فحص من التصاق تحت إجهاد القص لدراسة تي اللمفاويات-التصاق جزيء التفاعلات

Summary

يوفر هذا الاختبار تدفق التصاق بسيط، نموذج تأثير ارتفاع تي التفاعلات خلية الخلايا الظهارية. ويستخدم ضخ حقنة لتوليد إجهاد القص، ومتحد البؤر المجهر يلتقط الصور لتقدير. والهدف من هذه الدراسات هو تحديد فعالية الخلايا التائية التصاق باستخدام ظروف التدفق.

Abstract

وعموما، التصاق الخلايا التائية هو عنصر حاسم من وظيفة، والمساهمة في عمليات متميزة من تجنيد الخلايا إلى مواضع الالتهابات والتفاعل مع خلايا مقدمة للمستضد (APC) في تشكيل نقاط الاشتباك العصبي المناعية. هذه السياقات اثنين من الخلايا التائية التصاق تختلف في أن تي التفاعلات خلية APC يمكن اعتبار ثابت، في حين تحدى التفاعلات سفينة تي خلية الدم عن طريق إجهاد القص الناتجة عن التداول نفسها. تصنف التفاعلات تي خلية APC ك ثابتة في هذا الشريكين الخلوية والثابتة بالنسبة لبعضها البعض. عادة ما يحدث هذا التفاعل داخل الغدد الليمفاوية. كما تفاعل الخلايا التائية مع جدار الأوعية الدموية، والخلايا تعتقل ويجب أن تقاوم إجهاد القص ولدت ^1،2 هذه الخلافات تبرز الحاجة إلى فهم أفضل التصاق ثابت والتصاق في ظل ظروف تدفق كما عمليتين تنظيمية متميزة. تنظيم الخلايا التائية التصاق يمكن وصفها بصورة أكثر إحكاما كما يخدعالتصيد الدولة تقارب من إنتغرين الجزيئات أعرب على سطح الخلية، وبالتالي تنظيم تفاعل integrins مع بروابط جزيء التصاق أعرب على سطح الخلية التفاعل. فهمنا الحالي للتنظيم حالات تقارب إنتغرين يأتي من كثير من الأحيان التبسيط في نظم نموذج المختبر. مقايسة للالتصاق تستخدم ظروف تدفق الموصوفة هنا يسمح لتصور وتقدير دقيق للتي التفاعلات خلية الخلايا الظهارية في الوقت الحقيقي بعد التحفيز. التصاق تحت فحص التدفق يمكن تطبيقها على دراسات من الالتصاق مما يشير إلى داخل الخلايا T بعد العلاج مع المواد المثبطة أو تنشيطية. بالإضافة إلى ذلك، هذا الاختبار يمكن توسيع خارج الخلايا التائية يشير إلى أية مجموعة من السكان لاصقة الكريات البيض وأي زوج جزيء إنتغرين التصاق.

Introduction

تي اللمفاويات التصاق يتوسط عددا من العمليات المتميزة في نظام صحي المناعي، ³ لعب أدوارا حاسمة في الاتجار الخلايا التائية وتقديم المستضد. سواء خلال مراقبة محصنة أو استجابة مناعية نشطة هذه دورين واسعة للالتصاق حاسمة. ⁴ أحداث الإشارات الفيزيولوجية للتي التفاعلات خلية خلية البطانية تختلف عن الخلايا التائية مستضد تقديم الخلية (APC) التفاعلات، وبالتالي تتطلب أساليب متميزة من دراسة لفهم أفضل السلاسل يشير المعنية. التصاق متين من الخلايا التائية لجدار الأوعية الدموية خلال تسرب لمفاوية يتطلب تفعيل إنتغرين سريع وديناميكي. التفاعل الوثيق بين نشط إنتغرين والتصاق جزيئات دولة على طول البطانة يؤدي إلى مقاومة لتدفق الدم التصاق، مما يسمح للخلايا T على الزحف على طول السطح بحثا عن مساحة متساهلة لمرور الخلية. ⁵ في الزحف من خلية ثنائية T -directionally ألونالجا جدار الأوعية الدموية وتعتمد على التصاق الاستقطاب، مع الواجهة الأمامية لاصقة متميزة من الخلايا التائية. ⁶ والأهم من ذلك، التصاق وطيد والتهجير تتطلب مقاومة لقوة القص الناتجة عن تعميم تدفق الدم.

عند تصميم التجارب لدراسة الخلايا اللمفاوية التصاق، وينبغي إيلاء الاهتمام لحافز معين من الاهتمام. في حين إنتغرين تفعيل هو عنصر مشترك وحاسم من كل أشكال الخلايا التائية الالتصاق، من المرجح أن تكون فريدة من نوعها المصب من مستقبلات الفردية وشارك في مستقبلات أجهزة الطرد المركزي من التنشيط. وعلى نحو مماثل، تعمل إنتغرين والتصاق جزيء أزواج في microenvironments المتخصصة وعلى القطعان محددة. وبهذه الطريقة، يمكن تنظيم هذه الأزواج بشكل مختلف تماما. والنموذج المقدم هنا هو المثالي لدراسة الإشارات شلالات مما يؤدي إلى إنتغرين تفعيل تجري في ظل ظروف إجهاد القص. ⁷ هذه التفاعلات لا يمكن أن يفهم على نحو كاف في اللصق ثابتعلى النظام بسبب تأثير وقد ثبت هذه القوات لديها مباشرة على سلوك الخلايا التائية. ⁸ وعلى الرغم من قدم هنا مع خلايا T وشو الخلايا (الصينية الهامستر المبيض) هندسيا للتعبير عن (خلايا CHO-ICAM) البشري ICAM-1 يمكن للنظام بسهولة يمكن تعديلها لدراسة مختلف السكان الكريات البيض أو جزيئات الالتصاق.

يوفر هذا الاختبار طريقة لتحديد تي الإلتصاق خلية وتفعيل إنتغرين باستخدام إجهاد القص، تقديم نموذج للمرحلة الالتصاق ثابتة من تسرب الكريات البيض. من خلال استخدام الخلايا CHO-ICAM تقارب من LFA-1 ليجند في الخلايا الحية يمكن فحص في الوقت الحقيقي في الاستجابة للمؤثرات مختلفة من الفائدة. هذا الأسلوب يتطلب الحصول عليها بسهولة، وهي متاحة تجاريا غرف تدفق الصغيرة في توليفة مع ضخ حقنة، وتبسيط كبير من المعدات اللازمة لنموذج تدفق الدم وإجهاد القص بالمقارنة مع النماذج الأخرى. ⁹ ميزة رئيسية أخرى من هذا الاختبار هو أن إشارات محددةشلالات وما يترتب عليها من الدولة تفعيل integrins الفردية يمكن دراسة نظيفة من خلال استخدام الخلايا CHO المهندسة التعبير عن جزيئات الالتصاق الإنسان من الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، فإن الجمع بين البيانات الكمية مع التصوير الخلية الحية هو ميزة كبيرة لهذا الأسلوب. وبشكل عام، في حين تم وصف عدد من المقايسات من ساكنة التصاق الخلايا التائية التي نموذج لطيف تفاعلات الخلايا التائية، APC، وهذه النماذج ليست كافية في الاستيلاء على عملية ديناميكية تي التصاق الخلايا الظهارية. لهذا السبب، عند اختيار مقايسة التصاق التحفيز في مسألة يجب النظر فيها.

Protocol

1. الطلاء خلايا CHO-ICAM

ملاحظة: إن الهدف من هذه الخطوة هو لوحة الخلايا CHO-ICAM في غرف تدفق للنمو بين عشية وضحاها بهدف توليد أحادي الطبقة متموجة.

1. الحفاظ على خلايا CHO-ICAM في الأنسجة الثقافة تعامل أطباق ثقافة 10 سم في 10 مل سائل الإعلام RPMI تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (CHO-ICAM وسائل الإعلام ثقافة كاملة) عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO _2.
2. لجمع الخلايا، إضافة 1 مل 0.5٪ التربسين-EDTA ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة مع اهتزاز لطيف. تحييد التربسين مع 4 مل من وسائل الاعلام.
3. عد الخلايا CHO-ICAM باستخدام عدادة الكريات وحساب 0.75 × 10 ⁵ خلايا لكل غرفة. ملاحظة: في هذه التجربة: سوف تكون هناك حاجة إلى 2.25 × 10 ⁵ خلايا البذور 3 غرف.
4. الطرد المركزي 0.75 × 10 ⁵ خلايا CHO-ICAM في غرفة لمدة 5 دقائق في 500 x ج، درجة حرارة الغرفة و resuspend بيليه الخلية في 30 ميكرولتر في غرفة CHO-ICAM وسائل الإعلام ثقافة كاملة.
   ملاحظة: في هذه التجربة سوف تكون هناك حاجة إلى 90 ميكرولتر البذور 3 غرف.
5. إضافة ببطء الخلايا في خزان واحد من غرفة التدفق. السماح للخلايا ليستقر لمدة 5 دقائق في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.
6. إضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة كاملة عبر اثنين من الخزانات من كل غرفة. إضافات بديلة بين البلدين لتجنب حركة الخلايا كما equilibrates النظام.
7. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها داخل الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.

2. إعداد خلايا T

ملاحظة: يمكن أن يتم هذا الاختبار مع الخلايا البشرية تي الأولية أو خط الخلايا التائية. وقد وصفت بروتوكول للالخلايا التائية العزلة من الدم في وقت سابق. ¹⁰ إذا باستخدام خلايا T الإنسان الأساسي تستخدمه الخلايا المعزولة حديثا حصول على أفضل النتائج. في حالة استخدام خط الخلايا التائية، اتبع بروتوكول الثقافة التي يحددها مصدر للخلايا. من أجل الكشف عن الخلايا على microsco الفلورسنتالمؤسسة العامة وصفت خلايا T مع كربوكسي استر succinimidyl فلوريسئين (CFSE).

1. عد الخلايا T باستخدام عدادة الكريات وحساب 2 × 10 ⁶ خلايا لكل غرفة. ملاحظة: في هذه التجربة، سوف تكون هناك حاجة إلى 6 × 10 ⁶ خلايا لمدة 3 غرف.
2. الطرد المركزي 2 × 10 ⁶ خلايا تي في غرفة لمدة 5 دقائق في 500 x ج، درجة حرارة الغرفة وresuspend الخلايا في 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 1٪ جلوكوز أو 2٪ FBS.
3. إضافة CFSE في 1: 1000 تخفيف (الأسهم تبذل ل5 ملم). تغطية من الضوء واحتضان لمدة 8 دقائق على RT
4. تدور في 500 x ج لمدة 5 دقائق، RT.
5. و resuspend الخلية بيليه مع 240 ميكرولتر في حالة (انظر القسم 4 "لاحظ") من RPMI وسائل الإعلام التي تفتقر إلى مصل. في هذه التجربة، resuspend الكرية الخلية في 720 ميكرولتر من عادي RPMI. تقسيم الخلايا في فارغة 1.5 مل أنابيب المسمى لكل غرفة، 240 ميكرولتر في أنبوب. إبقاء الخلايا في كتلة C الحرارة 37 درجة حتى الاستخدام.

3. إعداد اله الإدخال / الإخراج السقاية ومضخة الحقنة

1. تدفئة المجهر غرفة التصوير الحية إلى 37 درجة مئوية.
2. إعداد الخراطيم المدخلات:
   1. ملء زجاجة 500 مل بالماء وجعل 2 ثقوب في غطاء. تسمية الثقوب "في" و "الخروج". وهذا بمثابة حمام تسخين المياه لوسائل الإعلام الإدخال.
   2. تشغيل المدخلات الخراطيم من خلال الفتحات الموجودة في غطاء وفي حمام مائي. تأكد من أن جانب من الخراطيم التي تصل إلى حقنة يأتي من خلال "في" حفرة والجانب الذي سيربط إلى الخزان مدخلات يأتي من خلال ثقب "للخروج".
   3. تدفق المدخلات الخراطيم مع 60 مل من الماء لإزالة أي الهواء من النظام.
   4. رئيس إدخال الخراطيم مع وسائل الاعلام RPMI تفتقر المصل تحسنت إلى 37 درجة مئوية. حقنة ملء 60 مل، ودفع من خلال وسائل الإعلام حتى الخراطيم وتستعد تماما وتفتقر إلى أي فقاعات الهواء.
      ملاحظة: اعتمادا على lengtح من الأنابيب المستخدمة الحجم المطلوب لرئيس الوزراء سوف تختلف.
      1. حساب حجم وسائل الإعلام اللازمة للتجربة عن طريق ضرب معدل التدفق (هنا 0.3 مل / دقيقة) من قبل عدد من دقائق (5 دقائق) من قبل عدد من الغرف في التجربة (هنا 3)؛ في هذه التجربة، استخدم 4.5 مل سائل الإعلام. ملاحظة: نوصي بعد 5 مل حجم إضافي (هنا مجموعها 9.5 مل) المتبقية في المحاقن بعد فتيلة.
   5. وضع الإعداد مدخلات بأكمله في العلبة التصوير المباشر لالمجهر للحفاظ على 37 درجة مئوية. تشغيل الخراطيم والمحاقن للخروج من القوقعة وتحميل حقنة في ضخ حقنة.
3. إعداد الخراطيم الإخراج:
   1. جعل ثقب في غطاء زجاجة 250 مل لاستخدام النفايات الانتاج.
   2. تشغيل أنابيب الانتاج من خلال ثقب وفي زجاجة. تأمين فضفاضة غطاء، لا تغلق على طول الطريق.
   3. وضع الإعداد الإخراج إلى العلبة التصوير المباشر لميلcroscope.
4. حساب معدل تدفق (مل / دقيقة) الضروري لتوليد إجهاد القص المطلوب (داين / سم ^2). يختلف إجهاد القص في مقصورات الأوعية الدموية المختلفة، وبالتالي تأخذ بعين الاعتبار نموذج شامل بما في ذلك أنواع الخلايا لدراستها والعلاجات عند اتخاذ قرار بشأن مستوى إجهاد القص.
   ملاحظة: يتم إجراء هذه التجارب على 0.4 داين / سم ² لتقليد بشكل وثيق إعداد الوريد صغير.
   1. تأخذ أبعاد غرفة في الاعتبار عند حساب إجهاد القص. استخدام الصيغة التالية (المقدمة من قبل الشركة المصنعة ¹¹⁾ لغرف تدفق المستخدمة هنا (انظر الجدول المواد): T = η * 176.1 * ø حيث الإجهاد T = القص، η = اللزوجة الديناميكية، O = معدل التدفق. ملاحظة: اللزوجة الديناميكية وسائل الإعلام RPMI عند 37 درجة مئوية هو 0.007.

4. تحميل الدوائر التدفق، وتحفيز خلايا

ملاحظة: من أجل الشروع في التصاق،يجب أن يكون حافزا خلايا تي. في التجربة التالية الخلايا إما أن تبقى unstimulated أو يتم تحفيز مع قوات الدفاع الذاتى 1α ¹² أو خلات phorbol ميريستات (سلطة النقد الفلسطينية، والسيطرة الإيجابية) ^13. لعرض السليم للchemokine إلى الخلايا التائية، وpreincubated خلايا CHO-ICAM مع SDF-1α (تليها يغسل التسلسلية)، مما يسمح للعرض على سطح الخلية. سلطة النقد الفلسطينية هو استر phorbol مشابه هيكليا لالجلسرين الثانية رسول diacyl (داج)؛ هنا يتم استخدامه كعنصر تحكم إيجابية. يتم التعامل مع الخلايا التائية مباشرة مع سلطة النقد الفلسطينية قبل تحميل في غرفة التدفق.

1. ضع الشريحة غرفة التدفق على المجهر وضبط البؤري على أحادي الطبقة CHO-ICAM باستخدام الهدف 20X.
2. حفاظ على الخلايا T الملون CFSE لجميع الشروط الأخرى في كتلة C الحرارة 37 درجة. إعداد الخلايا CHO-ICAM أو تي النحو التالي مباشرة قبل الفحص عن هذا الشرط:
   1. للشرط unstimulated (الغرفة 1)، والحفاظ على أنبوب واحد / الفصل تدفقالعنبر غير المعالجة، لخدمة سيطرة سلبية لتحفيز.
   2. لسلطة النقد الفلسطينية التحفيز (الغرفة 2)، وتحفيز أنبوب واحد من الخلايا T مع سلطة النقد الفلسطينية (10 نانوغرام / مل) لخدمة السيطرة الإيجابية. علاج على الفور قبل تحميل إلى غرفة التدفق.
   3. لتحفيز SDF-1α، (غرفة 3)، وتحفيز غرفة التدفق الثالثة مع SDF-1α (100 نانوغرام / مل) عن طريق إزالة 70 ميكرولتر في وقت 3 مرات من الخزان العلوي (الانتاج الخزان) ثم إضافة 70 ميكرولتر من قوات الدفاع الذاتى -1α (100 نانوغرام / مل) في أقل خزان (المدخلات الخزان). احتضان لمدة 5 دقائق.
3. إزالة والتخلص من 70 ميكرولتر في وقت 3 مرات من الخزان الناتج من غرفة واحدة.
4. إضافة 70 ميكرولتر من قبل المعالجة (حسب مقتضى الحال) تعليق الخلايا التائية إلى الخزان المدخلات 3 مرات. انتظر 5 دقائق للسماح للخلايا للانتقال من مدخل الغرفة ( "وفي")، والوصول إلى منفذ الداني ( "خارج") من الغرفة.
5. خلال هذا الوقت، صورة 5الحقول للخلايا T الملون CFSE. اختيار الحقول المنتشرة في جميع أنحاء وسط الغرفة (الشكل 1). استخدام الظروف الإثارة / الانبعاثات التالية: الإثارة الليزر الطول الموجي: 488 نانومتر. جمع الانبعاثات مرشح: 500-540 نانومتر. وستكون هذه الصور بمثابة تعداد خلايا ما قبل التدفق.
6. نعلق المدخلات والمخرجات الأنابيب في الوقت نفسه إلى الخزانات غرفة التدفق.
   ملاحظة: إرفاق أنابيب في وقت واحد أمر بالغ الأهمية وذلك لعدم إدخال فقاعات الهواء في الغرفة والحفاظ على التوازن العام داخل الغرفة.
7. بدء تدفق في 0.3 مل / دقيقة (0.4 داين / سم ²⁾ في حين تصور الخلايا T الملون CFSE. مع بدء تدفق، وخاصة مع الغرفة الأولى، غالبا ما يكون هناك فجوة بين بدء تدفق ومراقبة المتداول الخلايا التائية، وبالتالي يبدأ توقيت 5 دقائق على بداية حركة الخلايا التائية.
8. إنهاء تدفق بعد 5 دقائق، وصورة 5 الحقول في قناة CFSE. اختيار الميادين فرقت عشوائيا تروughout وسط غرفة التدفق (الشكل 1). وستكون هذه الصور بمثابة تعداد خلايا بعد تدفق.

5. تحديد النسبة المئوية للخلايا منتسب

ملاحظة: تحديد عدد الخلايا في الصور المكتسبة تتم بموضوعية مع برامج الحاسوب الآلي. لدراستنا استخدمنا Volocity البرنامج (الإصدار 6.2.1)، ولكن البرامج الأخرى مثل يماغيج (النسخة 1.48V) تنطبق أيضا.

1. تحديد عدد الخلايا في الحقل قبل التدفق لكل حالة. متوسط ​​5 مجالات هي "ما قبل تدفق متوسط ​​عدد الخلايا." ⁽⁷⁾
2. تحديد عدد الخلايا في الحقل بعد تدفق لكل حالة. متوسط ​​5 مجالات هي "مرحلة ما بعد تدفق متوسط ​​عدد الخلايا." ⁽⁷⁾
3. حساب النسبة المئوية للخلايا ملتصقة باستخدام الصيغة التالية: النسبة المئوية للخلايا ملتصقة = (بعد تدفق متوسط ​​عدد الخلايا) / (قبل تدفق متوسط ​​عدد خلايا) × 100٪.

النتائج

وتظهر نتائج ممثلة من فحص تدفق التصاق باستخدام Jurkat والإنسان الأساسي خلايا CD3 ⁺ T، كما هو مبين، وحفز مع SDF-1α. الضوابط السلبية في كل التجارب المعروضة هي الخلايا unstimulated. والالتصاق عتبة القاعدية في المئة من الخلايا unstimulated ما بين 5-10٪. التصاق قاعدة اسي?...

Discussion

من أجل تحليل الخلايا التائية الالتصاق بشكل صحيح، ومنبه ليتم تضمينها في الدراسة يجب مراعاتها عند اختيار طريقة في المختبر. في حين أن هناك عدة فحوصات لدراسة الإشارات المؤدية إلى LFA-1 التنشيط وICAM-1 ملزمة كل الأساليب ليست قابلة للتبديل. والتصاق فحص ثابت ¹⁰ هو الأن...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
T cell samples (cell line or primary)	ATCC	TIB-152	Peripheral human T cells
CHO-ICAM-1 cells	ATCC	CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat	ibidi	80606
500 ml glass bottle	Fisher	FB800500
250 ml glass bottle	Fisher	FB800250
Silicone tubing 0.8 mm	ibidi	10841
Confocal microscope with incubator chamber	Ziess	700	Any wide field fluorescent microscope
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
60 ml syringe	BD	309653
CFSE	eBioscience	65-0850
SDF-1α	R&D	350-NS-010/CF
RPMI	Lonza	12-702F/12
PBS	Lonza	17-516F
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
PMA	Sigma Aldrich	16561-29-8
Volocity software	Perkin Elmer	Version 6.2.1
ImageJ software	NIH	Version 1.48V
Tissue-culture treated culture dishes	Falcon	353003
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red	Gibco	25200114
Heat Inactivated FBS	Denville	FB5001-H
Penicillin/Streptomycin	Fisher	BP295950