Nuovo approccio per la registrazione simultanea di attività simpatica renale del nervo e pressione del sangue con l'infusione endovenosa in consapevole, topi sfrenati.

Riepilogo

Topi anestetizzati mostrano non-fisiologica pressione arteriosa sistemica, che preclude una valutazione significativa del tono autonomo dato l'intima relazione tra pressione sanguigna e il sistema nervoso autonomo. Così, è descritto un metodo novello per attività simpatica renale contemporaneamente record del nervo e pressione del sangue con l'infusione endovenosa in topi coscienti.

Abstract

Nervi simpatici renali contribuiscono notevolmente a fenomeni sia fisiologici e patofisiologici. Valutazione attività renale del nervo simpatico (RSNA) è di grande interesse in molti settori della ricerca, come la malattia renale cronica, ipertensione, insufficienza cardiaca, diabete e obesità. Inequivocabile valutazione del ruolo del sistema nervoso simpatico è dunque indispensabile per una corretta interpretazione dei risultati sperimentali e la comprensione dei processi di malattia. RSNA è stato tradizionalmente misurato nei roditori anestetizzati, tra cui topi. Tuttavia, topi esibiscono solitamente molto bassa pressione arteriosa sistemica e instabilità emodinamica per diverse ore durante l'anestesia e la chirurgia. Interpretazione significativa del RSNA è confuso da questo stato non-fisiologica, dato l'intimo rapporto tra tono nervoso simpatico e stato cardiovascolare. Per risolvere questa limitazione degli approcci tradizionali, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per la misurazione RSNA in topi coscienti, liberi di muoversi. Topi cronicamente sono stati strumentati con radio-telemetri per il monitoraggio continuo della pressione arteriosa come pure un catetere di infusione venosa giugulare ed elettrodo bipolare personalizzati per la registrazione diretta di RSNA. A seguito di un periodo di recupero di 48-72 ore, il tasso di sopravvivenza era al 100% e tutti i topi si sono comportati normalmente. A questo punto di tempo, RSNA è stato registrato con successo nell'80% dei topi, con segnali vitali acquisiti fino a 4 e 5 giorni dopo l'intervento in 70% e il 50% dei topi, rispettivamente. Pressione fisiologica di sangue sono stata registrata in tutti i topi (116±2 mmHg; n = 10). RSNA registrato aumentato con mangiare e governare, come affermato nella letteratura. Inoltre, RSNA è stato convalidato da blocco gangliare e modulazione di pressione sanguigna con agenti farmacologici. Qui, è descritto un metodo efficace e gestibile per la registrazione libera di RSNA in topi coscienti, liberi di muoversi.

Introduzione

Interesse nel usando topi in diverse aree della ricerca biomedica continua ad espandersi con lo sviluppo di innumerevoli modelli geneticamente. Per la maggior parte, progressi tecnici hanno tenuto il passo con l'uso aumentato dei topi in fisiologia e ora c'è un'impressionante selezione di dispositivi miniaturizzati, sviluppato specificamente per la misurazione di parametri fisiologici importanti nei topi. Anche se telemetriche dispositivi per la misura di autonomica diretta tono nervoso nel ratto cosciente sono stati disponibili per oltre un decennio, dispositivi miniaturizzati per valutare l'attività del nervo in topi coscienti non sono attualmente disponibili. Gli investigatori in genere aggirare questa limitazione valutando il contributo del sistema nervoso autonomo con metodi indiretti (cioè le catecolammine del plasma o nelle urine, blocco farmacologico autonomico, analisi spettrale dei reticoli di sangue pressione/pulsazioni)¹.

Mentre questi metodi forniscono preziose informazioni, il risultato è un quadro globale di tono nel complesso autonomo, piuttosto che rivelare il discreto contributo di popolazioni isolate dei nervi al fenomeno in esame. In alternativa, registrazione diretta delle attività dai nervi specifici è stato eseguito in topi anestetizzati, che pone una moltitudine di preoccupazioni. È estremamente difficile mantenere stabile la pressione sanguigna all'interno della gamma fisiologica in un mouse anestetizzato per diverse ore dopo chirurgia. Infatti, in questi tipi di esperimenti, la pressione sanguigna è spesso non dichiarata o presentata a livelli estremamente bassi (cioè 60-80 mmHg contro > 100 mmHg in un mouse cosciente)². La fragilità del sistema cardiovascolare ha esibito in una preparazione del mouse anestetizzati spesso osta ad una valutazione significativa di attività autonoma del nervo, dato il rapporto codipendente fra pressione sanguigna e del tono simpatico^{3, 4}.

Per risolvere questa limitazione, un nuovo metodo per la registrazione diretta di attività simpatica renale del nervo (RSNA) in consapevole, topi sfrenati, indisturbati all'interno della loro casa gabbie è stato sviluppato. Sia l'approccio chirurgico e sperimentale per la corretta implementazione di questa tecnica è descritta in dettaglio. Questa preparazione consente al ricercatore di registrare simultaneamente la pressione arteriosa tramite radiotelemetria oltre ai RSNA, con in più la capacità di infondere per via endovenosa agenti di interesse senza disturbare il mouse.

Ventiquattro ore post-chirurgia, topi si comportano normalmente e non presentano segni di dolore o angoscia. Le registrazioni sperimentali possono quindi iniziare 48-72 ore successive post-all'intervento mentre il mouse si riposa comodamente nella sua gabbia a casa con accesso illimitato a cibo, acqua e arricchimento ambientale. Cancella le tracce RSNA sono presentate e le risposte caratteristiche di questa popolazione di nervo ai movimenti normali fisici dell'animale (come mangiare e governare) sono dimostrate oltre alla modulazione farmacologica della pressione arteriosa sistemica. La qualità e la specificità del segnale RSNA è ulteriormente convalidato dal blocco gangliare. Questo manoscritto contiene il complemento audiovisivo per una descrizione inizialmente pubblicato di questa tecnica⁵.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono conformi gli istituti nazionali di salute Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono state approvate dal comitato di uso dell'Università del Mississippi Medical Center e istituzionali Animal Care.

1. gli animali e l'alloggiamento

1. Mouse della casa (24-35 g) all'arrivo nella struttura animali di laboratorio istituzionale.
2. Offrono topi standard chow roditore e acqua del rubinetto ad libitum in tutte le fasi del protocollo sperimentale in un ambiente controllato di temperatura e umidità.

2. personalizzati fabbricazione dell'elettrodo impiantabile RSNA

Nota: Costruire l'elettrodo RSNA impiantabile almeno un paio di giorni in anticipo la procedura chirurgica programmata in base all'ora di polimerizzazione e sterilizzazione (descritto sotto).

1. Tagliare tre lunghezze uguali di in acciaio inox coibentata multiplo-stranded wire, 250 mm ogni (diametro di legare 0,0254 mm nudo, 0,14 mm rivestito). Utilizzare una lama per bisturi (preferibilmente #11) per circa 15 mm di materiale isolante per esporre il metallo sottostante da un'estremità di ciascuna delle lunghezze di filo della striscia.
   1. Saldare un connettore singolo pin maschio (in ottone con placcatura in oro) alla fine di soltanto due dei fili scoperto per creare i cavi degli elettrodi bipolari (Figura 1A). Lasciare alla fine della terza lunghezza del filo nudo. Questo funzionerà come il filo di terra.
   2. Scivolare una breve (~2.0 - 2,5 cm) pezzo di 1,6 mm diametro tubo degli strizzacervelli di calore sopra il connettore pin e filo per coprire completamente il giunto appena saldato tra il filo e pin connettore.
      Nota: La punta del connettore pin che sarà collegato in headstage l'amplificatore deve rimanere esposta.
   3. Tenere il filo sopra una pistola di calore con un paio di piccole pinze o emostatiche di strizzacervelli di calore sensibile e isolare elettricamente la connessione tra il PIN e il filo. Ripetere l'operazione per il secondo connettore filo/pin.
2. Tagli una lunghezza di 200 mm di tubi in polietilene (PE 90; diametro interno 0,86 mm, diametro esterno mm 1,27). Raggruppare i tre fili (due conduce + filo di terra) e introdurre le estremità intatte nel tubo PE 90, threading insieme attraverso all'estremità aperta del tubo (Figura 1B).
   Nota: Il 90 PE tubi funzioni come un fodero per raggruppare e proteggere l'elettrodo conduce e filo di terra.
   1. Identificare il filo di terra e farlo passare attraverso la guaina PE 90 un po' più lontano per distinguerlo da quelli della elettrodo bipolare.

3. costruzione della punta dell'elettrodo

1. Visualizzare le estremità intatte dei cavi degli elettrodi con un microscopio per dissezione. Infilare le tre estremità dell'elettrodo attraverso un 5 mm - lungo pezzo di piccoli tubi di polietilene (PE 10, diametro interno 0,28 mm, diametro esterno 0,61 mm) per legare insieme i cavi degli elettrodi.
   1. Infilare un pezzo di questa tubazione PE 10 su fili tre elettrodi 1,5 mm. Avanzare questa tubazione per riposare 2,0 mm dal pezzo iniziale 5 mm del PE 10.
   2. Infilare un secondo pezzo di 1,5 mm di tubo PE 10 sulle punte dei due cavi elettrodo bipolare per coprire e isolare le punte e separarlo dal filo di terra (Figura 1).
2. Tagliare qualsiasi lunghezza dei fili in eccesso con le forbici.
3. Incollare i singoli pezzi di tubo PE 10 per i cavi degli elettrodi con una piccola goccia di colla cianoacrilica formula liquida. Inserire un ago di 25 calibro smussata all'estremità del tubo di colla per migliorare il controllo e ridurre la fuoriuscita.
   1. Posizionare la punta dell'ago all'incrocio tra la PE 10 e filo, poi versare una piccola goccia di colla e visualizzare colla rivestimento interno del tubo di PE.
   2. Consentire la colla curare completamente durante la notte.

4. bene preparazione della punta dell'elettrodo per la registrazione

1. Striscia il rivestimento isolante dalle punte elettrodo bipolare e la punta del cavo di terra con una lama per bisturi #11. Non disturbare o danneggiare il sottostante più fili intrecciati, come questo avrà un impatto la qualità del segnale RSNA.
2. Presa l'elettrodo costruito tra il 5,0 mm e 1,5 mm PE 10 ancoraggi con forcipe curvo e piegare i fili a formare un angolo di 90° (Figura 1).
   Nota: Questa manovra dovrebbe posizionare i cavi degli elettrodi bipolari sopra il filo di terra, in una posizione ottimale alla culla il pacco del nervo.

5. costruzione del piedistallo ancoraggio

1. Costruire un piedistallo per stabilizzare l'elettrodo conduce alla regione scapolare metà del mouse all'esteriorizzazione tagliando un pezzo di 3 cm di tubo in polietilene (diametro interno 2,70 mm, diametro esterno mm 4,00).
   1. Afferrare il tubo con il forcipe e sciogliere un'estremità su una pistola di calore. Premere l'estremità riscaldata della tubazione perpendicolare ad una superficie di metallo cool per creare una cresta arrotondata o "flangia".
   2. Infilare questo piedistallo su electrode costruito, tale che la flangia sia rivolta verso la punta dell'elettrodo.
      Nota: La combinazione della guaina PE 90 e piedistallo proteggerà i cavi degli elettrodi una volta esteriorizzati dall'animale.

6. sterilizzazione dell'elettrodo impiantabile completato

1. Pacchetto l'elettrodo completato individualmente in sacchetti di sterilizzazione e ozono sterilizzare (TSO₃) prima dell'impianto.
   Nota: Consultare con sterilizzazione per l'ospedale locale, per quanto riguarda il tipo specifico di sacchetto di sterilizzazione e procedura come questo differisce tra istituzioni.

7. l'anestesia e la preparazione per la chirurgia

1. Somministrare l'analgesia 20 minuti prima dell'inizio della chirurgia (meloxicam 2 mg/kg, S.C.). Posizionare il mouse in un'aula di induzione infuso con 100% di ossigeno medicale. Regolare le impostazioni del vaporizzatore per aumentare la percentuale di isoflurane anestetica con incrementi di 0,5 a raggiungere il 4%. Valutare il piano chirurgico valutando la risposta riflessa a leggera pressione applicata per le dita o i cuscinetti del piede della ribalta e arti posteriori così come rallentamento della frequenza respiratoria.
   1. Trasferire l'animale per il tavolo operatorio e mantenere l'anestesia con isoflurano 1.5-2% tramite un musetto una volta che ha raggiunto il piano chirurgico e non esibisce il riflesso di punta-pizzico. Ripetere periodicamente la risposta di punta-pizzico e valutare la frequenza respiratoria durante tutta la procedura chirurgica. Applicare unguento oftalmico per occhi per prevenire la secchezza.
   2. Mantenere la temperatura corporea normale dell'animale in ogni momento con riempimento in gel isotermici calore pastiglie e corrispondente tavolo chirurgico. Conservare pastiglie isotermiche in bagnomaria a 37° C e sostituire pastiglie come spesso come necessario durante la chirurgia per mantenere la temperatura corporea fisiologica.
   3. Amministrare il glicopirrolato (50-70 µ g/kg, per via sottocutanea (S.C.)) per evitare l'eccessiva produzione di secrezioni della via aerea immediatamente dopo l'induzione dell'anestesia. Somministrare la dose di glicopirrolato una seconda volta nel punto medio della procedura chirurgica (punto 9.1).
   4. Effettuare tutte le procedure chirurgiche in condizioni asettiche. Garantire a tutti gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati in autoclave prima dell'intervento chirurgico programmato. Pulire il campo chirurgico, come descritto di seguito (7.2.1) e mantenere la sterilità durante tutta la procedura.
      1. Indossare guanti sterili, monouso, sterilizzato nell'autoclave camice e mascherina facciale. Pulire tutte le attrezzature di grandi dimensioni come la lampada a collo di cigno, ambito e tavolo chirurgico con etanolo al 70% di dissezione. Periodicamente durante la procedura, è necessario applicare etanolo al 70% per i guanti chirurgici per garantire la sterilità.
2. Rimuovere i capelli dal fianco sinistro dell'animale, regione ventrale del collo e regione dorsale midscapular con piccolo animale tagliacapelli seguiti da crema depilatoria (formula di pelle sensibile).
   1. Pulire la pelle di questi due campi chirurgici con 3 alternando applicazioni di soluzione di pulizia chirurgica (10% Povidone iodio) ed etanolo al 70%. Preparare il campo operatorio con un'applicazione finale della soluzione pulizia chirurgica.

8. impianto chirurgico dell'elettrodo RSNA

1. Posizionare il mouse sul suo lato destro con l'estremità rostrale che punta a sinistra del chirurgo, esponendo il fianco sinistro dell'animale. Fare un'incisione di 5 millimetri nella pelle della regione midscapular con un bisturi (#11).
   Nota: Questo è il sito in cui verranno essere esteriorizzati i cavi degli elettrodi RSNA.
   1. Praticare una seconda incisione (< 20 mm) in pelle che ricopre il fianco sinistro, perpendicolare alla spina dorsale e caudale alla gabbia toracica di 2 mm. Un ago di acciaio inossidabile 13G per via sottocutanea da questa incisione all'incisione presso il sito di dorsale uscita del tunnel.
      Nota: Il File i bordi taglienti dell'ago di lasciare una superficie liscia, non tagliente.
   2. Passare l'elettrodo RSNA impiantabile sterilizzato (passaggi 2 - 6) attraverso l'ago 13G. Tirare indietro l'ago 13G per lasciare la punta dell'elettrodo che si trova sul muscolo addominale del fianco sinistro. Lasciare un segmento dei cavi dell'elettrodo che si trova sotto la pelle e lasciare le rimanenti lunghezze emergenti dall'incisione dorsale.
2. Posizionare la punta dell'elettrodo al lato. Praticare un'incisione nel muscolo addominale direttamente sottostante l'incisione cutanea effettuata in 8.1.1. Separare il grasso e tessuto connettivo lungo il muscolo posteriore con applicatori di cotone con punta piccole per esporre il rene di sinistra.
   1. Aprire il campo chirurgico con micro-divaricatori e ritrarre il rene. Non per allungare il fascio neurovascolare renale, che irreversibilmente danneggia i nervi renali e impedisce la registrazione di un segnale RSNA praticabile.
      Nota: Micro-riavvolgitori con dispositivo di acciaio può essere modellato da una clip di carta standard e una lunghezza di seta 4-0. Garantire che questi divaricatori sono anche sterilizzati con gli strumenti chirurgici al fine di preservare una tecnica asettica.
3. Visualizzare il fascio neurovascolare renale con l'aiuto di un alto potere microscopio per dissezione. Identificare il bundle renale del nervo, che in genere (ma non sempre) costeggia l'arteria renale e la vena. Sezionare il pacco del nervo dai tessuti circostanti con il forcipe fine, dritto.
   Nota: Il pacco del nervo renale appare opaco, con un aspetto riflettente "corda-come", unico rispetto ai vasi linfatici, che appaiono chiari.
   1. Manipolare il fascio nervoso il meno possibile. Non toccare, allungare o ritirare il pacco del nervo in qualsiasi momento. Non interrompere bene vasi sanguigni che forniscono il nervo, o la condotta della linfa renale perché ciò compromettere la vitalità del nervo e produrre linfa continua pool di fluido intorno al nervo/elettrodo, che ostacolano o cancellare completamente il segnale del nervo.
   2. Lasciare il bundle renale del nervo intatto, che vi aiuterà a preservare la redditività a lungo termine del nervo come pure mantenere un contatto stabile tra il nervo e l'elettrodo (cioè un nervo sezionato può scivolare fuori di elettrodi con tempo e movimenti naturali del corpo).
4. Introdurre la punta dell'elettrodo RSNA nell'addome. Regolare la sua posizione tale che il filo elettrodo bipolare di punta e terra sono perpendicolari al pacco neurovascular renale. Consente di regolare ulteriormente la posizione dell'elettrodo tale che il filo di terra ha buon contatto con i tessuti sottostanti e l'elettrodo non comprime i vasi renali, compromettere la circolazione renale (Figura 1).
5. Sollevare il bundle renale del nervo con il forcipe angolato. Scivolare la punta dell'elettrodo sotto il nervo, lasciando il nervo a diretto contatto con entrambi i fili.
   1. Infilare un piccolo pezzo di pellicola di paraffina tra i fili del nervo/bipolare e il terzo filo (terra) (Figura 1).
      Nota: Soak sterilizzare il film di paraffina in etanolo al 70% per 24 ore e risciacquare in soluzione fisiologica sterile prima dell'impianto.
   2. Rimuovere qualsiasi sangue o fluido da intorno il nervo/elettrodo con piccolo assorbente spears come qualsiasi fluido lasciato intorno al nervo o cavi degli elettrodi saranno ostacolare o estinguere il segnale del nervo.
   3. Consente di testare rapidamente la qualità del segnale RSNA se desiderato (programma di installazione descritta di seguito).
      Nota: Questo deve essere fatto rapidamente come l'esposizione all'aria sarà asciugare il nervo e compromettere la sua redditività.
   4. Applicare un elastomero siliconico bicomponente all'unità del nervo/elettrodo, assicurando che le piscine del silicone sotto e intorno al nervo per fornire isolamento elettrico completo (cioè non semplicemente una goccia sulla parte superiore del nervo).
      Nota: Assicurarsi che le punte dell'elettrodo sono inoltre rivestite in silicone. Il filo di terra deve rimanere in contatto con il tessuto sottostante e così elastomero non ha bisogno di piscina sotto questo filo. Evitare di applicare un'inutilmente grande quantità di elastomero di silicone, come questo può potenzialmente ostacolare il flusso sanguigno renale, o diventata sloggiato con movimenti naturali del corpo con il tempo.
   5. Consentire 1-2 minuti per l'elastomero di silicone curare completamente, quindi attentamente sollevare i bordi esterni del silicone "glob" con il forcipe e applicare una piccola quantità di liquido adesivo chirurgico formula.
      Nota: fare attenzione per non applicare una quantità eccessiva di questa colla, come esso può compromettere la circolazione o diffondersi al nervo e compromettere la sua redditività.
6. Chiudere l'incisione addominale con suture assorbibili discontinue (5-0). Chiudere la pelle sovrastante in modo simile con lo stesso materiale di sutura.

9. l'impianto di Radiotelemeter di pressione sanguigna

1. Riposizionare il mouse sul dorso, con l'estremità rostrale rivolta verso il chirurgo. Regolare la punta conica anestesia come necessario. Somministrare la dose seconda di glycopyrrolate a questo punto (Vedi 7.1.3).
2. Fare un'incisione del midline nella pelle della regione del collo con un bisturi (#11), a partire da appena sotto la mascella inferiore dell'animale e che si estende appena sopra la gabbia toracica. Separare il tessuto ghiandolare per esporre i muscoli del collo sottostante. Esporre l'arteria carotide comune sinistra e separata dai tessuti circostanti.
   Nota: Fare attenzione a non danneggiare il nervo vago, in quanto questo può portare a un aumento della mortalità post-chirurgica.
   1. Passare tre pezzi di materiale di sutura seta 6-0 sotto l'arteria. Collocare una sutura rostralmente quanto possibile e legarlo per occludere la nave. Posizionare una seconda intermedia di sutura lungo la lunghezza della nave e legare senza stringere. Posizionare l'ultima sutura caudalmente possibile e legare senza stringere.
   2. Ritrarre la sutura più rostrale e fissarla al musetto con un piccolo pezzo di nastro ombelicale. Ritrarre la sutura più caudale con micro-zanzara pinze per limitare il flusso di sangue nel vaso.
   3. Praticare una piccola incisione nella parete del vaso con le forbici di primavera rostralmente come possibile. Introdurre il catetere di radiotelemeter di pressione sanguigna del mouse la nave e di avanzare per la sutura caudale.
      1. Legare la sutura centrale per stabilizzare il catetere temporaneamente, rilasciare la ritrazione caudale e avanzare la sutura del catetere 10mm cravatta intorno catetere per fissarlo in posizione.
   4. Il corpo di telemetro a una tasca sottocutanea lungo il fianco destro del tunnel.

10. l'impianto ed esteriorizzazione del catetere venoso giugulare

1. Utilizzare piccoli applicatori di cotone con punta per esporre la vena giugulare di destra. Passare due pezzi di materiale di sutura seta 6-0 intorno al vaso.
   1. Posizionare una sutura rostralmente quanto possibile e cravatta per occludere il vaso. Posizionare la seconda sutura caudalmente possibile e ritrarre delicatamente per arrestare il flusso di sangue nel vaso.
   2. Usare le forbici di primavera per praticare una piccola incisione nella parete del vaso più vicino la sutura rostrale come possibile. Cateterismo della vena con tubi di calore-allungato (O.D. 1,02 mm, si estendeva a OD 0,64 mm), che è pre-riempito con soluzione fisiologica sterile.
      Nota: Assicurarsi che la punta del catetere viene tagliata con un bisturi per produrre uno smusso arrotondato per evitare la perforazione del vaso. Determinare il volume di liquido nel catetere (spazio morto) per riferimento (vedere passaggi 14,4-14,6 qui sotto).
      1. Far avanzare il catetere ~ 8 mm nella vena. Fissare il catetere legando le suture di seta intorno alla nave e catetere, come pure la applicazione di una piccola goccia di colla cianoacrilato formula gel.
2. Posizionare il mouse sul suo lato sinistro. Traforo del catetere endovenoso dal collo all'uscita presso la regione dorsale midscapular utilizzando un ago di acciaio inossidabile 13G.
3. Riposizionare il mouse sulla schiena. Chiudere l'incisione del collo con suture discontinue.
4. Metti l'animale in posizione prona. Infilare un piccolo pulsante sottocutaneo sul catetere venoso. Fissare il pulsante sotto la pelle con punti di sutura. Infilare la molla di acciaio corrispondente sopra il catetere venoso e fissarlo al pulsante della pelle per proteggere il catetere.

11. protezione dell'elettrodo esteriorizzato conduce

1. Fissare il piedistallo di polietilene per proteggere che l'elettrodo conduce al muscolo sottostante con adesivo del tessuto. Suturare la cute sovrastante sopra la flangia per ricevere ulteriore assistenza.

12. post-chirurgica di recupero

1. Applicare pomata antibiotica a tutte le incisioni.
2. Somministrare il farmaco analgesico. Somministrare ulteriori dosi di farmaco analgesico come stato necessario durante il periodo di recupero se l'animale mostra segni di dolore o angoscia.
3. Posizionare il mouse in una gabbia metabolica rivestita con biancheria di trucioli di legno e carta assorbente per recuperare. Monitorare continuamente l'animale e non lasciare incustoditi finché riprende conoscenza e può mantenere il decubito sternale. Introdurre a questo punto arricchimento ambientale, di cibo e di acqua (ad libitum).
4. Elettrodo di bobina conduce all'esterno della gabbia fino al momento dell'esperimento.
5. Posiziona la gabbia su un pad termico caldo per le prime 24 ore di recupero. Collegare la molla in acciaio inox e catetere endovenoso ad un sistema girevole/infusione per infusione continua di soluzione fisiologica durante il periodo di recupero (0,5 mL/hr).
6. Garantire che l'animale rimane singolarmente all'interno di una gabbia dedicata a causa della natura del catetere esteriorizzato e porta elettrodo.

13. organizzazione sperimentale per la registrazione della pressione sanguigna e RSNA

1. Equipaggiare un tavolo antivibrazione superiore in acciaio inox con una semplice gabbia di Faraday.
   Nota: Questa gabbia di Faraday può essere costruita con una mesh di schermo di alluminio e telaio in legno. Elettricamente a terra la gabbia di Faraday/tabella per eliminare qualsiasi rumore elettrico.
2. Posizionare un ricevitore di radiotelemetria di pressione sanguigna all'interno della gabbia di Faraday.
3. Collegare il ricevitore di radiotelemetria all'adattatore di output associato pressione. Collegare questo adattatore a un sistema di acquisizione dati per registrare la pressione sanguigna online.
4. Due connettori pin femmina a saldare che sono gratuiti per i connettori di pin maschio di elettrodo (in ottone con placcatura in oro) fino ai confini di un PVC accoppiato, schermato cavo isolato. Saldare le estremità opposte del cavo accoppiato a connettori a banana. Collegare i connettori a banana per una preamplificazione headstage (amplificazione X 10).
5. Collegare questo preamplificatore a un amplificatore differenziale. Regolare le impostazioni per amplificare il segnale del nervo x10, 000. Regolare le impostazioni di filtro come segue: taglio basso, 100Hz; Taglio alto, 1000 Hz.
6. Posto dalla gabbia contenente il mouse sul ricevitore radiotelemetria che si trova all'interno della gabbia di Faraday 48 a 72 ore dopo l'intervento chirurgico. Accendere la sonda di radiotelemetria di registrare segnali di pressione sanguigna.
   Nota: Ambientarsi il mouse posizionando la gabbia a casa nel setup nel corso di 1 settimana prima dell'intervento chirurgico è ottimale.
7. Srotolare i cavi degli elettrodi e collegare i connettori pin dell'elettrodo bipolare corrispondenti connettori pin femmina descritti sopra (13,4) per iniziare a registrare RSNA.
8. Visualizzare e registrare simultaneamente segnali di pressione sanguigna online con un computer, mentre l'infusione di soluzione fisiologica o soluzione di interesse. Registrare dati ad una velocità minima di 2500 campioni al secondo.

14. protocollo di sperimentazione e validazione di RSNA segnale del campione

1. Assicurarsi che topi sono confortevoli nella loro gabbia a casa, sfrenato con libero accesso al cibo e acqua. Seguire le linee guida istituzionali cura degli animali per verificare il comportamento e l'aspetto normale.
2. Casa i topi nella stessa temperatura e umidità controllata in cui RSNA registrazione avrà luogo. Garantire l'infusione endovenosa continua come sopra descritto.
3. Consentire almeno 30 minuti di stabilizzazione una volta che l'animale si trova nell'impostazione di registrazione descritto in precedenza prima di registrare un'ora di pressione basale e di dati RSNA. Garantire che l'animale sta riposando tranquillamente durante la registrazione poiché il naturale movimento è associato con aumento in tono simpatico. Nota Quando l'animale è in movimento direttamente sulla traccia digitale durante la registrazione, quindi questo può essere ignorato durante l'analisi.
4. Testare la risposta di baroreflex da prima lentamente l'iniezione di un bolo di nitroprusside del sodio (2,5 µ g/g di peso corporeo in un volume di 25 µ l di soluzione fisiologica) nella linea di infusione. Lentamente e svuotare la linea con ~ 50 µ l di fisiologica. Garantire spazio morto del catetere viene cancellato. Registrare la pressione sanguigna e RSNA per 2-5 minuti.
5. Iniettare lentamente un bolo di fenilefrina (20 µ g/g di peso corporeo in 25 µ l di soluzione fisiologica). Lavare con soluzione fisiologica di ~ 50 µ l. Garantire spazio morto del catetere viene cancellato. Registrare la pressione sanguigna e RSNA per altri 10-15 minuti.
6. Verificare la natura postganglionic del segnale del nervo iniettando lentamente un bolo di Ganglioplegico, Esametonio (peso di corpo 50 µ g/g in salino di 25 µ l) nella linea di infusione. Irrigare con soluzione fisiologica ~ 50 µ l. Garantire spazio morto del catetere viene cancellato. Continuare la registrazione per alcuni minuti.
7. Utilizzare l'attività residua che rimane dopo la somministrazione di Esametonio come una stima del rumore di fondo per uso nell'analisi del RSNA (descritto sotto).
8. Eutanasia il mouse con un sovradosaggio di isoflurane (dosaggio graduale con incrementi di 0,5 fino a 5%) e continuare a registrare RSNA per altri 30 minuti. Nota: Il segnale rimanente può essere utilizzato anche come una stima del rumore di fondo per l'analisi di RSNA.

15. analisi dei dati

1. Utilizzo software di acquisizione dati per analizzare cruda pressione del sangue e tracce RSNA.
   1. Digitalmente integrare e onda intera rettificare la traccia RSNA non elaborati utilizzando questo software. Selezionare "Integrali assoluto" per impostazioni integrale; applicare un decadimento costante di tempo di 0,1 secondi⁶.
   2. Analizzare il segnale integrato RSNA (visualizzato in unità di µV·s) per ogni segmento del protocollo sperimentale. Ignorare i segmenti della registrazione quando l'animale è capitato di essere in movimento. Prendere almeno 3 misurazioni per baseline e porzioni sperimentali dell'esperimento, rispettivamente.
   3. Analizzare RSNA a livello di minima e massima pressione raggiunto per nitroprusside del sodio o fenilefrina, rispettivamente per valutare la sensibilità di baroreflex.
   4. Media delle misurazioni individuali prese sopra per ogni parte del protocollo sperimentale per produrre un singolo valore.
   5. Quantificare la risposta RSNA calcolando la variazione percentuale del RSNA dalla linea di base, che è indicata a 100%⁷. Analisi statistica completa come appropriato.
      Nota: In questo esempio, l'analisi statistica della risposta di RSNA alla nitroprusside del sodio e fenilefrina è stato completato con un test di Student t ; significato è stato accettato con valori di P < 0.05.

Risultati

Seguendo il protocollo descritto, il tasso di sopravvivenza era 100% - tutti i topi instrumentati in questo studio è sopravvissuto e ha recuperato bene dopo la procedura chirurgica. Entro 24 ore dalla preparazione chirurgica, tutti i topi si sono comportati normalmente, esibendo mangiare tipico, comportamenti esplorativi e governare. Gli animali non hanno mostrato alcun segno di dolore o angoscia in questo momento. 48 ore dopo la chirurgia, un segnale RSNA verificabile e chiaro è stato ...

Discussione

Qui abbiamo delineato, ha dimostrato e convalidato un metodo novello per la valutazione mirato del RSNA in topi coscienti, liberi di muoversi e di riposare comodamente nelle loro gabbie di casa. A seguito di impianto chirurgico di un radiotelemeter di pressione arteriosa, un catetere di infusione endovenosa e un design personalizzato elettrodo bipolare RSNA, topi recupero da un intervento chirurgico e sono stati lasciati indisturbati per 48-72 ore. Topi è rimasto comodamente depositati nella loro gabbia a casa in ogni m...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Teflon-coated stainless steel multiple stranded wire	A-M Systems	793200	0.001in diameter bare; 0.0055in diameter coated
#11 Scalpel Blade	Fisher Scientific	ALMM9011
Soldering Iron and solder			Any make or model suitable
Male miniature pin connectors	A-M Systems	520200	Brass with gold plating
Female miniature pin connectors	A-M Systems	520100	Brass with gold plating
Heat Shrink tubing	Radio Shack	Model #: 278-1610 | Catalog #: 2781610	1.6 mm diameter
Polyethylene 90 (PE90) tubing	VWR	CA-63018-703	0.86mm inner diameter; 1.27mm outer diameter
Dissecting microscope	Leica Microsystems	Leica M80	Any make or model also suitable
Polyethylene 10 (PE10) tubing	Braintree Scientific	PE10 50 FT	0.28mm inner diameter; 0.61mm outer diameter
Super Glue Liquid	Loctite	n/a	Liquid Formula; any brand suitable
Super Glue Gel	Loctite	n/a	Gel Formula; any brand suitable
Polyethylene tubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/13	For pedestal 2.7mm inner diameter; 4.0mm outer diameter
Hospital Sterilization Services & Ozone Sterilization packets			Contact local hospital sterilization services
Isoflurane anesthesia	Abbott	05260-05
Deltaphase isothermal heat pads & surgical table	Braintree Scientific	39OP	Keep heat pads warm in a 37°C water bath; Corresponding surgical table essential
Glycopyrrolate	Amdipharm Mercury Company Limited	n/a
Isoflurane vaporizer system & flow gauge	Braintree Scientific	VP I	Include medical grade oxygen supply
Tissue scissors	Fine Science Tools	14173-12
Fine spring scissors	Fine Science Tools	15006-09
Small cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23400100
Fine Straight Forceps	Fine Science Tools	11254-20	#5, FST by Dumont Biologie Tip
Angled Forceps	Fine Science Tools	11251-35	#5/45 FST by Dumont
Small Absorbent Spears	Fine Science Tools	18105-03
Parafilm	Sigma Aldrich	BR701605 ALDRICH
Kwik-Sil 2 component Silicone Polymer	World Precision Instruments (WPI)	KWIK-SIL	Purchase extra specialized tips from WPI
5-0 Polysorb Suture	Tyco Healthcare	n/a
6-0 Silk Suture	Braintree Scientific	SUT-S 104	Deknatel brand, spool
Radiotelemetry Probe	Data Sciences International (DSI)	TA11-PAC10
Radiotelemetry Receiver	Data Sciences International (DSI)	PhysioTel RPC-1
Ambient Pressure Reference	Data Sciences International (DSI)	Apr-01
Pressure Output Adapter	Data Sciences International (DSI)	R11CPA
Rena Pulse Tubing	Braintree Scientific	RPT-040
Infusion Swivel	Instech Solomon	375/D/22
Swivel Support Arm & Mount	Instech Solomon	SMCLA
Polysulfone button	Instech Solomon	LW62S/6
Stainless steel spring	Instech Solomon	PS62
Vetbond surgical adhesive	3M	n/a
Triple Antibiotic Ointment	Fougera	n/a
PowerLab 8 Channel Data Acquisition System & Software	ADInstruments	PowerLab 8/35
PVC Insulated Cable	Belden	PVC Audio Connection Cable 32 AWG
Preamplification Headstage	Dagan Corporation	Model 4002
Differential Amplifier	Dagan Corporation	EX4-400
Sodium Nitroprusside	Sigma Aldrich	71778-25G
Phenylephrine	Sigma Aldrich	P6126-5G
Sterile Physiological Saline 0.9% NaCl	Beckton Dickinson		Contact local hospital supplier
hexamethonium	Sigma Aldrich	H0879-5G
Stainless Steel top anti vibration table	n/a	n/a	Custom designed in-house; Solid steel plate on a benchtop is also suitable
Faraday cage	n/a	n/a	Custom designed and constructed in-house
Small animal hair trimmer	n/a	n/a	Drugstore, men's beard trimmer suitable
Dipilatory Cream	n/a	n/a	Veet brand, sensitive skin formula
10% Povidone Iodine	Purdue Products	Betadiene
70% Ethanol	n/a	n/a
Steel microretractors	n/a	n/a	Made in-house. Bend a steel paper clip & loop 4-0 silk to form a retractor
Hemostats	Fine Science Tools	13011-12
Heat Gun	Fisher Scientific	09-201-27