新生児の脳へのウイルス粒子と蛍光マイクロビーズの脳室内および血管内注入

要約

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

要約

ウイルス性脳炎の病因に関する研究では、感染症法が重要です。脳への2つの主な感染経路の最初のは、脳の血管内皮細胞と周皮細胞の感染を伴う血行性経路、です。第二は、脳室内（ICV）ルートです。いったん中枢神経系（CNS）内で、ウイルスは脳脊髄液を介してくも膜下腔、髄膜、および脈絡叢に拡散する可能性があります。実験モデルでは、CNSのウイルス分布の初期段階では十分に特徴付けされていない、そして特定の細胞が最初に感染しているかどうかは不明です。ここでは、感染の急性期サイトメガロウイルス（CMV）の粒子の分布を分析し、新生児マウスの脳にICVまたは血管内（IV）注射の後、一次ウイルス血症と呼ばれます。 ICV注入モデルでは、マウスCMV（MCMV）、または蛍光マイクロビーズの5μlをmidpoiで側脳室に注入しましたntの27 G針を10μlのシリンジを使用して、耳と目の間。 IV注入モデルでは、35 G針を1 mlの注射器を使用しました。トランスイルミネーターは、新生児マウスの浅側頭（顔）静脈を可視化するために使用されました。私たちは、浅側頭静脈にMCMVまたは蛍光マイクロビーズの50μLを注入しました。脳を異なる時点注射後に回収しました。 MCMVゲノムは、in situハイブリダイゼーション法において使用して検出しました。組換えMCMV粒子を発現する蛍光マイクロビーズまたは緑色蛍光タンパク質を蛍光顕微鏡で観察しました。これらの技術は、脳炎の病因を研究するために、多くの他の病原体にも適用することができます。

概要

ウイルス性脳炎を研究する際に、ウイルス粒子の最初の分布は、疾患の病因を理解し、脳内のウイルスの標的を同定することが非常に重要です。パンドラウイルス属は、サイズが¹以上700 nmであるが、ほとんどのウイルスは、20〜300nm程度の大きさの範囲。感染の急性期におけるウイルス粒子の分布は、粒子の大きさ、細胞受容体の分布、またはウイルスの細胞受容体の親和性に依存し得ます。動物モデル、脳室内（ICV）で、腹腔内、直接胎盤、および静脈内（IV）感染症は、ウイルス性脳炎の病因を研究するために使用されてきました。ウイルスのICV接種は、多くの場合、中枢神経系（CNS）のマウスにおける感染を確立するために使用されます。この技術を用いた研究は、特に脳室周囲のゾーン内の細胞および脳脊髄液（CSF）、similaと直接接触している脳の領域において、広範な感染が報告しますウイルスventriculoencephalitisの影響にrを。アデノ随伴ウイルス（AAV）粒子の小さいサイズ（20 -直径25 nm）はICV感染^2-4の脳全体にその普及を促進します。腹腔内^5、直接胎盤^6、およびIV注射^7は、造血全身投与を表します。血液脳関門（BBB）を介してウイルス粒子の侵入は、それらが拡散ミクログリア結節^8,9を表し、新生児の脳の柔組織に到達することを可能にします。

サイトメガロウイルス（CMV）は、ヘルペスウイルスファミリーに属する一般的なウイルスです。米国では、50％ - 人の80％が年齢によってCMV感染があった40 CMV感染はまれに有害であるが、免疫不全患者や胎児疾患を引き起こす可能性があります。すべての配送のうち、0.2％ - 2％は、小頭症、脳室周囲石灰化、小脳形成不全、MICRなどの重篤な症状で、その結果、CMV ¹⁰を持って生まれています眼炎、視神経萎縮^11,12。また、精神遅滞、感音難聴、視覚障害、発作、およびてんかんは非致命的CMV感染の乳児^13,14の約10％に起こります。中枢神経系の機能不全は、CMV先天異常の最も一般的な特徴症状です。より多くの子供たちが永久にダウン症候群、胎児性アルコール症候群、または二分脊椎¹⁵よりも、先天性CMVが毎年無効になっています。現時点で入手可能なCMVに対しては予防接種は、安全かつ有効なワクチンの必要性を呼びかけ、ありません。感染の初期段階でそれらの受容体とCMV粒子の相互作用を研究することは、ワクチン接種の効果を理解することが重要です。

Ventriculoencephalitisとミクログリアの結節を拡散は、CMV脳炎¹⁶の二つの主要な病理学的特徴です。 （ - 300から150nm）感染aの急性期に脳を介して広がるCMV粒子がどのようにそれは不確かされ​​ていますndはどのように細胞受容体の分布やウイルスに対するそれらの親和性は、ウイルスの普及に貢献しています。川崎らは 、感染の初期段階での粒子およびその受容体の分布（β1インテグリン）の観点から、ICVおよびIV感染を評価しました。我々は、CMV粒子の普及とβ1インテグリンの発現がICVおよびIV感染⁸の両方で感染の初期段階ではよく相関していることを発見しました。 ICV感染はventriculoencephalitisのモデルであり、IV感染が拡散ミクログリア結節のモデルです。ウイルスや蛍光粒子のダイナミクスを研究することは、粒子サイズ、細胞受容体とウイルスの相互作用、および脳内のBBB透過のメカニズムの影響に関する有用な情報を与えるだろう。以下のプロトコルは、CNS内の任意のウイルス感染およびウイルスベクターを調査するために使用することができます。

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プロトコル

すべての実験プロトコルは、医学部の浜松大学の動物実験委員会によって承認されました。

MCMV（スミス株）および組換えの調製M32が強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）-MCMV

1. 以前に^8を説明し、 -組換えM32-EGFP-MCMVは（1.9 1.2）は以下のような方法に従って生成します。
2. 野生型MCMV（：U68299アクセッション番号）のスミス株由来の組換えウイルスを使用してください。挿入EGFP（4361塩基対; bp）の37089および41450塩基対（M32 - M31遺伝子座）との間にMCMVゲノム中の相同組換えによる。
3. M32、5'-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '（フォワードプライマー）、5：MCMV M32（41450ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅-右、以下のプライマーを用いて配列の遺伝子座に隣接する、39246 BP - 39286 bpのは、フランキング配列およびM31（37089を左「-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '（リバースプライマー）; M31、5'-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3'（フォワードプライマー）、5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 '（リバースプライマー）。
4. NheIおよびBamHI制限部位を用いてEGFP発現ベクターにM32軌跡を挿入します。 AflIIおよびXbaI部位を用いて、M32-EGFP -recombinantプラスミドにM31遺伝子座を挿入します。 EGFP - - M32からNheIおよびAflIIでM31系列 - EGFP - M32を切断M31組換えプラスミドおよびH ₂ Oに溶解し
5. MCMVの核に切断構築物をトランスフェクト（スミス株）相同組換えを誘導するためにエレクトロポレーションシステムを使用して、24時間の感染後（HPI）NIH3T3細胞をに感染し。
6. 3日後に感染、感染細胞のEGFP発現病巣のための6ウェルプレートで1 /千の比と、画面で非感染マウス胚繊維芽細胞（MEF）との共培養細胞で。
7. ハーヴ緑色蛍光病巣を含むウェルからSTウイルス含有上清および10倍に希釈します。精製のために、単一の緑色蛍光病巣を表示井戸を選択します。
8. すべての病巣が、限界希釈感染表示EGFPの発現に起因する場合には、ウイルス調製物には、野生型ウイルスが残っていないことを示す、純粋です。以前に^17を説明したようにプラークアッセイ法によりウイルスを定量化します。
9. 手袋とマスクを着用してバイオセーフティーレベル2の認定安全キャビネット内のMCMVを扱います。
10. 12日齢のICRマウス胚から調製したMEFにおける通過MCMV（スミス株）および組換えMCMVは、以前に^17を説明しました。
11. 16℃で20分間、3000×gで遠心分離することにより、感染MEF培養物の上清から細胞を除去します。
12. 超遠心機7万×gで40分間上清。トリス緩衝生理食塩水1mlにビリオンを含有するペレットを再懸濁し、予め形成直線Sに転送しますorbitol勾配（25％ - 70％）。 60分¹⁸ 70,000×gで再び超遠心分離器。
13. シリンジでビリオン含有バンドを収穫。 40分間70,000×gで、追加の超遠心分離工程によって収穫したビリオンをペレット。
14. 感染実験まで-80℃でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）と店舗1ml中のペレットを再懸濁します。
15. 以前^19に記載のようにプラークアッセイ法でウイルス力価を定量化します。
16. 透過型電子顕微鏡^{（TEM）8（} 図1B）によって、蛍光顕微鏡（ 図1A）及び粒子構造によって組換えMCMV粒子（489 nmで励起、508 nmでの発光）のEGFP発現を可視化します。

ナイルレッド蛍光マイクロビーズの作製

1. カルボキシル蛍光ナイルレッドマイクロビーズを購入し、直径に応じてチューブにマイクロビーズを500μlを置く（0.04-約0.06ミクロン、3.63×10 ¹²粒子; 0.1から0.3ミクロン、約5.75×10 ¹⁰粒子;および1.7から2.2ミクロン、約6.85×10 ⁷粒子）。
2. 任意のエンドトキシンを除去し、室温で滅菌水でビーズを再懸濁し、約1日0.1 M NaOHを500μlのビーズを扱います。
3. 使用前にRTでC57BL / 6マウスから得られた10％マウス血清をビーズO / Nを吸着します。
4. 骨材、渦ビーズを分離し、使用前に徹底的に超音波処理するには。

新生児マウスにMCMVおよび蛍光マイクロビーズの3 ICV注射

1. 12時間の明/暗サイクルの下で温度制御施設において通常の妊娠ICRマウスを維持します。新生児は、誕生日にP 0.5に指定されています。
2. 10μlのシリンジと70％アルコールで27 G針を滅菌します。
3. MCMVまたは蛍光マイクロを含む注射液（5μl）をロードします慎重にシリンジのプランジャーを引いて針にビーズ。
4. 4分 - 3氷の上でマウスを置くことによって新生児マウス（P 0.5）を抑制する。動物が麻酔下になると、麻酔の深さを決定するために、つま先ピンチ応答メソッドを使用します。
5. マーク約0.7場所で非毒性実験用ペンで注射部位-新生児ブレグマ（ 図2A）から1.0ミリメートルの尾- 1.0ミリメートルは、矢状縫合と0.7に横。
6. マークされた注射部位で頭蓋骨の表面に対して垂直の深針2ミリメートルを挿入します。参考のために、非毒性メーカーと針の先端から2ミリメートルをマーク。
7. ゆっくりと頭皮（ 図2B）を開くことなく、側脳室へのMCMV（約5×10 ⁵ PFU）の5μLを注入します。
8. マウスの別のグループ、蛍光マイクロビーズを含む5μlの液を注入（0.1から0.3ミクロン、約5.75×10 ⁸粒子）ではにより同じ方法。
9. 逆流を防止するために、プランジャの動きを中止した後、20秒 - ゆっくりと針10を除去します。
10. 運動や一般応答性が回復されるまで、暖かい容器に10分 - 回復するには、5のためのマウスを保持します。
11. 時点（3、12、24、48、及び72時間）、注射後の範囲において第5章に記載されているように脳を収穫。

新生児マウスにMCMVまたは蛍光マイクロビーズの4 IV注入

1. 4分 - 3氷の上でマウスを置くことによって新生児マウス（P 0.5）を抑制する。
2. Pで0.5新生児をMCMVの静脈内注射を行うために35 G針で1-mlの注射器を使用してください。
3. 浅側頭（顔）静脈を可視化するためにトランスイルミネーター（静脈ファインダー）を使用します。注射の前に、サージカルテープ（ 図2C）を使用して、トランスイルミネーターに新生児を確保。
4. 拡大鏡（1.5X）を装着したまま、ゆっくり（約5.45×MCMVの50μLを注入; 10 ⁹粒子）または蛍光マイクロビーズ（0.04から0.06ミクロン、約3.63×10 ¹¹粒子; 0.1から0.3ミクロン、約5.75×10 ⁹粒子;および1.7から2.2ミクロン、約6.85×10 ⁶粒子）浅側頭静脈へ（ 図2D）。
5. 針を除去した後、出血が止まるまで、注射部位に圧力を適用するために、70％のアルコールを含むガーゼを使用します。
6. 新生児を温かくコンテナはケージに戻す前に回復するには約5分を与えます。
7. 時点（3、12、24、及び72時間）、注射後の範囲において第5章に記載されているように脳を収穫。

パラフィン切片5.脳組織サンプルの調製

1. 砕いた氷の上の小さなプラスチック皿に注入された新生児を置きます。
2. 動物が麻酔下にあると、anesthesの深さを決定するために、つま先ピンチ応答メソッドを使用しIA。
3. 胸腔を開くために胸郭を通じて一つの中心または2の端の水平エンドカットを行います。
4. 鋭いハサミで心房内のカットを行います。心房中4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液を注入します。肝臓の自発運動（PFAダンス）と軽く色が​​観察されたときに灌流を停止します。放血しないで​​ください。
5. 最初のはさみのペアを使用してヘッドを除去することによって、（以前に^20を説明したように）新生児を解剖。
6. 頭蓋骨を露出するために鼻に首から外皮に沿って正中切開を行います。
7. 慎重に頭蓋骨の内面に沿ってスライドする、片側の大後頭孔にアイリスのはさみのペアの鋭い端を置きます。
8. 後部頭蓋骨表面の遠位端まで延びるカットを行い、対側で同一のカットを行います。小脳の周りの頭蓋骨を離れてオフにします。
9. 慎重に脳の損傷を防止するために、一方の側に頭蓋骨をバック剥離。これを繰り返し脳の反対側の作業を行います。
10. スパチュラを用いて、脳の腹側表面に沿って嗅球や神経の接続を断ちます。
11. 静かにまだハサミを使用して頭蓋骨に脳を接続し、脳を除去し、任意の硬膜をトリミング、頭から脳を分離します。
12. 4％PFAで4℃で24時間のための脳の少なくとも10倍のボリュームを含む固定液のバイアル中に脳を置きます。
13. 水を置換するために段階的エタノール浴の一連の組織を脱水してから、ブロックを形成し、パラフィンワックスで潜入。 ²¹ 4μmの厚さのスライスにミクロトームでパラフィンブロックをカット。
14. 脱パラフィン化し、感染した脳²²のスライドを再水和します。パラフィン包埋切片のためのin situハイブリダイゼーションに進んでください。

凍結切片6.脳組織サンプルの調製

1. 5.11から5.1に記載されている手順後の脳を削除してください。
2. 蛍光マイクロビーズおよびM32-EGFP-MCMVを観察するために、平底cryomoldsに切除脳を置きます。完全に脳試料をカバーするためにメディアを埋め込む追加。スナップは、チャックに取り付ける前にcryomoldsのエッジを保持するために鉗子を使用して、予備冷却のnヘキサン（-80ºC）でcryomoldsを凍結します。
3. 切片については、予冷クライオスタットチャック上に凍結組織ブロックを取り付けます。クライオスタットチャンバ内にチャックで凍結組織を移し、-10〜-20℃に温度を下げ、約8スライスカット- ²³厚さ10μmを。
4. 噴霧することによりcytofixative（イソプロピルアルコールおよびポリエチレングリコールの混合物）を持つセクションを修正しました。空気はすぐに噴霧した後、室温で30分間のセクションを乾燥し、でそれらを保存する - さらに使用するまで80ºC。
5. バックRTの切片を平衡化し、PBSで3回洗浄します。
6. Gを抱合フルオレセインイソチオシアネート（FITC）を持つセクションを染色1の濃度の100 RTでPBS中で10分間（ 図5）またはPE結合CD31抗体を用いた：riffoniaの1の濃度でB4イソレクチンsimplicifolia 100 RTでPBS中で30分間（ 図6）。
7. PBSで3回のセクションを洗ってください。
8. 洗浄後、細胞核を可視化するために4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を用いて切片を染色します。 、EGFP（489 nmで励起、508 nmでの発光）（345 nmで、455 nmでの発光での励起）抗退色試薬および画像DAPIのセクションをマウントし、ナイルレッド（553 nmで励起、637 nmでの発光）蛍光顕微鏡（ 図3、図5、図6）。

パラフィン包埋切片のためのin situハイブリダイゼーション（FISH）7.蛍光

1. 全体MCMV DNAの世代を含む細菌人工染色体を使用して、ニックトランスレーションによってin situハイブリダイゼーションDNAのための蛍光体で直接標識FISHプローブを準備します^{OME（pSM3fr）19。} FISHプローブの濃度は0.1μgの/μlです。
2. 脱パラフィン化し、感染した脳²²のスライドを再水和します。
3. ウイルスDNAを検出するためのRNase（PBS中100μg/ mlの）で組織切片を扱います。
4. 20分間98°C - 95で0.05％NP40、0.01 Mクエン酸緩衝液（pH6.0）で抗原回復を実行します。 20分間室温までスライドを冷却します。
5. ガラスコプリン染色ジャーに、2分間純水に各時間で3回スライドを洗浄します。 0.06％ペプシン、37℃で5分間、0.01 N HCl溶液で追加抗原回復手順を実行します。
6. すすぎを2分間ガラスコプリン染色ジャー内のたびに、純水で3回スライド。
7. 85％のエタノール、70％エタノールでスライドを転送することによって、再び組織切片を脱水し、その後、100％エタノール。
8. ハイブリダイゼーション緩衝液10mlを調製するための、in situハイブリダイゼーション塩1.25ミリリットル（3MのNaCl、100mMのTrisを混ぜます-HCl pHは8.0、5ミリリットルと100 mMのリン酸ナトリウムpH6.8の、50mMのEDTA）を脱イオンホルムアミド、2.5ミリリットル50％デキストラン硫酸、250μlの50×デンハルト溶液、125μlの100 mg / mlでのtRNA、および875μlのH ₂ O
9. 直接ハイブリダイゼーション緩衝液中にランダムに全MCMVゲノムを認識する蛍光団で標識されたDNAプローブを希釈します。最終容量は10μlの（7μlのハイブリダイゼーション緩衝液、1μlのプローブ（0.1μgの/μL）、および2μlの蒸留水）でなければなりません。
10. 各スライドにプローブミックス（10μl）を加え、カバースリップ（15×15ミリメートル）でカバー。ゴムセメントでカバースリップをシール。 85℃で5分間、プローブミックスを変性させ、そして42℃でのハイブリダイゼーション工程のO / Nを完了する。
11. 2分間73℃で0.3％NP40、0.4×のSSCでスライドを洗浄し; 0.1％NP40、1分間73℃で0.4×のSSCで、そして2×SSCで2回押します。
12. DAPIで核対比染色（10ng / ml）及びカバーガラスとスライドをカバーしています。
13. マウント蛍光顕微鏡（ 図4）を有する抗フェード試薬および画像DAPI（345 nmで励起、455 nmでの発光）とEGFP（489 nmで励起、508 nmでの発光）のセクション。

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結果

ウイルス性脳炎の病因の研究では、感染症法が重要です。 ICV経路が髄膜および脈絡叢に達し、クモ膜下腔を通してCSFを介して拡散する急性感染を表しながら血行性経路は、脳の血管内皮細胞と周皮細胞の急性感染を表します。 MCMVゲノム及びM32-EGFP-MCMV粒子または蛍光マイクロビーズの直接観察を検出するインサイチュハイブリダイゼーション急性脳炎中の粒子...

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ディスカッション

動物モデルでは、ICV、腹腔内、直接胎盤、およびIV感染症はウイルス性脳炎の病因を研究するために使用されてきました。私たちは、手続きの簡単さと標的領域へ​​の粒子の直接注入の利益のために新生児マウスのICVおよびIV注入モデルに焦点を当てました。腹腔内感染が容易な方法であるが、ウイルス粒子は、間接的なプロセス^5,24を介して全身に広がります。ダイレクト胎盤感染...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane	Sigma-Aldrich	T-6791
HCl	Sigma-Aldrich	H-1758
pEGFP-N1 vector	Clontech	#6085-1
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	S-1876
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06	Spherotech, Inc.	FP-00556-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3	Spherotech, Inc.	FP-0256-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2	Spherotech, inc.	FP-2056-2
10% mouse serum	DAKO	X0910
C57BL/6 mouse	SLC, Inc.
ICR mouse	SLC, Inc.
Modified Microliter Syringes (7000 Series)	Hamilton company
35-gauge needle	Saito Medical
A Wee Sight Transilluminator	Phillips Healthcare	1017920
O.C.T.Compound	Sakura Finetek	4583
RNase A	Sigma-Aldrich	R4642
Nonidet(R) P-40	Nacalai	25223-04
citrate buffer (pH 6) x 10	Sigma-Aldrich	C9999-100ml
pepsin	Sigma-Aldrich	P6887
EDTA	dojindo	N001
Formamide	TCI	F0045
Dextran sulfate sodium salt	Sigma-Aldrich	42867-5G
Denhardt's Solution (50x)	ThermoFishcer sceintific	750018
Yeast tRNA (10 mg/ml)	ThermoFishcer sceintific	AM7119
SSC 20x	Sigma-Aldrich	S6639
DAPI	ThermoFishcer sceintific	D1306
n-Hexane	Sigma-Aldrich	296090
superfrost plus glass	ThermoFishcer sceintific	12-55-18
Cytokeep II	Nippon Shoji Co.
FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4	Vector laboratories, Inc.	L1104
Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE	ebioscience	12-0311
ProLong  Gold	ThermoFishcer sceintific	P36934
BIOREVO	KEYENCE	BZ-9000E