JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

Abstract

في دراسة عن التسبب في التهاب الدماغ الفيروسي، وطريقة العدوى أمر بالغ الأهمية. أول اثنين من الطرق الرئيسية المعدية إلى الدماغ هو الطريق الدموي، الذي ينطوي على إصابة الخلايا البطانية وpericytes من الدماغ. والثاني هو intracerebroventricular (ICV) الطريق. مرة واحدة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وقد تنتشر الفيروسات إلى الفضاء تحت العنكبوتية، السحايا، والضفيرة المشيمية عبر السائل المخي الشوكي. في النماذج التجريبية، المراحل الأولى من توزيع الفيروسي الجهاز العصبي المركزي لا تتسم بشكل جيد، وأنه من غير الواضح ما إذا كانت مصابة فقط خلايا معينة في البداية. هنا، قمنا بتحليل توزيع جزيئات الفيروس المضخم للخلايا (CMV) أثناء المرحلة الحادة من الإصابة، ووصف فيروسية الدم الأساسي، بعد ICV أو داخل الأوعية (IV) الحقن في مخ الفأر حديثي الولادة. في نموذج حقن ICV، تم حقن 5 ميكرولتر من الفيروس المضخم للخلايا الفئران (MCMV) أو ميكروبيدات الفلورسنت إلى البطين الجانبي في midpoiالإقليم الشمالي بين الأذن والعين باستخدام حقنة 10 ميكرولتر مع إبرة 27 G. في نموذج حقن الرابع، وكان يستخدم حقنة 1-مل مع إبرة 35 G. تم استخدام نقل transilluminator لتصور الزمان (الوجه) الوريد السطحي للفأرة حديثي الولادة. نحن غرست 50 ميكرولتر من MCMV أو ميكروبيدات الفلورسنت في الوريد الصدغي السطحي. تم حصادها العقول في مختلف نقاط الوقت بعد الحقن. تم الكشف عن الجينوم MCMV استخدام في طريقة التهجين الموضعي. وقد لوحظت ميكروبيدات الفلورسنت أو البروتين الفلوري الأخضر معربا عن جزيئات MCMV المؤتلف بواسطة المجهر الفلورسنت. هذه التقنيات يمكن تطبيقها على العديد من مسببات الأمراض الأخرى للتحقيق في التسبب في التهاب الدماغ.

Introduction

عند دراسة التهاب الدماغ الفيروسي، والتوزيع الأولي من الجسيمات الفيروسية مهم جدا لفهم المرض والتسبب في ولتحديد أهداف الفيروسية في المخ. وتتراوح معظم الفيروسات في حجم 20-300 نانومتر، على الرغم من أن Pandoravirus أكثر من 700 نانومتر في حجم 1. توزيع الجسيمات الفيروسية في المرحلة الحادة من العدوى قد يعتمد على حجم الجسيمات، وتوزيع المستقبلات الخلوية، أو تقارب من المستقبلات الخلوية للبحث عن الفيروسات. في النماذج الحيوانية، intracerebroventricular (ICV)، داخل الصفاق، المشيمة مباشرة، وعن طريق الوريد (IV) وقد استخدمت العدوى لدراسة المرضية لالتهاب الدماغ الفيروسي. ICV التلقيح بفيروس كثيرا ما يستخدم لإقامة التهابات الجهاز العصبي المركزي (CNS) في الفئران. الدراسات التي تستخدم هذه التقنية تفيد العدوى على نطاق واسع، وخاصة من الخلايا في المناطق المحيطة بالبطين وفي مناطق من الدماغ في اتصال مباشر مع السائل النخاعي (CSF)، متشابهةr لآثار ventriculoencephalitis الفيروسية. صغر حجم فيروس الغدة المرتبطة (AAV) الجسيمات (20 - 25 نانومتر في القطر) يسهل نشرها في جميع أنحاء الدماغ في التهابات ICV 2-4. داخل الصفاق 5، المشيمة مباشرة 6، والرابع حقن 7 تمثل إدارة النظامية دموية المنشأ. تغلغل الجزيئات الفيروسية من خلال حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​يسمح لهم للوصول لحمة من الدماغ حديثي الولادة، وهو ما يمثل العقيدات دبقية صغيرة منتشرة 8،9.

الفيروس المضخم للخلايا (CMV) هو فيروس شائع الذي ينتمي إلى عائلة فيروس الهربس. في الولايات المتحدة، و 50٪ - وكان 80٪ من الناس عدوى الفيروس المضخم للخلايا التي كتبها سن 40. العدوى CMV نادرا ما تكون ضارة ولكن يمكن أن تسبب الأمراض في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة والأجنة. من جميع الولادات، 0.2٪ - 2٪ يولدون مع CMV 10، مما أدى إلى أعراض حادة مثل صغر الرأس، تكلس حول البطينات الدماغية، تنسج المخيخ، ميكرالرمد، وضمور العصب البصري 11،12. وعلاوة على ذلك، والتخلف العقلي، وفقدان السمع الحسي العصبي، وعيوب بصرية والحجز، والصرع تحدث في حوالي 10٪ من غير قاتلة طفلا مصابا CMV 13،14. الجهاز العصبي المركزي الخلل هو العرض المميز الأكثر شيوعا من CMV الشذوذ الخلقي. وتعطيل المزيد من الأطفال بشكل دائم كل عام CMV الخلقي من قبل متلازمة داون، متلازمة الكحول الجنينية، أو السنسنة المشقوقة (15). هل هناك أي تطعيمات ضد الفيروس المضخم للخلايا متوفر في الوقت الحاضر، داعيا إلى ضرورة وجود لقاح آمن وفعال. دراسة التفاعل بين الجسيمات CMV مع مستقبلاتها في المرحلة الأولى من الإصابة مهم لفهم تأثير التطعيم.

Ventriculoencephalitis والعقيدات دبقية صغيرة منتشرة هما الخصائص المرضية الرئيسية CMV التهاب الدماغ (16). فقد كان غير مؤكد كيف جزيئات الفيروس المضخم للخلايا (150-300 نانومتر) تنتشر عبر المخ في المرحلة الحادة من الإصابة لالثانية كيفية توزيع المستقبلات الخلوية وحبهم للفيروسات يسهم في انتشار الفيروس. كاواساكي وآخرون. قمنا بتقييم ICV والرابع العدوى من وجهة نظر توزيع الجسيمات ومستقبلاتها (β1 إنتغرين) في المرحلة الأولى من الإصابة. لقد وجدنا أن نشر جزيئات الفيروس المضخم للخلايا والتعبير عن إنتغرين β1 هي مرتبطة بشكل جيد في المرحلة الأولى من العدوى في كل ICV والتهابات الرابع 8. عدوى ICV هو نموذج للventriculoencephalitis وإصابة الرابع هو نموذج من العقيدات دبقية صغيرة منتشرة. ان دراسة ديناميكية الجزيئات الفيروسية أو الفلورسنت إعطاء معلومات مفيدة عن تأثير حجم الجسيمات، والتفاعلات الفيروسية مع المستقبلات الخلوية، وآلية الاختراق BBB في الدماغ. ويمكن استخدام بروتوكول التالية للتحقيق في أي عدوى فيروسية وناقلات فيروسية في الجهاز العصبي المركزي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية لجنة رعاية الحيوان من جامعة هاماماتسو كلية الطب.

1. إعداد MCMV (سميث سلالة) والمؤتلف M32 تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) -MCMV

  1. توليد المؤتلف M32-EGFP-MCMV وفقا لطريقة النحو التالي (1،2-1،9) وكما هو موضح سابقا 8.
  2. استخدام الفيروسات المؤتلف المستمدة من سلالة سميث من MCMV البرية من نوع (عدد الانضمام: U68299). إدراج EGFP (4،361 أزواج الأساس؛ بي بي) بين 37089 و 41450 سنة مضت (M32 - M31 موضع) في الجينوم MCMV بإتحاد مثلي.
  3. تضخيم بواسطة تفاعل البلمرة المتسلسل للMCMV M32 (41450 - 39286 سنة مضت، غادر المرافقة تسلسل وM31 (37089 - 39246 سنة مضت، المرافقة الحق مواضع تسلسل الجينات باستخدام بادئات التالية: M32، 5'-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 "(التمهيدي إلى الأمام)، 5 "-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 "(عكس التمهيدي)؛ M31، 5'-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3" (التمهيدي إلى الأمام)، 5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 "(عكس التمهيدي).
  4. إدراج موضع M32 في ناقلات، معربا عن EGFP باستخدام مواقع تقييد NheI وBamHI. إدراج موضع M31 إلى M32-EGFP -recombinant البلازميد باستخدام مواقع AflII وXbaI. يلتصق M32 - EGFP - تسلسل M31 مع NheI وAflII من M32 - EGFP - M31 إعادة التركيب البلازميد وتذوب في H 2 O.
  5. Transfect التركيبة المشقوق في نوى MCMV (سميث سلالة) -infected خلايا NIH3T3 24 ساعة بعد العدوى (HPI) باستخدام نظام Electroporation للللحث على إعادة التركيب مثلي.
  6. في 3 أيام بعد العدوى، وشارك في الثقافة الخلايا مع الخلايا الليفية الجنينية الماوس المعافين (MEFS) في نسبة 1/1000 في لوحات ستة جيدا وشاشة لالبؤر، معربا عن EGFP الخلايا المصابة.
  7. Harveالحادي وsupernatants التي تحتوي على الفيروس من الآبار التي تحتوي الأخضر الفلورسنت بؤر وتمييع عشرة أضعاف. لتنقية، واختيار الآبار التي تعرض واحدة بؤر الفلورية الخضراء.
  8. عندما يؤدي كل بؤر من مما يحد من التخفيف عرض العدوى التعبير EGFP، وإعداد الفيروس هو محض، مشيرا إلى أن أي فيروس من النوع البري لا يزال قائما. تحديد الفيروس عن طريق أسلوب اللوحة-الفحص كما هو موضح سابقا (17).
  9. علاج MCMV في خزانات السلامة البيولوجية المعتمدة في مستوى السلامة الحيوية 2 ارتداء قفازات وقناع.
  10. مرور MCMV (سميث سلالة) وMCMV المؤتلف في MEFS أعدت من أجنة الفئران مجلس النواب القديمة 12 يوما كما هو موضح سابقا (17).
  11. إزالة الخلايا من supernatants من الثقافات MEF المصابة بواسطة الطرد المركزي في 3000 × ز لمدة 20 دقيقة في 16 درجة مئوية.
  12. نابذة للsupernatants لمدة 40 دقيقة في 70000 × ز. Resuspend وكريات تحتوي على virions في 1 مل من مخزنة المالحة تريس، ونقل على لمتشكلة خطية الصورةorbitol التدرج (25٪ - 70٪). نابذة فائقة السرعة مرة أخرى في 70000 ز س لمدة 60 دقيقة 18.
  13. حصاد الفرقة التي تحتوي على الفيريون مع حقنة. بيليه virions تحصد خطوة تنبيذ فائق إضافية في 70000 × ز لمدة 40 دقيقة.
  14. resuspend الكرية في 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ومخزن في -80 درجة مئوية حتى التجارب العدوى.
  15. تحديد عيار الفيروس عن طريق أسلوب اللوحة-الفحص كما هو موضح سابقا (19).
  16. تصور التعبير EGFP من الجسيمات MCMV المؤتلف (الإثارة في 489 نانومتر، والانبعاثات في 508 نانومتر) بواسطة المجهر فلوري (الشكل 1A) وهيكل الجسيمات بواسطة المجهر الإلكتروني انتقال (تيم) 8 (الشكل 1B).

2. إعداد ميكروبيدات النيل الأحمر نيون

  1. شراء الكربوكسيل الفلورسنت النيل ميكروبيدات الحمراء ووضع 500 ميكرولتر من ميكروبيدات في أنابيب وفقا لقطرها (0.04- 0.06 ميكرون، ما يقرب من 3.63 × 10 12 الجسيمات. 0،1-0،3 ميكرون، ما يقرب من 5.75 × 10 10 الجسيمات. و1،7-2،2 ميكرون، ما يقرب من 6.85 × 10 7 الجزيئات).
  2. علاج الخرز مع 500 ميكرولتر من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم لحوالي 1 يوم لإزالة أي السموم الداخلية و resuspend حبات في الماء المعقم في RT.
  3. كثف حبات O / N مع 10٪ مصل الفأر تم الحصول عليها من C57BL / 6 الفئران في RT قبل استخدامها.
  4. لفصل الركام، دوامة الخرز ويصوتن جيدا قبل الاستعمال.

3. ICV حقن MCMV ونيون ميكروبيدات في الفئران حديثي الولادة

  1. الحفاظ على الفئران الحوامل مجلس النواب العادية في منشأة التحكم في درجة حرارته تحت 12 ساعة دورة الضوء / الظلام. تصنف الولدان كما P 0.5 يوم الولادة.
  2. تعقيم حقنة 10 ميكرولتر وإبرة 27 G مع 70٪ من الكحول.
  3. تحميل حقن محلول (5 ميكرولتر) التي تحتوي على MCMV أو الجزئي الفلورسنتحبات في إبرة عن طريق سحب بعناية المكبس من الحقنة.
  4. كبح الماوس حديثي الولادة (P 0.5) عن طريق وضع الماوس على الجليد لمدة 3-4 دقيقة. مرة واحدة الحيوان تحت التخدير، واستخدام الأسلوب استجابة أخمص القدمين قرصة لتحديد عمق التخدير.
  5. علامة موقع الحقن بالقلم مختبر غير سامة في مكان ما يقرب من 0،7-1،0 مم الوحشي للخياطة السهمي و0،7-1،0 مم الذيلية من bregma حديثي الولادة (الشكل 2A).
  6. ادخال الإبرة 2 مم عميقة، عمودي على سطح الجمجمة في موقع الحقن ملحوظ. للإشارة، علامة 2 ملم من غيض من إبرة مع صانع غير سامة.
  7. ببطء حقن 5 ميكرولتر من MCMV (حوالي 5 × 10 5 PFU) في البطين الجانبي دون فتح فروة الرأس (الشكل 2B).
  8. في مجموعة أخرى من الفئران، وحقن محلول 5 ميكرولتر تحتوي على ميكروبيدات فلوري (0،1-0،3 ميكرون، ما يقرب من 5.75 × 10 8 الجزيئات) من خلالنفس الأسلوب.
  9. ببطء إزالة الإبرة 10-20 ثانية بعد وقف حركة المكبس لمنع ارتجاع.
  10. لاسترداد، والحفاظ على الفئران ل5-10 دقائق في وعاء دافئ حتى تتم استعادة الحركة والاستجابة العامة.
  11. حصاد العقول كما هو موضح في المادة 5 على مجموعة من النقاط الزمنية (3، 12، 24، 48، و 72 ساعة) بعد الحقن.

4. رابعا حقن MCMV أو نيون ميكروبيدات في الفئران حديثي الولادة

  1. كبح الماوس حديثي الولادة (P 0.5) عن طريق وضع الماوس على الجليد لمدة 3-4 دقيقة.
  2. استخدام حقنة 1 مل مع إبرة 35 G لإجراء الحقن في الوريد من MCMV في P 0.5 حديثي الولادة.
  3. استخدام نقل transilluminator (ريد مكتشف) لتصور سطحي الزمني (الوجه) الوريد. قبل الحقن، وتأمين الوليد إلى نقل transilluminator باستخدام الشريط الجراحية (الشكل 2C).
  4. في حين يرتدي نظارات مكبرة (1.5X)، ولبث ببطء 50 ميكرولتر من MCMV (حوالي 5.45 ×. 10 9 الجزيئات) أو ميكروبيدات فلوري (0،04-0،06 ميكرون، ما يقرب من 3.63 × 10 11 الجسيمات، 0،1-0،3 ميكرون، ما يقرب من 5.75 × 10 9 الجسيمات، و1،7-2،2 ميكرون، ما يقرب من 6.85 × 10 6 جزيئات) في الوريد الصدغي السطحي (الشكل 2D).
  5. بعد إزالة الإبرة، واستخدام الشاش التي تحتوي على 70٪ كحول إلى ممارسة الضغط على موقع الحقن حتى يتوقف النزيف.
  6. إعطاء حديثي الولادة حوالي 5 دقائق في وعاء الدافئة للتعافي قبل إعادته إلى القفص.
  7. حصاد العقول كما هو موضح في المادة 5 على مجموعة من النقاط الزمنية (3، 12، 24، و 72 ساعة) بعد الحقن.

5. الدماغ تحضير الأنسجة عينة لأقسام البارافين

  1. وضع حديثي الولادة حقن في طبق صغير من البلاستيك على الثلج المجروش.
  2. مرة واحدة الحيوان تحت التخدير، واستخدام الأسلوب استجابة أخمص القدمين قرصة لتحديد عمق anesthesI ل.
  3. جعل واحدة تخفيضات نهاية المركزية أو اثنين نهاية الأفقية من خلال القفص الصدري لفتح التجويف الصدري.
  4. اجراء خفض في الأذين مع مقص حاد. ضخ بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) حل في الأذين. وقف نضح عندما لاحظ حركة عفوية (PFA الرقص) ويخفف اللون من الكبد. لا يستنزف.
  5. تشريح الوليد (كما هو موضح سابقا 20) عن طريق إزالة أول رئيس باستخدام زوج من مقص.
  6. جعل شق خط الوسط على طول غشاء من الرقبة إلى الأنف لفضح الجمجمة.
  7. وضع نهاية حادة من مقص القزحية في الثقبة العظمى على جانب واحد، انزلاق بعناية على طول السطح الداخلي للجمجمة.
  8. اجراء خفض تمتد إلى حافة البعيدة من السطح الخلفي الجمجمة، وجعل قطع متطابقة على الجانب المقابل. ازالة الجمجمة حول المخيخ.
  9. قشر مرة أخرى بعناية الجمجمة على جانب واحد لمنع تلف في خلايا المخ. كرر هذهالإجراء على الجانب الآخر من الدماغ.
  10. باستخدام ملعقة، قطع بصيلات الشم وصلات عصبية على طول السطح البطني من الدماغ.
  11. فصل بلطف الدماغ من الرأس، وتقليم أي الجافية التي لا تزال تواصل بين الدماغ والجمجمة باستخدام مقص، وإزالة المخ.
  12. وضع الدماغ في قارورة من تثبيتي تحتوي على 4٪ PFA لا يقل عن 10 أضعاف حجم الدماغ لمدة 24 ساعة في 4 درجات مئوية.
  13. يذوى الأنسجة من خلال سلسلة من الحمامات الايثانول متدرج لتهجير المياه، ومن ثم التسلل مع شمع البارافين، وتشكيل كتلة. خفض كتلة البارافين مع مشراح إلى شرائح 4 ميكرون سميكة 21.
  14. Deparaffinize وترطيب الشرائح من أدمغة المصابين 22. انتقل إلى التهجين في الموقع لأقسام البارافين جزءا لا يتجزأ.

6. الدماغ تحضير الأنسجة عينة لأقسام المجمدة

  1. إزالة المخ باتباع الخطوات الموضحة في 5،1-5،11.
  2. لمراقبة ميكروبيدات الفلورسنت وM32-EGFP-MCMV، وضع الدماغ مقطوعة على cryomolds أسفل شقة. إضافة تضمين المتوسطة لتغطية كامل العينة الدماغ. التقط تجميد cryomolds في -hexane ن precooled (-80 درجة مئوية)، وذلك باستخدام ملقط لعقد حافة cryomolds قبل إرفاقها تشوك.
  3. لباجتزاء، ونعلق كتلة الأنسجة المجمدة على تشاك ناظم البرد precooled. نقل الأنسجة المجمدة مع تشوك في غرفة ناظم البرد وانخفاض درجات الحرارة إلى ما بين -10 و -20 درجة مئوية، وقطع شرائح حوالي 8-10 ميكرون سميكة 23.
  4. إصلاح الأجزاء مع cytofixative (خليط من الإيزوبروبيل والبولي ايثيلين جلايكول) عن طريق الرش. الهواء الجاف الأقسام لمدة 30 دقيقة في RT مباشرة بعد الرش، وتخزينها في - 80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  5. تتوازن الأقسام إلى RT ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  6. وصمة عار على أقسام مع فلوريسئين ثيوسيانات (FITC) -conjugated Griffonia سيمبليسيفوليا isolectin B4 بتركيز 1: 100 لمدة 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني في RT (الشكل 5) أو مع PE مترافق CD31 الأجسام المضادة بتركيز 1: 100 لمدة 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني في RT (الشكل 6).
  7. غسل المقاطع مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
  8. بعد الغسيل، وصمة عار على أقسام مع 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) لتصور نواة الخلية. جبل المقاطع في مكافحة تتلاشى كاشف ودابي صورة (الإثارة في 345 نانومتر، والانبعاثات في 455 نانومتر)، EGFP (الإثارة في 489 نانومتر، والانبعاثات في 508 نانومتر)، والأحمر النيل (الإثارة في 553 نانومتر، والانبعاثات في 637 نانومتر) مع مجهر فلوري (أرقام 3، 5، 6).

7. نيون في الموقع التهجين (FISH) لالبارافين جزءا لا يتجزأ من الأقسام

  1. إعداد التحقيق FISH المسمى مباشرة مع fluorophore عن الحمض النووي في الموقع التهجين عن طريق الترجمة نيك باستخدام كروموسوم اصطناعي البكتيرية التي تحتوي على كامل MCMV الحمض النووي جنراللى بعد (pSM3fr) 19. تركيز لجنة التحقيق FISH هو 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر.
  2. Deparaffinize وترطيب الشرائح من أدمغة المصابين 22.
  3. علاج أقسام الأنسجة مع ريبونوكلياز (100 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني) للكشف عن الحمض النووي الفيروسي.
  4. أداء استرجاع مستضد مع NP40 0.05٪، 0.01 M سيترات عازلة (6.0 درجة الحموضة) في 95-98 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تبريد الشرائح وصولا الى RT لمدة 20 دقيقة.
  5. في كوب Coplin تلطيخ جرة، وغسل الشرائح في الماء النقي ثلاث مرات لمدة 2 دقيقة في كل مرة. إجراء خطوة إضافية استرجاع مستضد مع البيبسين 0.06٪، 0.01 حل N حمض الهيدروكلوريك لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  6. شطف الشرائح ثلاث مرات في الماء النقي لمدة 2 دقيقة في كل مرة في كوب Coplin تلطيخ جرة.
  7. يذوى المقاطع الأنسجة مرة أخرى عن طريق نقل الشرائح من 70٪ من الإيثانول، إلى 85٪ من الإيثانول، ثم إلى الإيثانول بنسبة 100٪.
  8. لإعداد 10 مل من العازلة التهجين، مزيج 1.25 مل في أملاح الموقع التهجين (3 M كلوريد الصوديوم، و 100 ملي تريس-HCl درجة الحموضة 8.0، و 100 ملي فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 6.8، 50 ملي EDTA) مع 5 مل الفورماميد منزوع الأيونات، 2.5 مل 50٪ كبريتات ديكستران، 250 ميكرولتر 50X حل دينهارت في 125 ميكرولتر 100 ملغ / مل الحمض الريبي النووي النقال، و 875 ميكرولتر H 2 O.
  9. تمييع التحقيق الحمض النووي المسمى مباشرة مع fluorophores التي تعترف MCMV كامل الجينوم بشكل عشوائي في المنطقة العازلة التهجين. يجب أن يكون الحجم النهائي 10 ميكرولتر (7 ميكرولتر العازلة التهجين، التحقيق 1 ميكرولتر (0.1 ميكروغرام / ميكرولتر)، و 2 ميكرولتر الماء المقطر).
  10. يضاف مزيج التحقيق (10 ميكرولتر) إلى كل شريحة، وتغطي مع ساترة (15 × 15 ملم). ختم ساترة مع الاسمنت والمطاط. تفسد مزيج التحقيق لمدة 5 دقائق عند 85 درجة مئوية، وإكمال الخطوة التهجين O / N عند 42 درجة مئوية.
  11. تغسل الشرائح مع 0.3٪ NP40، SSC 0.4x في 73 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. مع 0.1٪ NP40، SSC 0.4x في 73 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. ومع 2X SSC مرتين.
  12. مباين نوى مع دابي (10 نانوغرام / مل)، وتغطية الشريحة مع ساترة.
  13. جبلالمقاطع في كاشف مكافحة تتلاشى ودابي صورة (الإثارة في 345 نانومتر، والانبعاثات في 455 نانومتر) وEGFP (الإثارة في 489 نانومتر، والانبعاثات في 508 نانومتر) مع مجهر فلوري (الشكل 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وفي دراسة أجريت على التسبب في التهاب الدماغ الفيروسي، وطريقة العدوى هو المهم. يمثل الطريق الدموي التهاب حاد في الخلايا البطانية وpericytes من الدماغ، في حين يمثل الطريق ICV تنتشر العدوى الحادة عن طريق السائل النخاعي من خلال الفضاء تحت العنكبوتية، ووصلت ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في النماذج الحيوانية، ICV، داخل الصفاق، المشيمة مباشرة، والتهابات الرابع تم استخدامها لدراسة التسبب في التهاب الدماغ الفيروسي. ركزنا على ICV وحقن الرابع نماذج من الفئران حديثي الولادة لبساطة الإجراءات والاستفادة من الحقن المباشر للجزيئات في المنطقة المستهدفة. على ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethaneSigma-AldrichT-6791
HClSigma-AldrichH-1758
pEGFP-N1 vector Clontech#6085-1
D-sorbitolSigma-AldrichS-1876
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06Spherotech, Inc.FP-00556-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3Spherotech, Inc.FP-0256-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2Spherotech, inc. FP-2056-2
10% mouse serumDAKO X0910
C57BL/6 mouseSLC, Inc.
ICR mouseSLC, Inc.
Modified Microliter Syringes (7000 Series)Hamilton company
35-gauge needleSaito Medical
A Wee Sight TransilluminatorPhillips Healthcare1017920
O.C.T.CompoundSakura Finetek4583
RNase ASigma-AldrichR4642
Nonidet(R) P-40Nacalai25223-04
citrate buffer (pH 6) x 10Sigma-AldrichC9999-100ml
pepsinSigma-AldrichP6887
EDTAdojindoN001
FormamideTCIF0045
Dextran sulfate sodium saltSigma-Aldrich42867-5G
Denhardt's Solution (50x)ThermoFishcer sceintific750018
Yeast tRNA (10 mg/ml)ThermoFishcer sceintificAM7119
SSC 20xSigma-AldrichS6639
DAPIThermoFishcer sceintificD1306
n-HexaneSigma-Aldrich296090
superfrost plus glassThermoFishcer sceintific12-55-18
Cytokeep IINippon Shoji Co.
FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4Vector laboratories, Inc.L1104
Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PEebioscience12-0311
ProLong  GoldThermoFishcer sceintificP36934
BIOREVOKEYENCEBZ-9000E

References

  1. Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
  2. Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).
  3. Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
  4. McLean, J. R., et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).
  5. Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration. J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).
  6. Sakao-Suzuki, M., et al. Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection. Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).
  7. Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. J Vis Exp. (93), e52037(2014).
  8. Kawasaki, H., et al. Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain. Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).
  9. Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).
  10. Cannon, M. J., Davis, K. F. Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic. Bmc Public Health. 5, (2005).
  11. Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).
  12. Becroft, D. M. Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis. Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).
  13. Conboy, T. J., et al. Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).
  14. Fowler, K. B., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).
  15. Cannon, M. J. Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness. J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).
  16. Grassi, M. P., et al. Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns. Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).
  17. Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells. J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).
  18. Britt, W. J. Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13(2010).
  19. Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process. PLoS One. 6 (3), e17492(2011).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. , (2008).
  22. Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (8), e308(2007).
  23. Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J Vis Exp. (97), (2015).
  24. Ohshima, M., et al. Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia. Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).
  25. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863(2014).
  26. Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J Vis Exp. (56), (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

113

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved