신생아 뇌에 바이러스 성 입자와 형광 마이크로 비즈의 뇌실과 혈관 내 주입

요약

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

초록

바이러스 성 뇌염의 발병 기전에 대한 연구에서, 감염 방법이 중요하다. 뇌의 두 가지 경로 감염성의 첫 번째는 내피 세포 및 뇌 혈관 주위 세포의 감염을 포함 혈행 경로이다. 두 번째는 뇌 실내 (ICV) 경로이다. 일단 중추 신경계 (CNS) 내의 바이러스는 뇌척수액을 통해 거미 막밑 공간 수막 및 맥락총에 퍼져있다. 실험 모델에서, CNS 바이러스 분포의 초기 단계에있어서 잘되지 않으며, 이는 특정 셀은 초기 감염 불분명하다. 여기서, 우리는 감염의 급성 단계에서 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 입자의 분포를 분석 한 신생아 마우스의 뇌에 ICV 또는 혈관 내 (IV) 주입에 이어 바이러스 혈증 차 불린다. ICV 주사 모델에서, 쥐 CMV (MCMV) 또는 형광 마이크로 비드 5 μL은 midpoi의 뇌실 주입했다NT를 27 G 바늘 10 μL 주사기를 사용하여 귀와 눈 사이. IV를 주입 모델에서 35 G 바늘을 1 mL를 주사기를 사용 하였다. transilluminator가이 신생 마우스의 표면 시간적 (얼굴) 혈관을 시각화 하였다. 우리는 표면 시간적 정맥에 MCMV 또는 형광 마이크로 비즈의 50 μl를 주입. 뇌는 서로 다른 시간 지점 포스트 분사에 수확 하였다. MCMV 게놈은 현장 하이브리드 방식의를 사용하여 검출되었다. 재조합 MCMV 입자를 발현하는 형광 마이크로 비드 또는 녹색 형광 단백질의 형광 현미경으로 관찰 하였다. 이러한 기술 뇌염의 발병 기전을 조사하기 위해 많은 다른 병원균에 적용될 수있다.

서문

바이러스 성 뇌염을 연구 할 때, 바이러스 입자의 초기 분포 질환 발병 기전을 이해하고 뇌에서 바이러스 타겟을 식별하는 것이 매우 중요하다. Pandoravirus 크기가 ^1에서 700 개 이상의 나노가 있지만 대부분의 바이러스는 20 ~ 300 nm의에서 크기가 다양합니다. 감염의 급성 단계에서 바이러스 입자의 분포는 입자의 크기, 세포 수용체의 분포, 또는 바이러스에 대한 세포 수용체의 친화력에 의존 할 수있다. 동물 모델, 뇌실 (ICV), 복강 내, 직접 태반, 정맥은 (IV) 감염은 바이러스 성 뇌염의 발병 기전을 연구하는 데 사용되었다합니다. ICV 바이러스 접종은 종종 마우스에서 중추 신경계 (CNS) 감염을 확립하기 위해 사용된다. 이 기술을 사용하여 연구는 특히 뇌실 주위 영역의 셀 및 뇌척수액 (CSF), simila 직접 접촉 뇌의 영역에서 광범위하게 감염 신고바이러스 ventriculoencephalitis의 효과에 대한 연구. 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) 입자의 작은 크기 (20 - 25 nm의 직경)을 ICV 감염 ^2-4 뇌 전반에 걸쳐 그 보급을 용이하게한다. 복강 ^5, 직접 태반 ^6, IV 주사 ⁷ hematogenic 전신 투여를 나타냅니다. 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)을 통해 바이러스 입자의 침투들이 확산 소교 노쥴 ^8,9 나타내는 신생아의 뇌 실질에 도달 할 수있다.

거대 세포 바이러스 (CMV)는 헤르페스 바이러스 제품군에 속하는 흔한 바이러스입니다. 미국에서는 50 % - 국민의 80 %가 40 CMV 감염이 거의 유해하지만 면역 환자와 태아의 질병을 일으킬 수 있습니다 나이 CMV 감염이 있었다. 모든 배달 중 0.2 % - 2 %는 같은 소두증, 뇌실 주위 석회화, 소뇌 형성 부전, MICR 등의 심각한 증상을 초래, CMV ^(10)에 태어난안염, 및 시신경 위축 ^{(11, 12).} 또한, 정신 지체, 감각 신경성 난청, 시각 결함, 발작, 간질 비 치명적 CMV에 감염된 유아 ^{13, 14의} 약 10 %에서 발생한다. CNS 장애는 CMV 선천성 기형의 가장 흔한 특징적인 증상입니다. 더 많은 아이들이 영구적으로 다운 증후군, 태아 알코올 증후군, 또는 척추 피열 ^{(15)보다는} 선천성 CMV 매년 비활성화됩니다. 안전하고 효과적인 백신의 필요성을 요구, 본에서 CMV에 대한 어떤 예방 접종을 사용할 수 있습니다. 감염의 초기 단계에서 그 수용체와 CMV 입자의 상호 작용을 공부 백신의 효과를 이해하는 것이 중요하다.

Ventriculoencephalitis 및 확산 소교 결절은 CMV의 두 가지 주요 병리학 적 특성이 ^{16 뇌염} 있습니다. (- 300 내지 150 nm) 감염 (a)의 급성기에 뇌를 통해 확산 CMV 입자가 어떻게 불확실하고있다차 방법 세포 수용체의 분포 및 바이러스에 대한 자신의 친 화성이 바이러스 확산에 기여한다. 가와사키 외. ICV는 입자 및 감염의 초기 단계에서의 수용체 (β1 인테그린)의 분포의 관점에서 IV 감염을 평가했다. 우리는 CMV 입자와 β1의 인테그린의 발현의 보급이 잘 ICV 및 IV 감염 ⁽⁸⁾ 모두에서 감염의 초기 단계에 상관 관계가 있음을 발견했다. ICV 감염 ventriculoencephalitis의 모델 및 IV 감염 확산 소교 노쥴의 모델이다. 바이러스 또는 형광 입자의 역학을 공부하는 것은 입자 크기, 세포 수용체와 바이러스의 상호 작용, 뇌에 BBB 침투의 메커니즘의 효과에 대한 유용한 정보를 제공 할 것입니다. 다음 프로토콜은 CNS 어떤 바이러스 감염 및 바이러스 벡터를 조사하는데 사용될 수있다.

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프로토콜

모든 실험 프로토콜은 의과 대학의 하마 마츠 대학의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다.

MCMV (스미스 주) 및 재조합 1. 준비 M32이 강화 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) -MCMV

1. 등 이전에 ⁸ 설명 - (1.9 1.2) 다음과 같은 방법에 따라 재조합 M32-EGFP-MCMV 생성합니다.
2. 야생형 MCMV (: U68299 가입 번호)의 스미스 균주에서 유래 재조합 바이러스를 사용합니다. 삽입 EGFP (4361 염기쌍; BP) 37,089과 41,450 BP 사이 - 상동 재조합에 의해 MCMV의 게놈 (M32 M31의 궤적).
3. M32, 5'- CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(정방향 프라이머), 5 : 중합 효소 연쇄 반응에 의해 MCMV M32 증폭 (41,450 - 오른쪽 아래의 프라이머를 사용하여 서열 유전자 좌위의 측면에, 39246 BP - 39286 BP 시퀀스 및 M31 (37,089의 측면에 남아 '-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(역방향 프라이머); M31, 5'- CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3'(정방향 프라이머), 5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 '(역방향 프라이머).
4. 된 NheI과의 BamHI 제한 부위를 사용하여 EGFP 발현 벡터로 M32의 궤적을 삽입합니다. 를 AflII과를 XbaI 사이트를 사용하여 플라스미드 -recombinant M32-EGFP에 M31의 궤적을 삽입합니다. EGFP - - M32에서 된 NheI과를 AflII와 M31 시퀀스 - EGFP - M32 절단 M31 재조합 플라스미드와 H ₂ O에 용해
5. MCMV (스미스 균주)의 핵으로 절단 한 구조를 형질 감염은 상동 재조합을 유도하는 전기 시스템을 사용하는 NIH3T3 세포를 24 시간 후 감염 (HPI)를 -infected.
6. 삼일 후 감염, 감염된 세포의 EGFP 발현 초점을위한 여섯 웰 플레이트에 1 / 1,000의 비율과 화면에 감염되지 않은 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)와 공동 배양 세포에서.
7. Harve녹색 형광 초점을 포함하는 우물에서 성 바이러스 함유 상층 액과는 배로 희석. 정제를 들어, 하나의 녹색 형광 초점을 표시 우물을 선택합니다.
8. 모든 초점이 제한 희석 감염 디스플레이 EGFP 발현에 기인하는 경우, 바이러스 제제에는 야생형 바이러스가 남아 있는지 나타내는 순이다. 이전 ¹⁷ 바와 같이 플라크 분석 방법에 의해 바이러스를 정량화.
9. 장갑과 마스크를 착용 바이오 안전성 레벨 2에서 인증 바이오 안전성 캐비닛에 MCMV을 취급합니다.
10. 12 일 된 ICR 마우스 배아에서 준비 MEFs에의 통로 MCMV (스미스 주) 및 재조합 MCMV는 이전 ^{17 설명했다.}
11. 16 ° C에서 20 분 동안 3,000 × g에서 원심 분리하여 감염 MEF 문화의 상층 액에서 세포를 제거합니다.
12. 초 원심 분리기 70,000 × g에서 40 분 동안 상층 액. TBS 버퍼 1 ml의 비리 온을 함유하는 펠렛을 재현 탁하고, 미리 형성된 선형들에 전송할orbitol 구배 (25 % - 70 %). 60 분 ¹⁸ 초 원심 분리기 다시에서 70,000 × g으로.
13. 주사기와 비리 함유 밴드를 수확. 40 분 동안 70,000 × g에서 추가 초 원심 분리 단계에서 수확 비리 펠렛.
14. 감염 실험 전까지 -80 ° C에 인산 완충 용액 (PBS) 및 저장 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁.
15. 이전 ¹⁹ 바와 같이 플라크 분석 방법에 의해 바이러스 역가를 정량화.
16. 형광 현미경 (도 1a) 및 투과 전자 현미경 (TEM) ⁽⁸⁾ (도 1B)에 의해, 입자 구조에 의해 (489 내지 508 nm에서의 방출에 여진) 재조합 MCMV 입자의 EGFP 발현 시각화.

나일 레드 형광 마이크로 비즈 2. 준비

1. 구매 카르 복실 형광 나일 레드 마이크로 비드 및 직경에 따라 튜브에 마이크로 비즈 500 μl를 배치 (0.04- 약 0.06 μm의, 3.63 × 10 ⁽¹²⁾ 입자; 0.1 - 약 5.75 × 10 ⁽¹⁰⁾ 입자 0.3 μm의; 및 1.7-2.2 μm의 약 6.85 × 10 ⁷ 입자).
2. 모든 독소를 제거하고 실온에서 멸균 물에 비드를 재현 탁 약 1 일 동안 0.1 M NaOH를 500 μl의 구슬을 취급합니다.
3. 사용하기 전에 실온에서 C57BL / 6 마​​우스에서 얻은 10 % 마우스 혈청 비드 O / N을 흡착.
4. 집계, 소용돌이 구슬을 분리하고 사용하기 전에 철저하게 초음파 처리합니다.

신생아 마우스로 MCMV 및 형광 마이크로 비즈의 3 ICV 주입

1. 12 시간 조명 / 어두운주기에 따라 온도 제어 설비의 정상적인 임신 한 ICR 마우스를 유지한다. 신생아는 출생의 날에 P 0.5로 지정되어 있습니다.
2. 10 μL 주사기와 70 % 알코올로 27 G 바늘을 소독.
3. MCMV 형광 마이크로 함유하는 주사액 (5 μL)을로드조심스럽게 주사기의 플런저를 당겨 바늘에 구슬.
4. 4 분 - 3 얼음에 마우스를 넣어 신생아 마우스 (P 0.5)을 억제. 동물이 마취되면 마취 깊이를 결정하기 위해 TOE 핀치 응답 방법을 사용한다.
5. 표 0.7 위치에서 비 독성 실험 펜 주사 부위 - 1.0 mm의 시상 봉합 0.7 측 방향 - 신생아 브레 그마 (도 2a)에서 1.0 mm의 꼬리.
6. 바늘에게 표시된 주사 부위의 두개골 표면에 수직 깊이 2mm를 삽입합니다. 참고로, 무독성 메이커 바늘의 선단으로부터 2mm를 표시한다.
7. 천천히 두피 (그림 2B)를 열지 않고 측면 뇌실에 MCMV (약 5 × 10 ⁵ PFU)의 5 μl를 주입.
8. (- 약 5.75이 0.3㎛, 입자 × ¹⁰⁸ 0.1)에 의한 마우스의 다른 군에서는 형광 마이크로 비드를 함유하는 5 μL 용액을 주입동일한 방법.
9. 역류를 방지하기 위해 플런저 운동을 중단 한 후 20 초 - 천천히 바늘 (10)를 제거합니다.
10. 복구 5 쥐를 유지하기 위해 - 이동 및 일반 응답이 복원 될 때까지 따뜻한 용기에 10 분.
11. 시점 (3, 12, 24, 48, 72 시간) 후 분사의 범위에서 (5)에 기재된 바와 같이 뇌 수확.

신생아 마우스로 MCMV 또는 형광 마이크로 비즈 4. IV 주입

1. 4 분 - 3 얼음에 마우스를 넣어 신생아 마우스 (P 0.5)을 억제.
2. P에서 0.5 신생아를 MCMV의 정맥 주사를 수행하기 위해 35 G 바늘 1 ml의 주사기를 사용합니다.
3. 피상적 시간 (얼굴) 정맥을 시각화하기 위해 transilluminator가 (맥 파인더)를 사용합니다. 주입하기 전에 수술 테이프 (그림 2C)를 사용하여 transilluminator가에 신생아를 고정합니다.
4. (1.5 배)를 돋보기 안경을 착용하는 동안, 천천히 MCMV (약 5.45 × 50 μl를 주입; 10 ⁹ 입자) 또는 형광 마이크로 비드 (0.04 - 약 0.06 μm의, 3.63 × 10 ⁽¹¹⁾ 입자 0.1 - 약 0.3 μm의, 5.75 × 10 ⁹ 입자 및 1.7-2.2 μm의 약 6.85 × 10 ⁶ 입자)가 표면 ​​시간적 정맥에 (그림 2D).
5. 바늘을 제거한 후 출혈이 중단 될 때까지 주입 부위에 압력을 70 % 에탄올을 함유하는 거즈를 사용한다.
6. 신생아에게 따뜻한 용기를 케이지에 반환하기 전에 복구하는 약 5 분을 제공합니다.
7. 시점 (3, 12, 24, 72 시간) 후 분사의 범위에서 (5)에 기재된 바와 같이 뇌 수확.

파라핀 섹션 5. 뇌 조직 샘플 준비

1. 짓 눌린 된 얼음에 작은 플라스틱 접시에 주입 된 신생아를 놓습니다.
2. 동물이 마취되면 anesthes의 깊이를 결정하기 위해 TOE 핀치 응답 방법을 사용아이오와.
3. 흉강을 열어 흉곽을 통해 하나의 중앙 또는 두 개의 끝 수평 최종 컷을 확인합니다.
4. 날카로운 가위로 중앙 홀에 상처를 확인합니다. 아트리움에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 솔루션을 달이다. 간 자발적인 움직임 (PFA 춤)과 경량화 색이 관찰 될 때 관류를 중지합니다. 에게서 피를 뽑다하지 마십시오.
5. 제 가위를 이용하여 헤드를 제거하여 ⁽²⁰ 같이 ^이전에 설명) 신생아 해부.
6. 두개골을 노출하는 코, 목의 외피를 따라 중간 선 절개를합니다.
7. 신중 두개골의 내면을 따라 슬라이딩 한쪽 난원 매그넘로 홍채 가위의 날카로운 단부를 배치했다.
8. 후방 두개골 표면의 선단까지 연장 상처를 확인하고 반대쪽 측면에 동일한 상처를합니다. 소뇌 주위의 두개골을 멀리 취소합니다.
9. 조심 뇌 손상을 방지하기 위해 한쪽 두개골을 벗겨. 이 과정을 반복뇌의 반대편에 절차.
10. 주걱을 사용하여, 뇌의 복부 표면을 따라 후각 신경 전구 연결을 단절.
11. 부드럽게 아직 가위를 사용하여 두개골에 뇌를 연결하고 뇌를 제거하는 경질 트리밍, 머리에서 뇌를 분리합니다.
12. 4 % PFA 4 ° C에서 24 시간 동안 뇌의 10 배 이상 볼륨을 포함 정착의 유리 병에서 뇌를 놓습니다.
13. 물 변위 등급 에탄올 욕의 일련의 조직을 탈수하고 블록을 형성하는 파라핀 왁스 침투. ²¹ 4 μm의 두께 조각으로 마이크로톰으로 파라핀 블록을 잘라.
14. Deparaffinize는 감염된 뇌 ^(22)의 슬라이드를 재수합니다. 파라핀 포함 된 섹션에 대한 현장 하이브리드에서 진행합니다.

냉동 섹션 6. 뇌 조직 샘플 준비

1. 5.1에 설명 된 단계에 따라 뇌를 제거 - 5.11.
2. 형광 마이크로 비드 및 M32-EGFP-MCMV을 관찰하기 위해 평평한 바닥 cryomolds에 절제 뇌를 놓습니다. 완전히 뇌 샘플을 커버하는 매체를 포함 추가합니다. 스냅 척에 부착하기 전에 cryomolds의 가장자리를 유지하는 집게를 사용하여, 예냉 N 헥산 (-80 ° C)에서 cryomolds 동결.
3. 절편의 경우, 미리 냉각 된 저온 유지 척에 고정 된 조직 블록을 연결합니다. 그라 이오 스탯 챔버로 척에 고정 된 조직을 전송하고 -10 내지 -20 ° C까지 온도를 낮추고, 약 8 조각 컷 - ²³ 10 μm의 두께를.
4. 분무 cytofixative (이소 프로필 알코올, 폴리에틸렌 글리콜의 혼합물)와 섹션을 수정합니다. 공기는 즉시 살포 후 실온에서 30 분 동안 섹션을 건조하고, 그들을 저장 - 더 사용할 때까지 80 ºC.
5. 다시 RT에 대한 섹션을 평형과 PBS로 3 회 세척한다.
6. G를 π 공역 계 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC)와 섹션을 얼룩1의 농도로 100 RT에서 PBS에 10 분 동안 (도 5) 또는 PE 공역 CD31 항체 : riffonia의 1의 농도로 B4 동종 렉틴 Simplicifolia의 100 RT에서 PBS에 30 분 동안 (도 6).
7. PBS로 3 회 섹션을 씻으십시오.
8. 세척 후, 세포 핵을 시각화 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)로 부분을 염색. , EGFP (489 nm에서 여기, 508 nm에서 방출) (345 nm의, 455 nm에서 방출에 여기) 안티 - 페이드 시약 및 이미지 DAPI의 섹션을 탑재하고, 나일 레드 (553 nm에서 여기, 637 nm에서 방출) 형광 현미경 (도 3, 5, 6).

파라핀 임베디드 섹션에 대한 현장 하이브리드 (FISH) 7. 형광

1. 전체 MCMV DNA 세대를 포함하는 박테리아 인공 염색체를 사용하여 닉 번역에 의해 현장 하이브리드의 DNA에 대한 형광 직접 표시된 FISH 프로브를 준비오메 (pSM3fr) ^19. 물고기 프로브의 농도는 0.1 μg의 / μL이다.
2. Deparaffinize는 감염된 뇌 ^(22)의 슬라이드를 재수합니다.
3. 바이러스의 DNA를 검출 된 RNase (100 μg의 PBS / ㎖)로 조직 절편을 치료.
4. 20 분 동안 98 ° C - 0.05 %의 NP40, 95에서 0.01 M 구연산 완충액 (pH 6.0)으로 항원 검색을 수행합니다. 20 분 동안 RT까지 슬라이드 쿨.
5. 유리 코 플린 염색 항아리에서 2 분마다 순수한 물에 세 번 슬라이드를 씻는다. 0.06 %의 펩신, 37 ° C에서 5 분 동안 0.01 N HCl 용액과 추가 항원 검색 단계를 수행합니다.
6. 린스는 2 분 동안 유리 코 플린 염색 항아리마다 순수한 물에 세 번 슬라이드.
7. 85 % 에탄올로 한 후 100 % 에탄올, 70 % 에탄올로부터 슬라이드를 전송하여 다시 조직 절편을 탈수.
8. 혼성화 완충액 10 ㎖를 제조 원위치 혼성화 염 (3 M의 NaCl, 100 mM 트리스 1.25 ml에 섞어-HCl pH가 8.0, 5 ㎖ 탈 포름 아미드 100 mM의 인산 나트륨 pH가 6.8, 50 mM의 EDTA), 2.5 ml의 50 % 덱스 트란 설페이트, 250 ㎕의 50X 덴 하르트 용액, 125 μL의 100 ㎎ / ㎖의 tRNA 및 875 μL의 H ₂ O.
9. 직접 혼성화 버퍼에 임의로 전체 MCMV 게놈 인식 형광 표지 한 DNA 프로브를 희석. 최종 부피는 10 μL (7 ㎕의 하이브리드 버퍼, 1 μL 프로브 (0.1 μg의 / μL), 2 ㎕의 증류수)해야한다.
10. 각 슬라이드에 프로브 믹스 (10 μl를) 추가 및 커버 슬립 (15 × 15mm)을 다룹니다. 고무 시멘트와 커버 슬립을 밀봉합니다. 85 ° C에서 5 분 동안 프로브 믹스 변성, 42 ℃에서 하이브리드 화 단계 O / N을 완료.
11. 2 분 동안 73 ° C에서 0.3 % NP40, 0.4 배의 SSC와 슬라이드를 씻으; 0.1 % NP40, 1 분 동안 73 ° C에서 0.4 배의 SSC와; 및 2 배 SSC와 두 번.
12. DAPI (10 NG / ㎖)로 커버 슬립을 슬라이드 커버 핵 Counterstain과.
13. 산형광 현미경 (그림 4) 안티 - 페이드 시약 및 이미지 DAPI (345 nm에서 여기, 455 nm에서 방출) 및 EGFP (489 nm에서 여기, 508 nm에서 방출)의 섹션.

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결과

바이러스 성 뇌염의 발병 기전에 대한 연구에서, 감염 방법이 중요하다. ICV 경로는 급성 감염, 지주막 하 공간을 통해 CSF를 통해 확산 수막 및 맥락막 얼기에 도달 나타내는 반면, 혈행 경로, 내피 세포와 뇌의 혈관 주위 세포의 급성 감염을 나타냅니다. MCMV 게놈 및 M32-EGFP-MCMV 입자 또는 형광 마이크로 비드의 직접 관찰을 검출 계내 혼성화 급성 뇌염 입자의 1 ...

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토론

동물 모델, ICV, 복강 내, 직접 태반 및 IV 감염에 바이러스 성 뇌염의 발병 기전을 연구하는 데 사용되었다. 우리는 절차의 간략화와 목표 영역에 입자를 직접 주입의 이익을 위해 신생 마우스의 ICV 및 IV 주입 모델에 초점을 맞추었다. 복강 내 감염 쉬운 방법이지만, 바이러스 입자는 간접 공정 ^{5, 24을} 통해 체계적으로 확산. 직접 태반 감염은 배아 전신 감염을 연구 할 수있는 좋은 방법입니...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane	Sigma-Aldrich	T-6791
HCl	Sigma-Aldrich	H-1758
pEGFP-N1 vector	Clontech	#6085-1
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	S-1876
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06	Spherotech, Inc.	FP-00556-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3	Spherotech, Inc.	FP-0256-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2	Spherotech, inc.	FP-2056-2
10% mouse serum	DAKO	X0910
C57BL/6 mouse	SLC, Inc.
ICR mouse	SLC, Inc.
Modified Microliter Syringes (7000 Series)	Hamilton company
35-gauge needle	Saito Medical
A Wee Sight Transilluminator	Phillips Healthcare	1017920
O.C.T.Compound	Sakura Finetek	4583
RNase A	Sigma-Aldrich	R4642
Nonidet(R) P-40	Nacalai	25223-04
citrate buffer (pH 6) x 10	Sigma-Aldrich	C9999-100ml
pepsin	Sigma-Aldrich	P6887
EDTA	dojindo	N001
Formamide	TCI	F0045
Dextran sulfate sodium salt	Sigma-Aldrich	42867-5G
Denhardt's Solution (50x)	ThermoFishcer sceintific	750018
Yeast tRNA (10 mg/ml)	ThermoFishcer sceintific	AM7119
SSC 20x	Sigma-Aldrich	S6639
DAPI	ThermoFishcer sceintific	D1306
n-Hexane	Sigma-Aldrich	296090
superfrost plus glass	ThermoFishcer sceintific	12-55-18
Cytokeep II	Nippon Shoji Co.
FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4	Vector laboratories, Inc.	L1104
Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE	ebioscience	12-0311
ProLong  Gold	ThermoFishcer sceintific	P36934
BIOREVO	KEYENCE	BZ-9000E