не нарушая мыши.

Двадцать четыре часа после операции, мышей ведут себя нормально и не проявляют признаки боли или страданий. Экспериментальная записи затем может начаться 48 до 72 часов после операции, в то время как мыши удобно лежит в своей домашней клетке неограниченный доступ к продовольствию, воде и окружающей среды обогащения. Четкие следы RSNA представлены и продемонстрированы характерные реакции населения этого нерва для нормального физического движения животного (например, питание и уход) в дополнение к фармакологической модуляции системного артериального давления. Качество и специфику RSNA сигнала Далее проверяется Ганглиозный блокадой. Этот манускрипт включает аудиовизуальных дополнение к первоначально опубликовано описание этой техники⁵.

протокол

Все экспериментальные процедуры соответствуют национальных институтов здравоохранения руководство для ухода и использования лабораторных животных и были утверждены Комитетом по институциональный уход животных и использование медицинского центра Университета штата Миссисипи.

1. Животные и жилищного строительства

1. Дом мышей (24-35 g) по прибытии в объекте институциональные лабораторные животные.
2. Предлагаем мышей стандартных грызунов Чоу и водопроводной воды ad libitum на всех этапах экспериментального протокола в контролируемой среде, температуры и влажности.

2. индивидуальные изготовления имплантируемые RSNA электрода

Примечание: Постройте имплантируемые RSNA электрода по крайней мере за несколько дней до запланированного хирургическая процедура, чтобы вместить время отверждения и стерилизации (описано ниже).

1. Вырежьте три равной длины изолированных нержавеющей стали несколько мель проволоки, 250 мм (диаметр проволоки 0.0254 мм голые, 0,14 мм покрытием). Примерно 15 мм изоляционного материала для предоставления основной металл от одного конца каждого из длины проволоки используется лезвие скальпеля (предпочтительно #11).
   1. Припой один мужской разъема (латуни с золотым напылением) до конца обнажённая только двух проводов для создания биполярного электрода приводит (рис. 1A). Оставьте в конце третьего длины проволоки голые. Это будет функционировать как заземляющий провод.
   2. Скольжения короткий (~2.0 - 2,5 см) кусок 1,6 мм диаметр Термоусадочные трубки на контактный разъем и провода полностью покрывают недавно паяных стык между проволока и контактный разъем.
      Примечание: Кончик контактный разъем, который будет подключен к усилителю headstage должны оставаться открытыми.
   3. Держите провод выше тепловой пушки с парой небольших плоскогубцев или hemostats сжать термочувствительных труб и электрически изолировать связь между соединитель-шпильку и проволока. Повторите эти действия для второй провод/разъема.
2. Вырезать 200 мм длина полиэтиленовых труб (PE 90; внутренний диаметр 0.86 мм, наружный диаметр 1,27 мм). Группа трех проводов (два приводит + молотый проволоки) и привнести нетронутой концы труб PE 90, потоков их вместе через открытый конец трубки (рис. 1B).
   Примечание: 90 PE трубы функции как оболочка для группировки и защищать электрода приводит и наземное проволоки.
   1. Идентифицировать заземляющий провод и вытащить его через оболочкой PE 90 немного дальше, чтобы отличить его от биполярного электрода приводит.

3. Строительство электрода

1. Визуализируйте нетронутой концы проводов электродов с микроскопом рассечения. Поток три свободные концы электродов через 5 мм - длинный кусок меньше полиэтиленовых труб (PE 10, внутренний диаметр 0,28 мм, наружный диаметр 0,61 мм) для привязки электродами провода вместе.
   1. Нить 1,5 мм кусок этой трубы PE 10 на три электрода провода. Предварительный этот трубопровод для отдыха 2,0 мм от первоначальных 5 мм кусок PE 10.
   2. Тема второй 1,5 мм кусок трубы PE 10 на советы двух биполярного электрода приводит к покрытия и изолировать советы и отделить их от заземляющий провод (рис. 1 c).
2. Обрежьте любой избыток длина проводов с ножницами.
3. Отдельные части трубы PE 10 с электродами провода с небольшой капли жидкого формула Цианакрилатный клей клей. Место притупляются 25 иглы на конце трубки клеем для улучшения управления и снижения утечек.
   1. Поместите кончик иглы на стыке между PE 10 и проволоки, а затем обойтись небольшую каплю клея и визуализировать клей, покрытие внутри труб PE.
   2. Разрешить клей полностью вылечить на ночь.

4. тонкой подготовка электрода для записи

1. Газа изоляционного покрытия от биполярного электрода советы и кончик провода с лезвием скальпеля #11. Не беспокоить или не повредить основные несколько мель провода как это повлияет на качество сигнала RSNA.
2. Сцепление сконструированный электрода между 5,0 мм и 1,5 мм PE 10 якорей с Изогнутый пинцет и сгибайте провода сформировать под углом 90° (рис. 1 d).
   Примечание: Этот маневр следует располагать биполярного электрода приводит выше заземляющий провод, в оптимальном месте для колыбели нерва расслоение.

5. Строительство анкерные пьедестал

1. Пьедестал для стабилизации электрода приводит к середине наплечник региона мыши по экстериоризации резки 3 см кусок полиэтиленовой трубы конструкции (внутренний диаметр 2,70 мм, наружный диаметр 4.00 мм).
   1. Захват труб с щипцами и растопить один конец тепловой пушки. Нажмите на подогревом конец трубы перпендикулярно к прохладной поверхности металла для создания округленные хребет или «полки».
   2. Нить это пьедестал на построенных электрода, таким образом, чтобы фланец указывающую электрода.
      Примечание: Сочетание оболочкой PE 90 и пьедестал будет защищать электрода приводит однажды печенке от животных.

6. стерилизация завершена имплантируемые электрода

1. Пакет завершенного электрод индивидуально в стерилизации Сумки и озона стерилизовать (TSO₃) до имплантации.
   Примечание: Проконсультироваться с местной больницы стерилизации объекта относительно определенного типа стерилизации мешок и процедуры, как это отличается между учреждениями.

7. анестезия и подготовка к операции

1. Администрировать анальгезии 20 минут до начала операции (2 мг/кг Мелоксикам, S.C.). Поместите курсор мыши в камеру индукции, infused с 100% медицинского кислорода. Настройте параметры испарителя для увеличения доли изофлюрановая анестезии с шагом 0,5 до 4%. Оценивать хирургических плоскости путем оценки рефлекторной реакции нежно давление на пальцы или подушечки из носовой и задних конечностей, а также замедление дыхания.
   1. Перенесите животное в хирургической и поддержания анестезии с 1,5 до 2% изофлюрановая через ураном, после того как он достиг хирургические плоскости и больше не выставок мыс щепотка рефлекс. Периодически повторяйте мыс щепотка ответ и оценить частоту дыхания на протяжении всего хирургическая процедура. Применить глазная мазь для глаз для предотвращения сухости.
   2. Сохранить животных нормальной температуры тела во все времена с гель заполняется изотермический тепла колодки и соответствующей операционный стол. Хранить изотермический колодки в ванну воды 37° C и заменить колодки так часто, как во время операции необходимо поддерживать температуру физиологических тела.
   3. Администрировать гликопирролат (50-70 мкг/кг подкожно (С.К.)) для предотвращения чрезмерного производства выделениями дыхательных путях сразу после индукции анестезии. Управлять этой дозы гликопирролат во второй раз в середине хирургической процедуры (шаг 9.1).
   4. Проведение всех хирургических процедур в асептических условиях. Убедитесь, что все хирургические инструменты были газобетона до запланированной операции. Очистите операционного поля, как описано ниже (7.2.1) и поддерживать стерильность в течение всей процедуры.
      1. Носите маску, газобетона изоляции платье и стерильные одноразовые перчатки. Очистите все большие оборудования, например изогнутая лампа, рассекает сферы и операционный стол с 70% этиловом спирте. Периодически во время процедуры применяются к хирургические перчатки для обеспечения стерильности на 70% спирте.
2. Удалите волосы из животного левый фланг, вентральной шеи и спинной midscapular региона с мелких животных для стрижки следуют депиляционный крем (формула чувствительной кожи).
   1. Очищение кожи лица этих двух хирургических полей с 3, чередуя приложений хирургической очистки раствора (10% повидон йод) и на 70% спирте. Подготовка операционного поля с конечного применения хирургического очищающий раствор.

8. хирургической имплантации RSNA электрода

1. Поместите указатель мыши на его правой стороне с ростральной конца указывая налево хирурга, подвергая животного левый фланг. Сделайте 5 мм разрез в коже midscapular региона с помощью скальпеля (#11).
   Примечание: Это сайт, на котором будет печенке RSNA электрода приводит.
   1. Сделать второй надрез (< 20 мм) в коже, обволакивающие левый фланг, перпендикулярно 2 мм каудально к грудной клетки и позвоночника. Туннель иглы из нержавеющей стали 13G подкожно из этого разреза в разрез в спинной выхода сайта.
      Примечание: Файл острыми краями иглы оставить гладкой, не передний край.
   2. Пройти 13G иглы стерилизованные имплантируемые RSNA электрода (шаги 2 - 6). Тяните обратно 13G иглы оставить электрода, лежа на животе мышц левого фланга. Оставьте сегмент электрода приводит, лежа под кожу и оставить остальные длины, возникающих из спинной разреза.
2. Место электрода в сторону. Сделайте разрез в брюшной мышцы, непосредственно лежащих в основе кожи, разрез в 8.1.1. Отделяйте небольшие ватным наконечником аппликаторы подвергать левой почки жира и соединительной ткани вдоль мышц спины.
   1. Открыть с микро Ретракторы хирургические области и отозвать почки. Сделать чтобы не растянуть почечной сосудисто-нервного пучка, который будет необратимо повредить почечной нервы и исключает запись жизнеспособной RSNA сигнала.
      Примечание: Сталь микро ретракторы может вылепленный из стандартного скрепку и длиной 4-0 шелка. Убедитесь, что эти ретракторы также стерилизовать хирургические инструменты с целью сохранения асептической техники.
3. Визуализируйте почечной сосудисто-нервного пучка с помощью высокой мощности, рассекает микроскопом. Идентифицировать почечной нерва расслоение, который обычно (но не всегда) работает вместе с почечной артерии и Вены. Вскрыть нерва расслоение от окружающих тканей с тонкой, прямо щипцами.
   Примечание: Почечная нерва расслоение появляется непрозрачная, с «Канат как» отражает внешний вид, уникальный по сравнению с лимфатические сосуды, которые выглядят четкими.
   1. Манипулировать нерва расслоение как можно меньше. Не прикасайтесь, растянуть или забрать нерва расслоение в любое время. Не нарушать тонкой кровеносных сосудов, поставки нерва, или почечных лимфатических протоков, потому что это будет поставить под угрозу жизнеспособность нерва и производить непрерывный лимфатических жидкость объединения вокруг нерва/электрод, которые будут препятствовать или полностью уничтожить нервные сигнала.
   2. Отпуск почечной нерва расслоение нетронутыми, которая поможет сохранить долгосрочной жизнеспособности нерва, а также поддерживать стабильные контакты между нерва и электродом (т.е. секционного нерва может соскользнуть офф электродов с времени и движения природные тела).
4. Ввести RSNA электрода в брюшную полость. Скорректировать свою позицию, что биполярный электрод наконечник и землю провод перпендикулярно почечной сосудисто-нервного пучка. Далее, отрегулируйте положение электрода, что заземляющий провод имеет хороший контакт с основной ткани и электрода не сжимать почечных сосудов, нарушения почечной циркуляции (рис. 1 d).
5. Поднимите почечной нерва расслоение с угловым щипцами. Скольжения электрода под нерв, оставляя нерва в непосредственном контакте с оба провода.
   1. Небольшой кусок парафина фильма скольжения между нерва/биполярный провода и третий провод (заземление) (рис. 1 d).
      Примечание: Замочить стерилизовать фильм парафина в этанол 70% за 24 часа и промыть в стерильного физиологического раствора до имплантации.
   2. Удалите любые крови или жидкости из вокруг нерва/электрод с небольшой абсорбента Спирс как любой жидкости осталось вокруг нерва или электродами провода будет препятствовать или погасить нервных сигналов.
   3. Быстро проверьте качество сигнала RSNA при желании (установки описано ниже).
      Примечание: Это необходимо сделать быстро как воздействия воздуха будет сухой нерва и скомпрометировать свою жизнеспособность.
   4. Применить это двухкомпонентный силиконовый эластомер к блоку нерва/электрод, обеспечивая силиконовые бассейны под и вокруг нерва для предоставления полной электрической изоляции (т.е. не просто падение на вершине нерва).
      Примечание: Убедитесь, что электрод советы также покрытием в силикон. Заземляющий провод должен оставаться в контакте с основной ткани и таким образом эластомера не нужно бассейн под этот провод. Избегайте применения излишне большое количество силиконового эластомера, как это может потенциально препятствуют почечного кровотока, или стать выбили с движениями природные тела с течением времени.
   5. Разрешить 1-2 минуты для силиконового эластомера вылечить полностью, затем тщательно снять внешние края силиконовые «шар» с щипцами и применить небольшое количество жидкий клей формула хирургического.
      Примечание: Старайтесь не применять чрезмерное количество клея, как это может ухудшить циркуляцию или распространиться на нерв и скомпрометировать свою жизнеспособность.
6. Закройте брюшной разрез с разрывными, рассасывающиеся швы (5-0). Закройте вышележащих кожи в аналогии с же шовного материала.

9. Имплантация артериального давления Radiotelemeter

1. Переместите мышь на его спине, с ростральной конца указывая к хирургу. При необходимости измените анестезии ураном. Администрировать вторая доза гликопирролат на данный момент (см. 7.1.3).
2. Сделайте срединной разрез в коже шеи региона с помощью скальпеля (#11), начиная с чуть ниже нижней челюсти животного и расширение чуть выше грудной клетки. Отдельные железистой ткани, чтобы разоблачить основные мышцы шеи. Разоблачить левую общую сонную артерию и отдельно от окружающих тканей.
   Примечание: Будьте осторожны чтобы не повредить блуждающего нерва, как это может привести к увеличению послеоперационная смертность.
   1. Пройти три части 6-0 шелк шовного материала под артерии. Позиции одним швом насколько рострально как можно скорее и связать его, чтобы загородить судна. Положение второго Мидуэй шва по длине судна и галстук слабо. Позиция последнего шва как можно скорее каудально и галстук слабо.
   2. Убрать ростральной большинство шовные и обеспечить ураном с небольшой кусок пупочной ленты. Убрать хвостового большинство шовный материал с микро комаров щипцы для ограничения потока крови в сосуде.
   3. Сделать небольшой разрез в стенке сосуда с тонкой весной ножницы рострально как можно скорее. Ввести катетер radiotelemeter артериального давления мыши в судно и перейти к хвостовой шовный материал.
      1. Галстук среднего шва временно стабилизировать катетер, освободить хвостового ретракции и продвигать катетер 10 мм. галстук шовный материал вокруг катетера для фиксации на месте.
   4. Туннель телеметр тело кармане подкожной вдоль правого фланга.

10. Имплантация и экстериоризации югулярной венозного катетера

1. Использование малых аппликаторов ватным наконечником подвергать право яремной вены. Проходят две части 6-0 шелк шовного материала вокруг судна.
   1. Позиции одним швом рострально так далеко как это возможно и галстук, чтобы загородить судна. Положение второй шовный материал как можно скорее каудально и аккуратно убрать остановить поток крови в сосуде.
   2. Используйте ножницы штраф весной сделать небольшой разрез в стенке сосуда как можно ближе к ростральной шовный материал как можно скорее. Catheterize вен с тепло растянутые шланги (O.D. 1.02 мм, натянутая ОД 0,64 мм), который предварительно заполнены с стерильного физиологического раствора.
      Примечание: Убедитесь, что кончик катетера режется с помощью скальпеля производить закругленные фаски для предотвращения судно перфорации. Определить объем жидкости в катетер (Мертвое пространство) для справки (см. шаги 14,4-14,6 ниже).
      1. Заранее ~ 8 мм катетер в Вену. Закрепите катетер, связывая шелковые швы вокруг судна и катетер, а также применение малая капля геля формула Цианакрилатный клей.
2. Поместите курсор мыши на его левой стороне. Туннель внутривенного катетера от шеи до выхода на спинной midscapular региона с помощью иглы из нержавеющей стали 13G.
3. Переместите указатель мыши на его спине. Закройте разрез шеи с разрывными швы.
4. Место животного в лежачем положении. Нить небольшие подкожные кнопку на венозный катетер. Закрепите на кнопку под кожу швов. Поток соответствующие пружины из нержавеющей стали над венозного катетера и закрепите его на кнопку кожи для защиты катетера.

11. обеспечение экстериоризируется электрода приводит

1. Безопасный полиэтилен пьедестал защиты электрода приводит к основной мышц с Ткань клей. Шовные вышележащих кожи над фланцем для дальнейшей поддержки.

12. после операции восстановления

1. Применять мазь с антибиотиком для всех разрезов.
2. Администрировать болеутоляющие лекарства. Администрировать дополнительные дозы болеутоляющие лекарства, при необходимости во время периода восстановления, если животное показывает признаки боли или страданий.
3. Поместите курсор мыши в клетке метаболических, выстроились с древесной щепы постельные принадлежности и бумажное полотенце, чтобы восстановить. Постоянно контролировать животное и не оставляйте его без присмотра до тех пор, пока он приходит в сознание и может поддерживать грудной recumbency. Внедрение экологических обогащения и продовольствия и воды (ad libitum) на данный момент.
4. Катушка электрода приводит вне клетки вплоть до эксперимента.
5. Поместите клетке площадку теплый тепла за первые 24 часа восстановления. Подключите пружины из нержавеющей стали и внутривенного катетера для шарнирного соединения/инфузионные системы для непрерывного вливание физиологического раствора в течение периода восстановления (0,5 мл/ч).
6. Убедитесь, что животное остается поодиночке размещается в клетке выделенный из-за природы экстериоризируется катетера и электрода приводит.

13. Экспериментальная установка для записи кровяного давления и RSNA

1. Оборудуйте Топ антивибрационные таблицы из нержавеющей стали с простой клетки Фарадея.
   Примечание: Эта Клетка Faraday могут быть построены с деревянной рамы и алюминия экран сетки. Электрически молотый клетку таблицы/Фарадея для устранения любых электрических шумов.
2. Разместите приемник манулами кровяного давления в клетку Фарадея.
3. Подключите ресивер манулами давления выходной адаптер. Подключите этот адаптер к систему сбора данных для записи кровяного давления онлайн.
4. Кабель с изоляцией припой два женского штырьковых разъема, которые являются бесплатными для электрода мужской разъема (латуни с золотым напылением) к концам парных, экранированный ПВХ. Припой противоположных концах этого парные кабеля для вилки банан. Подключите разъемы банан с идиомой headstage (10 X амплификации).
5. Подключите этот предусилитель для дифференциального усилителя. Настройка параметров для усиления сигнала нерва x10, 000. Настройки фильтра следующим образом: НЧ, 100 Гц; Высокий вырезать, 1000 Гц.
6. Место дома клетки, содержащие мыши на манулами приемник, расположенный в клетку Фарадея 48 до 72 часов после операции. Включите манулами зонд для записи сигналов артериального давления.
   Примечание: Акклиматизации мыши, поместив дома Кейдж в установке в течение 1 недели до операции является оптимальным.
7. Чайник электрода приводит и подключите соответствующие женские разъема описанных выше (13,4) чтобы начать запись RSNA разъема биполярного электрода.
8. Отображения и одновременно записывать кровяного давления сигналы онлайн с помощью компьютера, при вливая физиологического раствора или решение интерес. Запись данных по минимальной ставке 2500 выборок в секунду.

14. образец экспериментальный протокол и проверки RSNA сигнала

1. Убедитесь, что мышь комфортно в их дома клетке, необузданный свободный доступ к продовольствию и воде. Следуйте рекомендациям институционального ухода за животными для проверки обычный внешний вид и поведение.
2. Дом мышей в такую же температуру и влажность контролируемых номер, в котором RSNA будет проходить запись. Убедитесь, что внутривенное вливание продолжает, как описано выше.
3. Позвольте по крайней мере 30 минут стабилизации, когда животное находится в записи установки, описанные выше перед записью один час базовых кровяного давления и RSNA данных. Убедитесь, что животное спокойно отдыхает во время записи, так как естественное движение ассоциируется с увеличением симпатической тон. Примечание Когда животное движется прямо на цифровой трассировки во время записи, так что это могут быть проигнорированы во время анализа.
4. Протестировать барорефлекторной ответ сначала медленно впрыскивать болюс натрия нитропруссида (2,5 мкг/г веса тела в объеме 25 мкл раствора) в линии инфузии. Медленно флеш линии с ~ 50 мкл физиологического раствора. Убедитесь, что снят катетер Мертвое пространство. Запись артериального давления и RSNA для 2-5 минут.
5. Медленно вводить болюс фенилэфрин (20 мкг/г веса тела в 25 мкл физиологического раствора). Заподлицо с ~ 50 мкл физиологического раствора. Убедитесь, что снят катетер Мертвое пространство. Запись артериального давления и RSNA еще 10-15 минут.
6. Проверьте постганглионарные характер нерва сигнала медленно вводя болюс Ганглиозный блокатор, hexamethonium (50 мкг/г веса тела в 25 мкл физиологического раствора) в линии инфузии. Заподлицо с ~ 50 мкл засолены. Убедитесь, что снят катетер Мертвое пространство. Продолжить запись на несколько минут.
7. Используйте остаточная активность, которая остается после hexamethonium администрации как оценки фонового шума для использования в анализе RSNA (описано ниже).
8. Усыпить мышь с передозировкой изофлюрановая (поэтапный Дозировка с шагом 0,5 до 5%) и продолжать запись RSNA еще 30 минут. Примечание: Оставшиеся сигнал может также использоваться как оценки фонового шума для анализа RSNA.

15. анализ данных

1. Использовать программное обеспечение получения данных для анализа сырья кровяного давления и RSNA следы.
   1. Цифрово интегрировать и многоволновой исправить сырья RSNA трассировку с помощью этого программного обеспечения. Выберите «Абсолютный интеграл» для составной параметров; Примените время постоянной распада 0,1 секунды⁶.
   2. Анализ комплексной RSNA сигнал (отображается в единицах µV·s) для каждого сегмента экспериментальный протокол. Игнорировать сегментов записи, когда животное движется. Возьмите по крайней мере 3 измерения для базовых и экспериментальной части эксперимента, соответственно.
   3. Анализируйте RSNA на уровне минимального и максимального давления крови, достигнутый нитропруссида натрия или фенилэфрин, соответственно, чтобы оценить барорефлекторной чувствительность.
   4. Средняя отдельных измерений выше для каждой части экспериментальный протокол для получения одного значения.
   5. Количественно RSNA ответ путем вычисления изменения RSNA в процентах от базового плана, который обозначается в 100%⁷. Полный статистический анализ при необходимости.
      Примечание: В этом примере, статистический анализ реакции RSNA нитропруссида натрия и фенилэфрин был завершен с t -тест студента; значение было принято с P значений < 0,05.

Результаты

После описанных протокол выживаемость составила 100% - всех мышей инструментированных в этом исследовании выжили и выздоровел хорошо после хирургической процедуры. В течение 24 часов после хирургической подготовки, все мыши вели себя нормально, экспонирование типичные...

Обсуждение

Здесь мы изложил, продемонстрировали и проверить новый метод для целевой оценки RSNA в сознательных мышей, свободно перемещаться и комфортно отдохнуть в их дома клетках. После хирургической имплантации radiotelemeter артериального давления, пребывает катетер для внутривенного вливания и спец...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Teflon-coated stainless steel multiple stranded wire	A-M Systems	793200	0.001in diameter bare; 0.0055in diameter coated
#11 Scalpel Blade	Fisher Scientific	ALMM9011
Soldering Iron and solder			Any make or model suitable
Male miniature pin connectors	A-M Systems	520200	Brass with gold plating
Female miniature pin connectors	A-M Systems	520100	Brass with gold plating
Heat Shrink tubing	Radio Shack	Model #: 278-1610 | Catalog #: 2781610	1.6 mm diameter
Polyethylene 90 (PE90) tubing	VWR	CA-63018-703	0.86mm inner diameter; 1.27mm outer diameter
Dissecting microscope	Leica Microsystems	Leica M80	Any make or model also suitable
Polyethylene 10 (PE10) tubing	Braintree Scientific	PE10 50 FT	0.28mm inner diameter; 0.61mm outer diameter
Super Glue Liquid	Loctite	n/a	Liquid Formula; any brand suitable
Super Glue Gel	Loctite	n/a	Gel Formula; any brand suitable
Polyethylene tubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/13	For pedestal 2.7mm inner diameter; 4.0mm outer diameter
Hospital Sterilization Services & Ozone Sterilization packets			Contact local hospital sterilization services
Isoflurane anesthesia	Abbott	05260-05
Deltaphase isothermal heat pads & surgical table	Braintree Scientific	39OP	Keep heat pads warm in a 37°C water bath; Corresponding surgical table essential
Glycopyrrolate	Amdipharm Mercury Company Limited	n/a
Isoflurane vaporizer system & flow gauge	Braintree Scientific	VP I	Include medical grade oxygen supply
Tissue scissors	Fine Science Tools	14173-12
Fine spring scissors	Fine Science Tools	15006-09
Small cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23400100
Fine Straight Forceps	Fine Science Tools	11254-20	#5, FST by Dumont Biologie Tip
Angled Forceps	Fine Science Tools	11251-35	#5/45 FST by Dumont
Small Absorbent Spears	Fine Science Tools	18105-03
Parafilm	Sigma Aldrich	BR701605 ALDRICH
Kwik-Sil 2 component Silicone Polymer	World Precision Instruments (WPI)	KWIK-SIL	Purchase extra specialized tips from WPI
5-0 Polysorb Suture	Tyco Healthcare	n/a
6-0 Silk Suture	Braintree Scientific	SUT-S 104	Deknatel brand, spool
Radiotelemetry Probe	Data Sciences International (DSI)	TA11-PAC10
Radiotelemetry Receiver	Data Sciences International (DSI)	PhysioTel RPC-1
Ambient Pressure Reference	Data Sciences International (DSI)	Apr-01
Pressure Output Adapter	Data Sciences International (DSI)	R11CPA
Rena Pulse Tubing	Braintree Scientific	RPT-040
Infusion Swivel	Instech Solomon	375/D/22
Swivel Support Arm & Mount	Instech Solomon	SMCLA
Polysulfone button	Instech Solomon	LW62S/6
Stainless steel spring	Instech Solomon	PS62
Vetbond surgical adhesive	3M	n/a
Triple Antibiotic Ointment	Fougera	n/a
PowerLab 8 Channel Data Acquisition System & Software	ADInstruments	PowerLab 8/35
PVC Insulated Cable	Belden	PVC Audio Connection Cable 32 AWG
Preamplification Headstage	Dagan Corporation	Model 4002
Differential Amplifier	Dagan Corporation	EX4-400
Sodium Nitroprusside	Sigma Aldrich	71778-25G
Phenylephrine	Sigma Aldrich	P6126-5G
Sterile Physiological Saline 0.9% NaCl	Beckton Dickinson		Contact local hospital supplier
hexamethonium	Sigma Aldrich	H0879-5G
Stainless Steel top anti vibration table	n/a	n/a	Custom designed in-house; Solid steel plate on a benchtop is also suitable
Faraday cage	n/a	n/a	Custom designed and constructed in-house
Small animal hair trimmer	n/a	n/a	Drugstore, men's beard trimmer suitable
Dipilatory Cream	n/a	n/a	Veet brand, sensitive skin formula
10% Povidone Iodine	Purdue Products	Betadiene
70% Ethanol	n/a	n/a
Steel microretractors	n/a	n/a	Made in-house. Bend a steel paper clip & loop 4-0 silk to form a retractor
Hemostats	Fine Science Tools	13011-12
Heat Gun	Fisher Scientific	09-201-27