Nouvelle approche pour l’enregistrement simultané de l’activité nerveuse sympathique rénale et de la pression artérielle avec une perfusion intraveineuse, conscients, souris sans retenue.

Résumé

Anesthésiés souris présentent artérielle systémique non physiologiques, qui s’oppose à une évaluation pertinente de tonus autonome étant donné la relation intime entre la pression artérielle et le système nerveux autonome. Ainsi, une nouvelle méthode pour l’activité nerveuse sympathique rénale en même temps record et la pression artérielle avec une perfusion intraveineuse chez des souris conscientes est exposée.

Résumé

Les nerfs sympathiques rénaux contribuent de manière significative à des phénomènes physiologiques et physiopathologiques. Évaluation de l’activité nerveuse sympathique rénale (RSNA) est d’un grand intérêt dans de nombreux domaines de recherche tels que l’insuffisance rénale chronique, hypertension, insuffisance cardiaque, le diabète et l’obésité. Évaluation sans équivoque du rôle du système nerveux sympathique est donc impérative pour la bonne interprétation des résultats expérimentaux et de la compréhension des processus morbides. RSNA a été traditionnellement mesurée chez les rongeurs anesthésiés, y compris la souris. Cependant, souris habituellement présentent une pression artérielle systémique très basse et une instabilité hémodynamique pendant plusieurs heures pendant l’anesthésie et la chirurgie. Une interprétation significative de RSNA est confondue par cet État non physiologiques, étant donné la relation intime entre tonus nerveux sympathique et l’État cardiovasculaire. Pour remédier à cette limitation des approches traditionnelles, nous avons développé une nouvelle méthode pour mesurer la RSNA chez les souris conscients, se déplaçant librement. Souris ont été instrumentés chroniquement avec radio-télémètres pour la surveillance continue de la pression artérielle ainsi qu’un cathéter veineux jugulaire et électrode bipolaire sur-mesure pour un enregistrement direct de la RSNA. Après une période de récupération de 48 à 72 heures, le taux de survie était de 100 % et toutes les souris se sont comportés normalement. À ce moment, RSNA a été avec succès enregistré dans 80 % des souris, avec des signaux viables acquis jusqu'à 4 et post-chirurgie de 5 jours à 70 % et 50 % des souris, respectivement. Les pressions sanguines physiologiques ont été enregistrées dans toutes les souris (116±2 mmHg ; n = 10). RSNA enregistré a augmenté à manger et de toilettage, aussi bien établi dans la littérature. En outre, RSNA a été validée par un blocage ganglionnaire et modulation de la pression sanguine avec les agents pharmacologiques. Ici, une méthode efficace et facile à gérer pour un enregistrement clair de RSNA chez les souris conscients, se déplaçant librement est décrite.

Introduction

Intérêt à utiliser la souris dans plusieurs domaines de la recherche biomédicale poursuit son expansion avec le développement d’innombrables modèles issus du génie génétique. Pour la plupart, ont suivi le rythme des progrès techniques avec l’utilisation croissante des souris en physiologie et il y a maintenant un choix impressionnant d’appareils miniaturisés développé spécifiquement pour mesurer des paramètres physiologiques importants chez les souris. Bien que les appareils télémétriques pour une mesure du système nerveux autonome directement tonus nerveux chez le rat conscient ont été disponibles pour plus d’une décennie, des appareils miniaturisés pour l’évaluation de l’activité nerveuse chez des souris conscientes ne sont actuellement pas disponibles. Les enquêteurs généralement contourner cette limitation en évaluant la contribution du système nerveux autonome avec des méthodes indirectes (plasma ou l’urine catécholamines, blocage autonome pharmacologique, analyse spectrale des profils de sang pression/pouls)¹.

Alors que ces approches fournissent des informations précieuses, le résultat est une image globale de tonus autonome dans l’ensemble, plutôt que de révéler la contribution discrète des populations isolées des nerfs au phénomène incriminés. Alternativement, un enregistrement direct de l’activité des nerfs spécifiques a été exécuté chez des souris anesthésiés, qui pose une multitude de préoccupations. Il est extrêmement difficile de maintenir la pression artérielle stable dans les limites physiologiques chez une souris anesthésiée pendant plusieurs heures après la chirurgie. En effet, dans ces types d’expériences, la pression artérielle est souvent inédit ou présentée à très faibles doses (c.-à-d. 60-80 mmHg vs > 100mmHg chez une souris consciente)². La fragilité du système cardio-vasculaire exposée dans une préparation de souris anesthésiés souvent s’oppose à une évaluation pertinente de l’activité nerveuse autonome, étant donnée la relation de codépendance entre la pression sanguine et le tonus sympathique^{3, 4}.

Pour combler cette lacune, une nouvelle méthode pour un enregistrement direct de l’activité nerveuse sympathique rénale (RSNA) conscients, souris sans retenue, non perturbés dans leurs cages d’accueil a été développé. Aussi bien l’approche chirurgicale et expérimentaux pour la mise en œuvre réussie de cette technique est décrite en détail. Cette préparation permet à l’enquêteur enregistrer simultanément la pression artérielle par l’intermédiaire de radiotélémétrie outre RSNA, avec la capacité supplémentaire d’insuffler par voie intraveineuse des agents d’intérêt sans déranger la souris.

Vingt-quatre heures après la chirurgie, la souris se comporter normalement et ne présentent pas de signes de douleur ou de détresse. Enregistrements expérimentaux peuvent alors commencer post-chirurgie de 48 à 72 heures tandis que la souris se repose confortablement dans sa cage maison avec accès illimité à la nourriture, l’eau et l’enrichissement environnemental. Claire RSNA traces sont présentés et les réponses caractéristiques de cette population de nerf à des mouvements physiques normaux de l’animal (comme manger et toilettage) sont illustrés en plus de la modulation pharmacologique de la pression artérielle systémique. La qualité et la spécificité du signal RSNA est également validée par un blocage ganglionnaire. Ce manuscrit comprend le complément audiovisuel à une description publiée initialement de cette technique⁵.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales sont en conformité avec le Guide National des instituts de santé pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le Comité de l’utilisation du centre médical de l’Université du Mississippi et d’institutionnels animalier.

1. les animaux et du logement

1. Souris domestiques (24-35 g) à son arrivée à l’animalerie de laboratoire institutionnel.
2. Offre souris standard chow rongeur et ad libitum à toutes les étapes du protocole expérimental dans un environnement contrôlé la température et l’humidité de l’eau du robinet.

2. sur mesure Fabrication de l’électrode de la RSNA implantables

NOTE : Construire l’électrode RSNA implantable au moins quelques jours avant l’intervention chirurgicale prévue pour accueillir le temps de séchage et stérilisation (décrit ci-dessous).

1. Coupez trois longueurs égales d’isotherme inox multiple-torons, chaque 250 mm (diamètre du fil nu 0,0254 mm, 0,14 mm revêtu). Utilisez une lame de bistouri Swann-Morton (préférence #11) pour enlever environ 15 mm du matériau isolant pour exposer le métal sous-jacent d’un bout de chacune des longueurs de fil.
   1. Souder un connecteur à broches mâle unique (laiton avec dorure) jusqu’au bout dénudé de seulement deux des fils pour créer les fils des électrodes bipolaires (Figure 1 a). Laissez la fin de la troisième longueur de fil libre. Cette zone fonctionne comme le fil de terre.
   2. Glisser un court (~2.0 - 2,5 cm) bout de tube thermorétractable en diamètre 1,6 mm sur le connecteur et le fil pour couvrir complètement le joint soudé nouvellement entre le connecteur de fil et de pin.
      Remarque : L’extrémité du connecteur pin qui doit être connecté à l’amplificateur préamplificateur doit rester apparentes.
   3. Tenir le fil au-dessus d’un pistolet à air chaud avec une paire de petites pinces ou une pince hémostatique de la gaine thermorétractable sensibles à la chaleur et les isoler électriquement la connexion entre le connecteur et le fil. Répétez la procédure pour le deuxième câble/connecteur.
2. Couper une longueur de 200 mm de tuyaux en polyéthylène (PE 90 ; diamètre intérieur 0,86 mm, diamètre extérieur 1,27 mm). Regrouper les trois fils (deux conduit + fil de terre) et introduire les extrémités intactes dans le tuyau PE 90, en les enfilant ensemble par le biais de l’extrémité ouverte du tube (Figure 1 b).
   Remarque : Le PE 90 tubes fonctions comme une gaine pour regrouper et protéger l’électrode conduit et un câble de masse.
   1. Identifier le fil de terre et les passer dans la gaine PE 90 un peu plus loin pour la distinguer des fils des électrodes bipolaires.

3. construction de la pointe de l’électrode

1. Visualiser les extrémités intactes des fils électrode avec un microscope à dissection. Visser les deux trois bouts de l’électrode à travers un morceau long de 5 mm - de petit tuyaux en polyéthylène (PE 10, diamètre intérieur 0,28 mm, diamètre extérieur 0,61 mm) pour unir les fils de l’électrode.
   1. Enfiler un morceau de 1,5 mm de ce tube PE 10 sur les fils de trois électrodes. Faire progresser cette tubulure pour se reposer à 2,0 mm de la pièce initiale de 5 mm de 10 PE.
   2. Enfiler un deuxième morceau de 1,5 mm de tube PE 10 sur les bouts des deux cordons électrode bipolaire pour couvrir et isoler les conseils et les séparer le fil de terre (Figure 1).
2. Coupez toute longueur excessive des fils avec des ciseaux.
3. Coller les différents morceaux de tube PE 10 pour les fils de l’électrode avec une petite goutte de colle cyanoacrylate formule liquide. Placer une aiguille de 25 calibre atténuée à l’extrémité du tube de colle pour mieux contrôler et réduire les déversements.
   1. Placez la pointe de l’aiguille à la jonction entre le PE 10 et le fil, puis déposer une petite goutte de colle et visualiser colle revêtement à l’intérieur du tube PE.
   2. Lorsque la colle guérir complètement du jour au lendemain.

4. belle préparation de pointe de l’électrode pour l’enregistrement

1. Enlever le revêtement isolant les extrémités des électrodes bipolaires et l’extrémité du fil au sol avec une lame de bistouri #11. Ne pas déranger ou endommager le sous-jacent plusieurs torons que cela affectera la qualité du signal RSNA.
2. Grip l’électrode construite entre le 5,0 mm et 1,5 mm PE 10 ancres avec curved forceps et plier les fils pour former un angle de 90° (Figure 1).
   NOTE : Cette manoeuvre devrait placer les fils des électrodes bipolaires au-dessus du fil de terre, dans une position optimale pour le paquet de nerf du berceau.

5. construction du socle d’ancrage

1. Construire un piédestal pour stabiliser l’électrode mène à la région scapulaire milieu de la souris sur l’extériorisation de découper un morceau de 3 cm de tuyaux en polyéthylène (diamètre intérieur 2,70 mm, diamètre extérieur 4.00 mm).
   1. Saisir le tube avec une pince et fondez une extrémité au-dessus d’un pistolet à air chaud. Appuyez sur l’extrémité chauffée du tube perpendiculairement à une surface métallique cool pour créer une crête arrondie ou « bride ».
   2. Visser le socle sur l’électrode construit, tels que la bride est orientée vers le bout de l’électrode.
      Remarque : La combinaison de la gaine PE 90 et piédestal protégera les fils des électrodes une fois extériorisées de l’animal.

6. la stérilisation de l’électrode Implantable dûment rempli

1. Forfait l’électrode rempli individuellement dans des sachets de stérilisation et de l’ozone stériliser (TSO₃) avant l’implantation.
   Remarque : Consulter installation de stérilisation d’hôpital local au sujet d’un type spécifique de sachet de stérilisation et de la procédure comme cela diffère entre les institutions.

7. anesthésie et préparation à la chirurgie

1. Administrer une analgésie 20 minutes avant le début de la chirurgie (meloxicam 2 mg/kg, S.C.). Placez votre souris dans une chambre à induction infusée avec l’oxygène de qualité médicale 100 %. Effectuez les réglages de vaporisateur pour augmenter le pourcentage d’isoflurane anesthésique par incréments de 0,5 à 4 %. Évaluer le plan chirurgical en évaluant la réponse réflexe à une légère pression appliquée aux orteils ou pieds tampons de fore et postérieurs des membres ainsi que de ralentissement de la fréquence respiratoire.
   1. Transférer l’animal dans la table d’opération chirurgicale et maintenir l’anesthésie à l’isoflurane de 1,5 à 2 % par une ogive, lorsqu’il a atteint le plan chirurgical et pièces n’est plus le réflexe d’orteil-pincement. Répéter la réponse d’orteil-pinch périodiquement et d’évaluer la fréquence respiratoire pendant toute la procédure chirurgicale. Pommade ophtalmique aux yeux à prévenir le dessèchement.
   2. Maintenir la température normale du corps de l’animal en tout temps avec coussins chauffants isotherme rempli de gel et de la table d’opération chirurgicale correspondante. Stocker des blocs isothermes dans un bain-marie à 37° C et remplacer les plaquettes aussi souvent que nécessaire pendant l’intervention pour maintenir la température physiologique du corps.
   3. Administrer le glycopyrrolate (50 à 70 µg/kg, par voie sous-cutanée (S.C.)) afin d’éviter une production excessive de sécrétions des voies aériennes immédiatement après l’induction de l’anesthésie. Administrer cette dose de glycopyrrolate une seconde fois au milieu de l’intervention chirurgicale (étape 9.1).
   4. Effectuer toutes les interventions chirurgicales dans des conditions aseptiques. S’assurer que tous les instruments chirurgicaux ont été stérilisés à l’autoclave avant la chirurgie programmée. Nettoyer le champ chirurgical comme décrit ci-dessous (7.2.1) et maintenir la stérilité tout au long de la procédure.
      1. Porter un masque facial, robe d’isolement autoclavables et gants stériles, non réutilisables. Nettoyer tous les gros appareils tels que lampe col de cygne, disséquant la portée et la table d’opération chirurgicale avec l’éthanol à 70 %. Périodiquement au cours de la procédure, appliquer l’éthanol à 70 % pour les gants chirurgicaux pour assurer la stérilité.
2. Enlever les poils de l’animal flanc gauche, région du cou ventrale et dorsale midscapular région avec une tondeuse de petits poils suivie d’une crème dépilatoire (formule peaux sensibles).
   1. Nettoyer la peau de ces deux champs opératoires avec 3 alternant les applications de la solution de nettoyage chirurgicale (10 % polyvidone iodée) et 70 % d’éthanol. Préparer le champ chirurgical avec une application finale de la solution de nettoyage chirurgicale.

8. chirurgie implantatoire de l’électrode de la RSNA

1. Positionnez la souris sur son côté droit avec l’extrémité rostrale pointant vers la gauche du chirurgien, exposant le flanc gauche de l’animal. Faire une incision de 5 mm dans la peau de la région de midscapular avec un scalpel (#11).
   NOTE : Ceci est le site où les fils des électrodes RSNA vont être extériorisées.
   1. Pratiquez une seconde incision (< 20 mm) dans la peau recouvrant le flanc gauche, perpendiculairement à la colonne vertébrale et la caudale à la cage thoracique de 2 mm. Tunnel d’une aiguille en acier inoxydable de 13G par voie sous-cutanée de cette incision à l’incision sur le site de sortie dorsale.
      NOTE : Déposer les arêtes vives de l’aiguille pour laisser une surface lisse, non tranchant.
   2. Passer l’électrode stérilisé de la RSNA implantable (étapes 2 - 6) par l’aiguille de 13G. Tirez l’aiguille de 13G pour laisser la pointe de l’électrode se trouvant sur le muscle abdominal du flanc gauche. Laissez un segment de l’électrode conduit se trouvant sous la peau et laissez les longueurs restants émergeant de l’incision dorsale.
2. Placez la pointe de l’électrode sur le côté. Faites une incision dans le muscle abdominal directement qui sous-tendent l’incision cutanée en 8.1.1. Séparer la graisse et les tissus conjonctifs le long du muscle arrière avec petites cotons-tiges pour exposer le rein gauche.
   1. Ouvrez le champ chirurgical avec micro-rétracteurs et rétracter le rein. Ne pas pour étirer le paquet de rénale vasculo-nerveux, qui sera irrémédiablement endommager les nerfs rénaux et empêche l’enregistrement d’un signal RSNA viable.
      Remarque : En acier micro-écarteurs peuvent être façonnés à partir d’un trombone standard et d’une longueur de soie de 4-0. S’assurer que ces rétracteurs sont également stérilisés avec les instruments chirurgicaux afin de préserver l’asepsie.
3. Visualiser le paquet de vasculo-nerveux rénale à l’aide d’un binoculaire de haute puissance. Identifier le bundle nerveuse rénale, qui en général (mais pas toujours) longe l’artère rénale et la veine. Disséquer le faisceau nerveux les tissus environnants avec une pince fine et droite.
   Remarque : Le bundle nerveuse rénale apparaît opaque, avec une « corde » réfléchissante apparence, unique par rapport aux vaisseaux lymphatiques, qui apparaissent clairement.
   1. Manipuler le faisceau de nerfs aussi peu que possible. Ne pas toucher, étirer ou ramasser le faisceau de nerfs à tout moment. Ne perturbent pas les vaisseaux sanguins fines fournissant le nerf ou le conduit lymphatique rénale car cela va compromettre la viabilité du nerf et produire la lymphe continue liquide mise en commun autour de l’électrode de nerf /, qui vont entraver ou oblitérer complètement le signal nerveux.
   2. Congé le faisceau de nerfs rénaux intact, qui aidera à préserver la viabilité à long terme du nerf ainsi que de maintenir un contact stable entre le nerf et l’électrode (c.-à-d. un nerf sectionné peut glisser hors d’électrodes avec le temps et les mouvements naturels du corps).
4. Introduire la pointe d’électrode RSNA dans l’abdomen. Régler sa position de sorte que le fil électrode bipolaire de pointe et le sol sont perpendiculaires au paquet vasculo-nerveux rénale. Encore régler la position de l’électrode tels que le fil de terre a bon contact avec les tissus sous-jacents et l’électrode ne compresse pas les vaisseaux rénaux, compromettre la circulation rénale (Figure 1).
5. Soulevez le bundle nerveuse rénale avec une pince coudée. Glisser la pointe de l’électrode sous le nerf, laissant le nerf en contact direct avec les deux fils.
   1. Glisser un petit morceau de pellicule de paraffine entre les fils de nerf/bipolaire et le troisième fil (Terre) (Figure 1).
      Remarque : Soak stériliser le film de paraffine dans l’éthanol à 70 % pendant 24 heures et rincer au sérum physiologique stérile avant l’implantation.
   2. Supprimer n’importe quel sang ou liquide autour le nerf/électrode avec de l’absorbant petite lances que n’importe quel liquide à gauche autour du nerf ou fils électrode vont gêner ou éteindre le signal nerveux.
   3. Tester rapidement la qualité du signal RSNA si vous le souhaitez (l’installation décrite ci-dessous).
      Remarque : Cela doit être fait rapidement comme l’exposition à l’air séchera le nerf et compromettre sa viabilité.
   4. Appliquer un élastomère de silicone bi-composants à l’unité nerf/électrode, en veillant à ce que les piscines de silicone sous et autour du nerf pour assurer une isolation électrique complète (et non pas simplement une goutte sur le dessus du nerf).
      Remarque : Assurez-vous que les extrémités des électrodes sont également enduites dans le silicone. Le fil de terre doit rester en contact avec les tissus sous-jacents et donc élastomère n’a pas besoin de piscine sous ce fil. Éviter d’appliquer un montant sur-dimensionné de l’élastomère de silicone, car cela peut potentiellement entraver le débit sanguin rénal, ou se déplacer avec les mouvements naturels du corps avec le temps.
   5. Laisser 1-2 minutes pour l’élastomère de silicone guérir complètement, puis soigneusement soulever les bords extérieurs du silicone « glob » avec une pince et appliquez une petite quantité de liquide formule colle chirurgicale.
      Remarque : prenez soin de ne pas pour appliquer une quantité excessive de cette colle, car cela peut nuire à la circulation ou se propager au nerf et compromettre sa viabilité.
6. Refermer l’incision abdominale avec sutures discontinus, résorbables (5-0). Fermer la peau sus-jacente de la même façon avec le même matériel de suture.

9. l’implantation de la tension artérielle Radiotelemeter

1. Repositionner la souris sur le dos, avec l’extrémité rostrale pointant vers le chirurgien. Ajustez l’ogive anesthésie selon vos besoins. Administrer la deuxième dose de glycopyrrolate à ce stade (voir 7.1.3).
2. Faire une incision médiane dans la peau de la région du cou avec un scalpel (#11), partant juste en dessous de la mâchoire inférieure de l’animal et qui s’étend juste au-dessus de la cage thoracique. Séparer le tissu glandulaire pour exposer les muscles sous-jacents du cou. Exposer l’artère carotide commune gauche et séparer les tissus environnants.
   Remarque : Prenez grand soin de ne pas endommager le nerf vague, comme cela peut conduire à une augmentation de la mortalité post-opératoire.
   1. Passer trois pièces de matériel de suture en soie de 6-0 en dessous de l’artère. Positionner une suture autant rostralement possible et attachez-le pour occlure le navire. Placer un deuxième à mi-chemin de suture sur la longueur du navire et attacher lâchement. Positionner la dernière suture en direction caudale possible et attacher lâchement.
   2. Rétracter la suture plus rostral et fixez-le à la pointe avec un petit morceau de bande ombilicale. Rétracter la suture caudale plus avec une pince micro-moustique pour restreindre le flux sanguin dans le vaisseau.
   3. Faire une petite incision dans la paroi des vaisseaux avec des ciseaux de printemps parfait comme rostralement que possible. Introduire le cathéter de radiotelemeter de la pression artérielle de souris dans le navire et l’avance à la suture caudale.
      1. Attacher la suture médiane pour temporairement stabiliser le cathéter, libérer la rétraction caudale et faire avancer la suture cathéter mm 10. cravate autour de cathéter pour la fixer.
   4. Tunnel du corps télémètre à une poche sous-cutanée sur le flanc droit.

10. l’implantation et l’extériorisation du cathéter veineux jugulaire

1. Utiliser petites cotons-tiges pour exposer la veine jugulaire droite. Passez deux pièces de matériel de suture en soie de 6-0 autour du navire.
   1. Positionner une suture autant rostralement comme possible et cravate d’occlure le navire. Positionner la seconde suture en direction caudale possible et rentrer doucement pour arrêter la circulation sanguine dans le vaisseau.
   2. Utiliser des ciseaux de printemps parfait pour faire une petite incision dans la paroi des vaisseaux plus près de la suture rostrale que possible. Section de la veine avec tube étiré à la chaleur (O.D. 1,02 mm, s’étendu à OD 0,64 mm), qui est pré rempli de sérum physiologique stérile.
      Remarque : Assurez-vous que l’extrémité du cathéter est découpée avec un scalpel pour produire un biseau arrondi afin d’éviter la perforation vasculaire. Déterminer le volume de liquide dans le cathéter (espace mort) pour consultation (voir étapes 14,4-14,6 ci-dessous).
      1. Avancez la sonde ~ 8 mm dans la veine. Fixer le cathéter en liant les sutures en soie autour du navire et cathéter, ainsi que la demande d’une petite goutte de colle cyanoacrylate formule gel.
2. Placez votre souris sur son côté gauche. Tunnel du cathéter intraveineux au cou pour sortir à la région dorsale de midscapular à l’aide d’une aiguille d’acier inoxydable de 13G.
3. Repositionner la souris sur son dos. Refermer l’incision de cou avec des sutures discontinus.
4. Placez l’animal en position couchée. Visser un petit bouton sous-cutanée sur le cathéter veineux. Fixez le bouton sous la peau avec des sutures. Enfilez le ressort en acier inoxydable correspondant sur le cathéter veineux et fixez-le à la touche de peau pour protéger le cathéter.

11. fixation extériorisé électrode conduit

1. Fixez le socle polyéthylène protégeant que l’électrode mène vers le muscle sous-jacent avec l’adhésif de tissu. Suturer la peau sus-jacente sur la bride pour une aide supplémentaire.

12. après une chirurgie récupération

1. Pommade antibiotique à toutes les incisions.
2. Administrer des médicaments analgésiques. Administrer des doses supplémentaires de médicament analgésique au besoin au cours de la période de récupération si l’animal montre des signes de douleur ou de détresse.
3. Placez votre souris dans une cage métabolique bordée de litière de copeaux de bois et de papier absorbant pour récupérer. Surveiller en permanence l’animal et ne le laissez pas sans surveillance jusqu'à ce qu’il reprend conscience et peut maintenir décubitus sternal. Introduire l’enrichissement environnemental et de nourriture et d’eau (ad libitum) à ce stade.
4. Électrode de bobine mène à l’extérieur de la cage jusqu’au moment de l’expérience.
5. Placer la cage sur une bouillote chaude pendant les premières 24 heures de récupération. Connecter ressort en acier inoxydable et cathéter intraveineux à un système de pivot/perfusion perfusion continue de sérum physiologique au cours de la période de récupération (0,5 mL/h).
6. S’assurer que l’animal reste individuellement logé dans une cage dédiée en raison de la nature du cathéter extériorisé et électrode conduit.

13. experimental Setup pour enregistrement artérielle et de la RSNA

1. Équiper une table anti-vibration supérieure d’inox avec une simple cage de Faraday.
   Remarque : Cette cage de Faraday peut être construite avec un maillage d’écran aluminium et cadre en bois. Électriquement à la terre la cage de table/Faraday pour éliminer tout bruit électrique.
2. Placer un récepteur de télémétrie de la pression artérielle dans la cage de Faraday.
3. Connectez le récepteur de télémétrie à l’adaptateur de sortie de pression. Connectez cet adaptateur à un système d’acquisition de données pour enregistrer la pression artérielle en ligne.
4. Deux connecteurs à broches femelle souder qui vous sont offertes à l’électrode mâle connecteurs (laiton avec dorure) aux extrémités d’un PVC apparié, blindé câble isolant. Souder les extrémités opposées de ce câble jumelé à fiches bananes. Connecter les fiches bananes à un préamplificateur preamplification (amplification de X 10).
5. Connectez ce préamplificateur à un amplificateur différentiel. Ajuster les paramètres pour amplifier au signal du nerf x10, 000. Ajuster les paramètres de filtre comme suit : Low cut, 100Hz ; Coupe haute, 1000Hz.
6. Placez la cage contenant la souris sur le récepteur de télémétrie, situé à l’intérieur de la cage de Faraday 48 à 72 heures après la chirurgie. Tourner sur la sonde de télémétrie pour enregistrer les signaux de tension artérielle.
   NOTE : Acclimater la souris en plaçant la cage dans l’installation au cours d’une semaine avant l’intervention chirurgicale est optimale.
7. Dérouler les câbles d’électrode et branchez les connecteurs de l’électrode bipolaire correspondant connecteurs à broches femelle décrits ci-dessus (13,4) pour lancer l’enregistrement RSNA.
8. Afficher et enregistrer simultanément des signaux de tension artérielle en ligne avec un ordinateur, tout en insufflant la solution d’intérêt ou de sérum physiologique. Enregistrer des données à une vitesse minimale de 2500 échantillons par seconde.

14. l’échantillon expérimental et Validation du Signal de la RSNA

1. S’assurer que les souris sont confortables dans leur cage maison, débridé avec libre accès à la nourriture et l’eau. Suivre les directives de soins institutionnels des animaux pour vérifier le comportement et l’apparence normale.
2. Maison des souris dans la même température et de la salle humidité contrôlée dans laquelle RSNA enregistrement aura lieu. Assurer une perfusion intraveineuse continue tel que décrit ci-dessus.
3. Laissez au moins 30 minutes de stabilisation une fois que l’animal se trouve dans les paramètres d’enregistrement décrit ci-dessus avant d’enregistrer une heure de référence la pression artérielle et les données de la RSNA. S’assurer que l’animal est au repos tranquillement pendant l’enregistrement, étant donné que le mouvement naturel est associée par augmentation du tonus sympathique. Remarque Lorsque l’animal se déplace directement sur la trace numérique pendant l’enregistrement, donc cela peut être négligé lors de l’analyse.
4. Tester la réponse baroréflexe d’abord lentement l’injection d’un bolus de nitroprussiate de sodium (2,5 µg/g de poids de corps dans un volume de 25 µL de sérum physiologique) dans la ligne de perfusion. Lentement, purger la ligne avec sérum physiologique de ~ 50 µL. Assurez-vous l’espace mort de cathéter est désactivée. Enregistrer la pression artérielle et RSNA pendant 2 à 5 minutes.
5. Injecter lentement un bolus de phényléphrine (20 µg/g de poids corporel chez les 25 µL de sérum physiologique). Rincer avec sérum physiologique de ~ 50 µL. Assurez-vous l’espace mort de cathéter est désactivée. Enregistrer la pression artérielle et la RSNA pendant encore 10 à 15 minutes.
6. Vérifier la nature post-ganglionnaires du signal du nerf en injectant lentement un bolus du bloqueur ganglionnaire, hexaméthonium (50 µg/g de poids corporel dans une solution saline de 25 µL) dans la ligne de perfusion. Rincer avec du sérum physiologique de la ~ 50 µL. Assurez-vous l’espace mort de cathéter est désactivée. Continuer l’enregistrement pendant plusieurs minutes.
7. Utilisez l’activité résiduelle qui reste après l’administration d’hexaméthonium comme une estimation du bruit de fond pour une utilisation dans l’analyse de la RSNA (décrit ci-dessous).
8. Euthanasier la souris avec une surdose d’isoflurane (posologie progressive par incréments de 0,5 jusqu'à 5 %) et continuer pendant encore 30 minutes d’enregistrement RSNA. Remarque : Le signal restant peut également être utilisé comme une estimation du bruit de fond pour l’analyse de la RSNA.

15. analyse

1. Utilisation logiciel d’acquisition de données pour analyser les brutes la pression artérielle et des traces RSNA.
   1. Intégrer numériquement et pleine onde rectifier la trace RSNA brute à l’aide de ce logiciel. Sélectionnez « Absolu intégral » pour les paramètres de l’intégrale ; appliquer une décroissance constante de temps de 0,1 seconde⁶.
   2. Analyser le signal RSNA intégré (affiché en unités de µV·s) pour chaque segment du protocole expérimental. Ne pas tenir compte des segments de l’enregistrement quand l’animal est arrivé à se déplacer. Prendre au moins 3 mesures pour référence et parties expérimentales de l’expérience, respectivement.
   3. Analyser la RSNA au niveau de la pression artérielle minimale et maximale atteint pour le nitroprussiate de sodium ou de la phényléphrine, respectivement pour évaluer la sensibilité baroréflexe.
   4. Moyenne des mesures individuelles prises ci-dessus pour chaque partie du protocole expérimental pour donner une seule valeur.
   5. Quantifier la réponse de la RSNA en calculant le taux de variation de la RSNA de ligne de base, qui est désigné à 100 %⁷. Analyse statistique complète selon le cas.
      Remarque : Dans cet exemple, l’analyse statistique de la réponse de la RSNA au nitroprussiate de sodium et la phényléphrine a été achevée avec un test de Student t ; signification a été acceptée avec les valeurs de P < 0,05.

Résultats

Suivant le protocole décrit, le taux de survie était de 100 % - toutes les souris instrumentés dans cette étude ont survécu et récupéré bien après l’intervention chirurgicale. Dans les 24 heures de préparation chirurgicale, toutes les souris s’est comportés normalement, exposer à manger typiques, des comportements de toilettage et exploratoires. Aucun animal n’a montré aucun signe de douleur ou de détresse en ce moment. 48 heures après la chirurgie, un signal clair et...

Discussion

Ci-après nous avons exposé, démontré et validé une nouvelle méthode d’évaluation ciblée de la RSNA chez des souris conscientes, libres de se déplacer et reposer confortablement dans leur maison. Suite à l’implantation chirurgicale d’un radiotelemeter de la pression artérielle, un cathéter de perfusion intraveineuse demeure et une électrode bipolaire sur-mesure à RSNA, souris récupéré de la chirurgie et ont été laissés intacts pendant 48 à 72 heures. Souris est restée confortablement établis d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Teflon-coated stainless steel multiple stranded wire	A-M Systems	793200	0.001in diameter bare; 0.0055in diameter coated
#11 Scalpel Blade	Fisher Scientific	ALMM9011
Soldering Iron and solder			Any make or model suitable
Male miniature pin connectors	A-M Systems	520200	Brass with gold plating
Female miniature pin connectors	A-M Systems	520100	Brass with gold plating
Heat Shrink tubing	Radio Shack	Model #: 278-1610 | Catalog #: 2781610	1.6 mm diameter
Polyethylene 90 (PE90) tubing	VWR	CA-63018-703	0.86mm inner diameter; 1.27mm outer diameter
Dissecting microscope	Leica Microsystems	Leica M80	Any make or model also suitable
Polyethylene 10 (PE10) tubing	Braintree Scientific	PE10 50 FT	0.28mm inner diameter; 0.61mm outer diameter
Super Glue Liquid	Loctite	n/a	Liquid Formula; any brand suitable
Super Glue Gel	Loctite	n/a	Gel Formula; any brand suitable
Polyethylene tubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/13	For pedestal 2.7mm inner diameter; 4.0mm outer diameter
Hospital Sterilization Services & Ozone Sterilization packets			Contact local hospital sterilization services
Isoflurane anesthesia	Abbott	05260-05
Deltaphase isothermal heat pads & surgical table	Braintree Scientific	39OP	Keep heat pads warm in a 37°C water bath; Corresponding surgical table essential
Glycopyrrolate	Amdipharm Mercury Company Limited	n/a
Isoflurane vaporizer system & flow gauge	Braintree Scientific	VP I	Include medical grade oxygen supply
Tissue scissors	Fine Science Tools	14173-12
Fine spring scissors	Fine Science Tools	15006-09
Small cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23400100
Fine Straight Forceps	Fine Science Tools	11254-20	#5, FST by Dumont Biologie Tip
Angled Forceps	Fine Science Tools	11251-35	#5/45 FST by Dumont
Small Absorbent Spears	Fine Science Tools	18105-03
Parafilm	Sigma Aldrich	BR701605 ALDRICH
Kwik-Sil 2 component Silicone Polymer	World Precision Instruments (WPI)	KWIK-SIL	Purchase extra specialized tips from WPI
5-0 Polysorb Suture	Tyco Healthcare	n/a
6-0 Silk Suture	Braintree Scientific	SUT-S 104	Deknatel brand, spool
Radiotelemetry Probe	Data Sciences International (DSI)	TA11-PAC10
Radiotelemetry Receiver	Data Sciences International (DSI)	PhysioTel RPC-1
Ambient Pressure Reference	Data Sciences International (DSI)	Apr-01
Pressure Output Adapter	Data Sciences International (DSI)	R11CPA
Rena Pulse Tubing	Braintree Scientific	RPT-040
Infusion Swivel	Instech Solomon	375/D/22
Swivel Support Arm & Mount	Instech Solomon	SMCLA
Polysulfone button	Instech Solomon	LW62S/6
Stainless steel spring	Instech Solomon	PS62
Vetbond surgical adhesive	3M	n/a
Triple Antibiotic Ointment	Fougera	n/a
PowerLab 8 Channel Data Acquisition System & Software	ADInstruments	PowerLab 8/35
PVC Insulated Cable	Belden	PVC Audio Connection Cable 32 AWG
Preamplification Headstage	Dagan Corporation	Model 4002
Differential Amplifier	Dagan Corporation	EX4-400
Sodium Nitroprusside	Sigma Aldrich	71778-25G
Phenylephrine	Sigma Aldrich	P6126-5G
Sterile Physiological Saline 0.9% NaCl	Beckton Dickinson		Contact local hospital supplier
hexamethonium	Sigma Aldrich	H0879-5G
Stainless Steel top anti vibration table	n/a	n/a	Custom designed in-house; Solid steel plate on a benchtop is also suitable
Faraday cage	n/a	n/a	Custom designed and constructed in-house
Small animal hair trimmer	n/a	n/a	Drugstore, men's beard trimmer suitable
Dipilatory Cream	n/a	n/a	Veet brand, sensitive skin formula
10% Povidone Iodine	Purdue Products	Betadiene
70% Ethanol	n/a	n/a
Steel microretractors	n/a	n/a	Made in-house. Bend a steel paper clip & loop 4-0 silk to form a retractor
Hemostats	Fine Science Tools	13011-12
Heat Gun	Fisher Scientific	09-201-27