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Resumen

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

Resumen

En el estudio de la patogénesis de la encefalitis viral, el método de infección es crítica. La primera de las dos principales vías de infección en el cerebro es la vía hematógena, que implica la infección de las células endoteliales y pericitos del cerebro. La segunda es la vía intracerebroventricular (ICV). Una vez dentro del sistema nervioso central (CNS), los virus pueden propagarse al espacio subaracnoideo, meninges, y el plexo coroideo a través del líquido cefalorraquídeo. En modelos experimentales, las etapas más tempranas de la distribución viral SNC no están bien caracterizadas, y no está claro si están infectadas inicialmente sólo ciertas células. Aquí, hemos analizado la distribución de partículas de citomegalovirus (CMV) durante la fase aguda de la infección, llamada viremia primaria, después de la inyección ICV o intravascular (IV) en el cerebro del ratón neonatal. En el modelo de inyección ICV, se inyectaron 5 l de CMV murino (MCMV) o microperlas fluorescentes en el ventrículo lateral en el midpoint entre el oído y el ojo usando una jeringa de 10 l con una aguja de 27 G. En el modelo de la inyección IV, se usó una jeringa de 1 ml con una aguja de 35 G. Un transiluminador se utiliza para visualizar la vena superficial temporal (facial) del ratón neonatal. Infundido 50 l de MCMV o microperlas fluorescentes en la vena temporal superficial. Los cerebros se recogieron a diferentes puntos de tiempo después de la inyección. Genomas MCMV se detectaron utilizando el método de hibridación in situ. microperlas fluorescentes o proteína fluorescente verde que expresan partículas MCMV recombinantes se observaron por microscopía fluorescente. Estas técnicas se pueden aplicar a muchos otros patógenos para investigar la patogénesis de la encefalitis.

Introducción

Cuando se estudia la encefalitis viral, la distribución inicial de las partículas virales es muy importante para comprender la patogénesis de la enfermedad y para identificar dianas virales en el cerebro. La mayoría de los virus varían en tamaño de 20 a 300 nm, aunque la pandoravirus es de más de 700 nm de tamaño 1. La distribución de las partículas virales en la fase aguda de la infección puede depender del tamaño de las partículas, la distribución de los receptores celulares, o la afinidad de los receptores celulares en busca de virus. En modelos animales, intracerebroventricular (ICV), intraperitoneal, placentarios directa, y por vía intravenosa (IV) infecciones se han utilizado para estudiar la patogénesis de la encefalitis viral. ICV inoculación con virus se utiliza a menudo para establecer infecciones del sistema nervioso central (SNC) en ratones. Los estudios que utilizan esta técnica informan infección generalizada, particularmente de las células en las zonas periventriculares y en las regiones del cerebro en contacto directo con el líquido cefalorraquídeo (CSF), similar a los efectos de ventriculoencefalitis viral. El pequeño tamaño de virus adeno-asociado (AAV) partículas (20 - 25 nm de diámetro) facilita su difusión por todo el cerebro en las infecciones ICV 2-4. Intraperitoneales 5, 6 placentarios directa, y las inyecciones IV 7 representan administración sistémica hematógena. La penetración de partículas virales a través de la barrera hematoencefálica (BBB) ​​permite a llegar a la parénquima del cerebro neonatal, que representa nódulos microgliales difusas 8,9.

El citomegalovirus (CMV) es un virus común que pertenece a la familia de los virus herpes. En los Estados Unidos, el 50% - 80% de las personas han tenido la infección por CMV por los 40 años las infecciones por CMV rara vez son perjudiciales, pero pueden causar enfermedades en pacientes inmunocomprometidos y los fetos. De todos los partos, 0,2% - 2% nacen con CMV 10, dando lugar a síntomas graves, como microcefalia, calcificación periventricular, hipoplasia cerebelosa, microftalmía, y la atrofia del nervio óptico 11,12. Por otra parte, el retraso mental, pérdida de la audición neurosensorial, defectos visuales, convulsiones y la epilepsia se presentan en aproximadamente el 10% de los lactantes infectadas por CMV no fatalmente 13,14. disfunción del SNC es el síntoma característico más común del CMV anomalía congénita. Más niños están desactivadas de forma permanente cada año por CMV congénito que por el síndrome de Down, síndrome de alcoholismo fetal, o espina bífida 15. No hay vacunas contra el CMV disponibles en la actualidad, pidiendo una necesidad de una vacuna segura y eficaz. El estudio de la interacción de las partículas de CMV con sus receptores en la fase más temprana de la infección es importante para entender el efecto de la vacunación.

Ventriculoencefalitis y nódulos microgliales difusas son las dos principales características patológicas de la encefalitis por CMV 16. Ha sido incierto cómo las partículas de CMV (150 - 300 nm) se extienden a través del cerebro en la fase aguda de la infección de unand cómo la distribución de los receptores celulares y su afinidad por los virus contribuyen a la propagación viral. Kawasaki et al. Han evaluado ICV y IV infecciones desde la perspectiva de la distribución de partículas y sus receptores (β1 integrina) en la fase más temprana de la infección. Hemos encontrado que la difusión de partículas de CMV y la expresión de la integrina β1 se correlaciona bien en la fase más temprana de la infección en tanto ICV e infecciones IV 8. infección ICV es un modelo de ventriculoencefalitis e infección IV es un modelo de nódulos microgliales difusas. El estudio de la dinámica de las partículas virales o fluorescentes daría información útil sobre el efecto del tamaño de partícula, las interacciones virales con receptores celulares, y el mecanismo de penetración de la BHE en el cerebro. El siguiente protocolo se podría utilizar para investigar cualquier infección viral y el vector viral en el SNC.

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Protocolo

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Hamamatsu de la Escuela de Medicina.

1. Preparación de MCMV (cepa Smith) y recombinante M32 mejorada-proteína verde fluorescente (EGFP) -MCMV

  1. Generar recombinante M32-EGFP-MCMV acuerdo con el método de la siguiente manera (1/2 a 1/9) y como se ha descrito previamente 8.
  2. Utilice virus recombinantes derivados de la cepa Smith de MCMV de tipo salvaje (número de acceso: U68299). Insertar EGFP (4.361 pares de bases; pb) entre 37089 y 41450 pb (M32 - M31 locus) en el genoma por recombinación homóloga MCMV.
  3. Amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa del MCMV M32 (41.450 - 39.286 pb, dada secuencia de acompañamiento y M31 (37.089 - 39.246 pb, derecho que flanquean los loci de genes de secuencia usando los siguientes cebadores: M32, 5'-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(cebador directo), 5 '-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(Cebador inverso); M31, 5'-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3' (cebador directo), 5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 '(cebador inverso).
  4. Insertar el locus M32 en el vector EGFP-expresión utilizando sitios de restricción NheI y BamHI. Inserte el locus M31 al M32-EGFP -recombinant plásmido utilizando los sitios AflII y XbaI. Escindir el M32 - EGFP - secuencia de M31 con NheI y AflII de la M32 - EGFP - plásmido de recombinación de M31 y se disuelve en H 2 O.
  5. Transfectar la construcción escinde en los núcleos de MCMV (Smith cepa) infectados con células NIH3T3 24 horas después de la infección (hpi) usando un sistema de electroporación para inducir la recombinación homóloga.
  6. A los 3 días después de la infección, de co-cultivo de las células con fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs no infectada) en una proporción de 1 / 1.000 en seis pocillos y la pantalla para focos EGFP-expresión de las células infectadas.
  7. Harvest los sobrenadantes que contienen el virus de los pozos que contienen los focos fluorescentes verdes y diluir diez veces. Para la purificación, elija pozos individuales que muestran focos fluorescentes verdes.
  8. Cuando todos los focos resultante de la expresión de EGFP pantalla infección limitativo de la dilución, la preparación de virus es puro, lo que indica que ningún virus de tipo salvaje se mantiene. Cuantificar el virus por el método de placa de ensayo como se ha descrito previamente 17.
  9. El tratamiento de MCMV en cabinas de seguridad biológica certificadas a nivel de bioseguridad 2 con guantes y mascarilla.
  10. Passage MCMV (Smith cepa) y MCMV recombinante en MEFs preparados a partir de 12 días de edad, los embriones de ratón ICR como se ha descrito previamente 17.
  11. Retire las células de los sobrenadantes de cultivos de MEF infectadas mediante centrifugación a 3.000 xg durante 20 min a 16 ° C.
  12. Ultracentrífuga los sobrenadantes durante 40 minutos a 70.000 x g. Volver a suspender las pastillas que contienen viriones en 1 ml de solución salina tamponada con Tris y transferir a un s lineal preformadogradiente orbitol (25% - 70%). Ultracentrífuga de nuevo a 70.000 x g durante 60 min 18.
  13. Cosecha de la banda que contiene el virión con una jeringa. Se precipitan los viriones cosechados por una etapa de ultracentrifugación adicional a 70.000 xg durante 40 min.
  14. Resuspender el precipitado en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se almacena a -80 ° C hasta que los experimentos de infección.
  15. Cuantificar el título del virus por el método de placa de ensayo como se ha descrito previamente 19.
  16. Visualizar la expresión EGFP de las partículas recombinantes MCMV (excitación a 489 nm, emisión a 508 nm) por microscopía de fluorescencia (Figura 1A) y la estructura de las partículas por microscopía electrónica de transmisión (TEM) 8 (Figura 1B).

2. Preparación de las microperlas fluorescentes Rojo Nilo

  1. Compra carboxilo fluorescente Nilo microperlas rojos y colocar 500 l de microperlas en tubos de acuerdo con el diámetro (0.04- 0,06 m, aproximadamente 3,63 × 10 12 partículas; 0,1-0,3 micras, aproximadamente 5,75 × 10 10 partículas; y 1.7 a 2.2 micras, aproximadamente 6,85 × 10 7 partículas).
  2. Tratar perlas con 500 l de NaOH 0,1 M durante aproximadamente 1 día para eliminar las endotoxinas y resuspender las perlas en agua estéril a temperatura ambiente.
  3. Adsorber los granos de O / N con suero de ratón al 10% obtenido a partir de ratones C57BL / 6 a TA antes de su uso.
  4. Para separar los agregados, vórtice las cuentas y someter a ultrasonidos antes de usar.

3. La inyección de ICV MCMV y fluorescentes microperlas en ratones recién nacidos

  1. Mantener ratones ICR embarazadas normales en una instalación de temperatura controlada bajo un ciclo de 12 horas de luz / oscuridad. Los recién nacidos son designados como P 0.5 en el día de nacimiento.
  2. Esterilizar una jeringa de 10 l y una aguja de 27 G con alcohol 70%.
  3. Cargar la solución de inyección (5 l) que contiene MCMV o micro fluorescenteperlas en la aguja tirando con cuidado el émbolo de la jeringa.
  4. Restringir ratón neonatal (P 0,5), poniendo el ratón sobre hielo durante 3 - 4 min. Una vez que el animal está bajo anestesia, utilice el método de respuesta toe-pinch para determinar la profundidad de la anestesia.
  5. Marcar el sitio de la inyección con una pluma de laboratorio no tóxico en un lugar aproximadamente 0,7 a 1,0 mm lateral a la sutura sagital y 0,7 a 1,0 mm caudal desde el bregma neonatal (Figura 2A).
  6. Insertar la aguja 2 mm de profundidad, perpendicular a la superficie del cráneo en el sitio de inyección marcada. Para referencia, marcar 2 mm de la punta de la aguja con un fabricante no tóxico.
  7. Inyectar lentamente 5 l de MCMV (aproximadamente 5 × 10 5 PFU) en el ventrículo lateral sin abrir el cuero cabelludo (Figura 2B).
  8. En otro grupo de ratones, inyectar una solución que contiene 5 l microperlas fluorescentes (0,1-0,3 micras, aproximadamente 5,75 x 10 8 partículas) porel mismo método.
  9. extraer la aguja lentamente 10 - 20 seg después de suspender el movimiento del émbolo para evitar el reflujo.
  10. Para recuperar, mantener a los ratones durante 5 - 10 minutos a en un recipiente caliente hasta que el movimiento y la capacidad de respuesta en general se restauran.
  11. Cosechar los cerebros como se describe en la sección 5 en una serie de puntos de tiempo (3, 12, 24, 48 y 72 h) después de la inyección.

4. IV Inyección de MCMV o fluorescentes microperlas en ratones recién nacidos

  1. Restringir ratón neonatal (P 0,5), poniendo el ratón sobre hielo durante 3 - 4 min.
  2. Usar una jeringa de 1 ml con una aguja de 35 G para llevar a cabo la inyección intravenosa de MCMV en P 0,5 neonatos.
  3. Use un transiluminador (buscador de la vena) para visualizar la vena temporal superficial (facial). Antes de la inyección, asegurar el neonato al transiluminador usando cinta quirúrgica (Figura 2C).
  4. Si bien usar lentes de aumento (1,5 veces), infundir lentamente 50 l de MCMV (aproximadamente 5,45 ×; 10 9 partículas) o microperlas fluorescentes (0,04 - 0,06 m, aproximadamente 3,63 × 10 11 partículas; 0,1 - 0,3 micras, aproximadamente 5,75 × 10 9 partículas; y 1,7 - 2,2 micras, aproximadamente 6,85 x 10 6 partículas) en la vena temporal superficial (Figura 2D).
  5. Después de retirar la aguja, utilice una gasa que contiene 70% de alcohol para aplicar presión en el punto de inyección hasta que cesa la hemorragia.
  6. Dar al recién nacido aproximadamente 5 minutos en un recipiente caliente para recuperarse antes de devolverlo a la jaula.
  7. Cosechar los cerebros como se describe en la sección 5 en una serie de puntos de tiempo (3, 12, 24 y 72 horas) después de la inyección.

5. Preparación del cerebro muestra de tejido para las secciones de parafina

  1. Coloque los neonatos inyectados en un pequeño plato de plástico en hielo picado.
  2. Una vez que el animal está bajo anestesia, utilice el método de respuesta toe-pinch para determinar la profundidad de anesthesI a.
  3. Hacer una corte centrales o dos finales horizontales finales a través de la caja torácica para abrir la cavidad torácica.
  4. Hacer un corte en el atrio con unas tijeras afiladas. Infundir solución al 4% de paraformaldehído (PFA) en la aurícula. Detener la perfusión cuando se observan movimientos espontáneos (danza PFA) y el color aligerado del hígado. No Exsanguinate.
  5. Diseccionar el recién nacido (como se describió anteriormente 20) retirando primero el cabezal con un par de tijeras.
  6. Se practica una incisión en la línea media a lo largo del tegumento desde el cuello hasta la nariz para exponer el cráneo.
  7. Coloque la punta de un par de tijeras de iris en el foramen magnum, por un lado, deslizando con cuidado a lo largo de la superficie interna del cráneo.
  8. Hacer un corte que se extiende hasta el borde distal de la superficie del cráneo posterior, y hacer un corte idéntico en el lado contralateral. Despejar el cráneo alrededor del cerebelo.
  9. Con cuidado, pelar el cráneo en un lado para evitar daños en el cerebro. Repita esteprocedimiento en el otro lado del cerebro.
  10. Usando una espátula, cortar los bulbos olfatorios y conexiones nerviosas largo de la superficie ventral del cerebro.
  11. separar suavemente el cerebro de la cabeza, el recorte de cualquier dura que todavía conectar el cerebro en el cráneo con unas tijeras, y retirar el cerebro.
  12. Coloque el cerebro en un vial de fijador que contiene 4% PFA al menos 10 veces el volumen del cerebro durante 24 horas a 4 ° C.
  13. Deshidratar el tejido a través de una serie de baños de etanol graduadas para desplazar el agua, y luego infiltrarse con cera de parafina, formando un bloque. Cortar el bloque de parafina con un microtomo en rodajas 4 m de espesor 21.
  14. Desparafinar y rehidratar las diapositivas de los cerebros infectados 22. Proceder a la hibridación in situ de secciones incluidas en parafina.

6. Preparación de Tejido Cerebral de ejemplo para las secciones congeladas

  1. Retire el cerebro siguiendo los pasos descritos en 5.1 a 5.11.
  2. Para observar las microperlas fluorescentes y M32-EGFP-MCMV, coloque el cerebro resecado en criomoldes de fondo plano. Añadir medio de inclusión para cubrir completamente la muestra de cerebro. Snap congelar los criomoldes en hexano n pre-enfriada (-80 ° C), utilizando pinzas para sujetar el borde de las criomoldes antes de instalarla en el mandril.
  3. Para el corte, coloque el bloque de tejido congelado en el mandril criostato enfriado previamente. Transferir el tejido congelado con el mandril en una cámara de criostato y bajar la temperatura a entre -10 y -20 ° C, y cortar las rodajas de aproximadamente 8-10 m de espesor 23.
  4. Fijar las secciones con cytofixative (mezcla de alcohol isopropílico y polietilenglicol) mediante pulverización. Deje secar al aire las secciones durante 30 minutos a temperatura ambiente inmediatamente después de la pulverización, y almacenar a - 80 ºC hasta su uso posterior.
  5. Equilibrar las secciones de nuevo a temperatura ambiente y lavar tres veces con PBS.
  6. Manchar las secciones con isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con Griffonia simplicifolia isolectina B4 en una concentración de 1: 100 durante 10 minutos en PBS a temperatura ambiente (Figura 5) o con anticuerpo CD31 conjugado con PE a una concentración de 1: 100 durante 30 minutos en PBS a temperatura ambiente (Figura 6).
  7. Se lavan las secciones con PBS tres veces.
  8. Después del lavado, tinción de las secciones con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualizar los núcleos celulares. Montar las secciones de reactivo anti-fade y DAPI imagen (excitación a 345 nm, emisión a 455 nm), EGFP (excitación a 489 nm, emisión a 508 nm), y el rojo Nilo (excitación a 553 nm, emisión a 637 nm) con un microscopio de fluorescencia (Figuras 3, 5, 6).

7. La hibridación fluorescente in situ (FISH) para las secciones incluidas en parafina

  1. Preparar el FISH sonda marcada directamente con fluoróforo para el ADN de hibridación in situ por traslado de cortes utilizando un cromosoma artificial bacteriano que contiene el conjunto MCMV ADN Genome (pSM3fr) 19. La concentración de la sonda de FISH es 0,1 g / l.
  2. Desparafinar y rehidratar las diapositivas de los cerebros infectados 22.
  3. Tratar las secciones de tejido con RNasa (100 mg / ml en PBS) para detectar el ADN viral.
  4. Realizar la recuperación de antígenos con un NP40 0,05%, 0,01 M de tampón de citrato (pH 6,0) a 95-98 ° C durante 20 min. Enfriar los desliza hacia abajo a TA durante 20 min.
  5. En una cubeta de tinción Coplin vidrio, lavar los portaobjetos en agua pura tres veces durante 2 minutos cada vez. Realizar un paso de recuperación de antígeno adicional con una pepsina 0.06%, 0.01 solución de HCl N durante 5 min a 37 ° C.
  6. Se lavan los portas tres veces en agua pura durante 2 minutos cada vez en una cubeta de tinción Coplin vidrio.
  7. Deshidratar las secciones de tejido de nuevo mediante la transferencia de las diapositivas de 70% de etanol, a 85% de etanol y, a continuación, a 100% de etanol.
  8. Para preparar 10 ml de tampón de hibridación, la mezcla de 1,25 ml en sales de hibridación in situ (3 M NaCl, 100 mM Tris-HCl PH 8,0, 100 mM de fosfato de sodio pH 6,8, EDTA 50 mM) con 5 ml de formamida desionizada, 2,5 ml 50% de sulfato de dextrano, 250 l 50x solución de Denhardt, 125 l 100 mg / ml tRNA, y 875 l H 2 O.
  9. Diluir la sonda de ADN marcado directamente con fluoróforos que reconocen todo el genoma MCMV al azar en el tampón de hibridación. El volumen final debe ser de 10 l (tampón de hibridación 7 l, 1 l de sonda (0,1 mg / l), y 2 l de agua destilada).
  10. Añadir la mezcla de sondas (10 l) a cada diapositiva y cubrir con un cubreobjetos (15 x 15 mm). Sellar el cubreobjetos con cemento de goma. Desnaturalizar la mezcla de sonda durante 5 minutos a 85 ° C, y completar la etapa de hibridación O / N a 42 ° C.
  11. Se lavan los portas con un 0,3% de NP40, SSC 0,4x a 73ºC durante 2 minutos; con 0,1% de NP40, 0,4 x SSC a 73 ° C durante 1 min; y con 2x SSC dos veces.
  12. Contratinción los núcleos con DAPI (10 ng / ml) y cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos.
  13. Montarlas secciones de reactivo anti-fade y DAPI imagen (excitación a 345 nm, emisión a 455 nm) y EGFP (excitación a 489 nm, emisión a 508 nm) con un microscopio de fluorescencia (Figura 4).

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Resultados

En estudios sobre la patogénesis de la encefalitis viral, el método de infección es importante. La ruta hematógena representa una infección aguda de las células endoteliales y pericitos del cerebro, mientras que la ruta ICV representa una infección aguda a través de la difusión de CSF a través del espacio subaracnoideo, alcanzando a las meninges y el plexo coroideo. Para el análisis de la primera distribución de partículas en la encefalitis aguda, hibridación i...

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Discusión

En modelos animales, ICV, intraperitoneal, placenta directa, e infecciones IV se han utilizado para estudiar la patogénesis de la encefalitis viral. Nos centramos en los modelos de ICV e inyección IV de ratones recién nacidos por la simplicidad de los procedimientos y el beneficio de la inyección directa de partículas en la región de destino. Aunque la infección intraperitoneal es un método fácil, partículas virales propagan por vía sistémica a través de un proceso indirecto 5,24. infección plac...

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Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethaneSigma-AldrichT-6791
HClSigma-AldrichH-1758
pEGFP-N1 vector Clontech#6085-1
D-sorbitolSigma-AldrichS-1876
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06Spherotech, Inc.FP-00556-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3Spherotech, Inc.FP-0256-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2Spherotech, inc. FP-2056-2
10% mouse serumDAKO X0910
C57BL/6 mouseSLC, Inc.
ICR mouseSLC, Inc.
Modified Microliter Syringes (7000 Series)Hamilton company
35-gauge needleSaito Medical
A Wee Sight TransilluminatorPhillips Healthcare1017920
O.C.T.CompoundSakura Finetek4583
RNase ASigma-AldrichR4642
Nonidet(R) P-40Nacalai25223-04
citrate buffer (pH 6) x 10Sigma-AldrichC9999-100ml
pepsinSigma-AldrichP6887
EDTAdojindoN001
FormamideTCIF0045
Dextran sulfate sodium saltSigma-Aldrich42867-5G
Denhardt's Solution (50x)ThermoFishcer sceintific750018
Yeast tRNA (10 mg/ml)ThermoFishcer sceintificAM7119
SSC 20xSigma-AldrichS6639
DAPIThermoFishcer sceintificD1306
n-HexaneSigma-Aldrich296090
superfrost plus glassThermoFishcer sceintific12-55-18
Cytokeep IINippon Shoji Co.
FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4Vector laboratories, Inc.L1104
Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PEebioscience12-0311
ProLong  GoldThermoFishcer sceintificP36934
BIOREVOKEYENCEBZ-9000E

Referencias

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