Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

Summary

assay הידבקות זרימה זו מספק מודל השפעה פשוט, גבוה של אינטראקציות תא אפיתל T. משאבת מזרק משמש להפקת מאמץ הגזירה, וכן במיקרוסקופ confocal לוכדת תמונות כימות. מטרת המחקרים אלה היא לכמת הידבקות תא T ביעילות באמצעות תנאי זרימה.

Abstract

בסך הכל, הידבקות תא T היא מרכיב קריטי של פונקציה, תורם תהליכים השונים של גיוס הסלולר לאתרים של דלקת ואינטראקציה עם תאי מציגי אנטיגן (APC) להיווצרות של סינפסות חיסונית. שני אלה בהקשרים של הידבקות התא T נבדלים כי T אינטראקציות תא-APC יכול להיחשב סטטי, ואילו אינטראקציות כלי תא-דם T מאותגרים על ידי מאמץ הגזירה שנוצר כתוצאה מזרימת עצמה. אינטראקציות T תא-APC מסווגים סטטי ששני השותפים הסלולר ביחס סטטי זה לזה. בדרך כלל, האינטראקציה הזו מתרחשת בתוך בלוטות הלימפה. כתא T אינטראקציה עם דפנות כלי דם, תאי המעצר חייב להתנגד מאמץ גזירה שנוצר. ^1,2 הבדלים אלו מדגישים את הצורך להבין טוב יותר את הידבקות הידבקות סטטית בתנאי זרימה כשני תהליכים רגולטוריים ברורים. הסדרת הידבקות תא T ניתן לתאר באופן תמציתי ביותר כמו conחכות מדינת הזיקה של integrin מולקולות לידי ביטוי על פני התא, ובכך המסדיר את יחסי הגומלין של integrins עם ליגנדים מולקולת הידבקות ביטוי על פני השטח של תא האינטראקציה. ההבנה הנוכחית שלנו של הרגולציה של מדינות זיקת integrin מגיעה לעתים קרובות פשטני במערכות מודל במבחנה. את assay של הידבקות באמצעות תנאי הזרימה המתואר כאן מאפשר הדמיה וכימות מדויק של אינטראקציות תא אפיתל T בזמן אמת בעקבות גירוי. הידבקות תחת assay זרימה יכולה להיות מיושמת על מחקרים של הידבקות איתות בתוך תאי T לאחר טיפול עם חומרים מעכבים או גירוי. בנוסף, assay הזה ניתן להרחיב מעבר T תא איתות לכל אוכלוסייה לויקוציטים הדבק וכל זוג מולקולת integrin-הידבקות.

Introduction

T הידבקות הלימפוציטים מתווכת מספר תהליכים שונים במערכת חיסונית בריאה, ³ ממלאים תפקידים מהותיים בסחר תא T והצגת אנטיגן. בין אם במהלך מעקב חיסוני או תגובה חיסונית פעילה שני תפקידים רחבים אלו הידבקות הם קריטיים. ⁴ אירועי האיתות הפיסיולוגיים של אינטראקציות תא האנדותל T נבדלים אנטיגן לתא T הצגת תא אינטראקציות (APC), ולכן דורשים שיטות שונות של מחקר כדי להבין בצורה הטובה ביותר מפלי איתות מעורבים. הידבקות המשרד של תא T לקיר כלי דם במהלך extravasation לימפוציטים דורשת הפעלת integrin מהירה ודינמית. האינטראקציה ההדוקה בין מולקולות integrin הידבקות מצב פעילות לאורך האנדותל מובילה הידבקות עמידה לזרימת דם, מה שמאפשר לתאי T לזחול על פני השטח בחיפוש אחרים שטח מתירנית למעבר תא. ⁵ הזחילה של המדינה דו תא T -directionally אלוןדפנות כלי דם ga הן סומכות על הידבקות מקוטבת, עם כחזית דבק נבדל של תאי T. ⁶ והחשוב מכל, הדבקה איתן גלגול דורשים התנגדות לכוח הגזירה שנוצר על ידי מחזורי את זרימת דם.

בעת תכנון ניסויים כדי ללמוד הידבקות לימפוציטים, יש לשים לב לגירוי מסוים של עניין. בעוד integrin הפעלה הוא מרכיב נפוץ וביקורתי של כל הצורות של הידבקות תא T, במפלי ההפעלה צפויים להיות ייחודי במורד זרם של קולטנים פרט-קולטנים שיתוף. כמו כן, integrin וזוגות מולקולת ההידבקות לתפקד microenvironments מיוחד על תת-אוכלוסיות ספציפיות. בדרך זו, זוגות אלה עשויים להיות מוסדרים בצורה שונה לגמרי. המודל המוצג כאן הוא אידיאלי לחקר איתות מפלי מוביל integrin הפעלה מתרחשת בתנאי מאמץ גזירה. ⁷ אינטראקציות אלה לא ניתן להבין כראוי בתוך מודבק סטטיבמערכת עקב השפעת הכוחות הללו הוכחו יש ישירות על התנהגות התא T. ⁸ למרות שהן מוצגות כאן עם תאי T ו CHO תאים (שחלה של אוגר סיני) שהונדסו (תאים CHO-ICAM) האדם ICAM-1 במערכת יכול בקלות להיות שונה כדי ללמוד אוכלוסיות לויקוציטים שונים או מולקולות דבקות.

assay זה מספק שיטה לכמת דביקות תא T והפעלה integrin באמצעות מאמץ הגזירה, מתן מודל לשלב הידבקות המשרד של extravasation לויקוציטים. באמצעות שימוש בתאי CHO-ICAM הזיקה של LFA-1 עבור ליגנד שלה בתאים חיים ניתן לבדוק בזמן אמת בתגובה לגירויים שונים של עניין. טכניקה זו דורשת להשיג בקלות, זמינים מסחרי תאי מייקרו-זרימה בשילוב עם משאבת מזרק, מאוד לפשט את הציוד הדרוש מודל זרימת דם ואת לחץ גזירה לעומת דגמים אחרים. ⁹ עוד יתרון חשוב של assay זה הוא כי איתות ספציפיתמפלי מדינת ההפעלה וכתוצאה מכך של integrins הבודד ניתן ללמוד בצורה נקיה באמצעות השימוש בתאי CHO מהונדסים לבטא מולקולות דבקות אדם של עניין. בנוסף, שילוב של נתונים כמותיים עם הדמית תא חי הוא יתרון משמעותי של שיטה זו. בסך הכל, בעוד מספר מבחנים של הידבקות תא סטטי T תוארו כי יפה מודל T אינטראקציות תא-APC, מודלים אלה אינם מספיקים לכידת התהליך הדינמי של הידבקות תא-אפיתל T. מסיבה זו, בעת בחירת assay הידבקות הגירוי הנדון יש לקחת בחשבון.

Protocol

1. ציפוי תאי CHO-ICAM

הערה: המטרה של שלב זה היא צלחת תאי CHO-ICAM בתאי התזרים לצמיחת לילה עם המטרה של יצירה בשכבה ומחוברת.

1. שמור על תאים CHO-ICAM ב 10 ס"מ תרבות מנות מטופלים רקמות-תרבות ב 10 מ"ל התקשורת RPMI בתוספת סרום שור העובר 10% (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (מדיה תרבות שלמה CHO-ICAM) על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.
2. כדי לאסוף תאים, להוסיף 1 מ"ל 0.5% טריפסין-EDTA דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 דקה עם רעד עדין. לנטרל את טריפסין עם 4 מ"ל של התקשורת.
3. ספירת התאים CHO-ICAM באמצעות hemacytometer ולחשב 0.75 x 10 ⁵ תאים לכל תא. הערה: בניסוי זה: 2.25 x 10 ⁵ תאים יהיו צורך זרע 3 תאים.
4. צנטריפוגה 0.75 x 10 ⁵ CHO-ICAM תאים לכל תא במשך 5 דקות ב 500 XG, בטמפרטורת החדר ו resuspend התא גלולה ב 30 μl לכל תא של CHO-ICAM תקשורת תרבות שלמה.
   הערה: בניסוי זה 90 μl יהיה צורך זרע 3 תאים.
5. לאט לאט מוסיף את התאים לתוך מאגר אחד של החדר לזרום. אפשר התאים להסתפק 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה עם 5% CO _2.
6. הוסף 200 μl של התקשורת בתרבות מלאה לכל רוחב שני מאגרים של כל תא. תוספות חלופיות בין שתיים כדי למנוע תנועה של התאים כמערכה equilibrates.
7. דגירת תאי הלילה בתוך 37 ° C חממה עם 5% CO _2.

2. הכנת תאי T

הערה: assay ניתן לעשות זאת עם תאי T האנושי ראשוניים או שורת תאי T. פרוטוקול על בידוד תא T מדם תואר בעבר. ¹⁰ אם תאי T אנושיים ראשוני באמצעות שימוש בתאי מבודדים טרי עבור התוצאות הטובות ביותר. אם באמצעות קו תא T, לעקוב אחר פרוטוקול התרבות שצוין על ידי המקור של התאים. כדי לזהות את התאים על microsco ניאוןpe תאי T מסומנים עם אסתר succinimidyl carboxy והעמסה (CFSE).

1. ספירת תאי T באמצעות hemacytometer ולחשב 2 x 10 ⁶ תאים לכל תא. הערה: בניסוי זה, 6 x 10 ⁶ תאים יהיו צורך 3 תאים.
2. צנטריפוגה 2 x 10 ⁶ T תאים לכל תא במשך 5 דקות ב 500 XG, בטמפרטורת החדר resuspend התאים 1 מ"ל של בופר פוספט (PBS) המכיל גלוקוז 1% או 2% FBS.
3. להוסיף CFSE ב 1: 1,000 דילול (מלאה שבוצע 5 מ"מ). מכסים מפני אור דגירה במשך 8 דקות ב RT
4. ספין ב XG 500 במשך 5 דקות, RT.
5. גלולה תא גלולה עם 240 μl לכל מצב (ראה סעיף 4 "הערה") של סרום חסר RPMI התקשורת. בניסוי זה, resuspend התא גלולה ב 720 μl של מישור RPMI. מחלק את התאים לתוך צינורות 1.5 מיליליטר ריקים שכותרתה עבור כל תא, 240 μl לכל צינור. שמור את התאים בתוך גוש חום 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

3. הגדרת הדואר קלט / פלט hosing ו מזרק משאבה

1. מומלץ לחמם את חדר הדמיה מיקרוסקופ חי ל -37 מעלות צלזיוס.
2. הכן את hosing קלט:
   1. מלאו בקבוק זכוכית 500 מ"ל עם מים ולעשות 2 חורים לתוך המכסה. לייבל חורים "" ו- "Out". זה ישמש באמבט מי חימום עבור תקשורת הקלט.
   2. הפעל את הקלט hosing דרך החורה שבמכסה לאמבטית המים. ודא שהצד של hosing המתחבר המזרק מגיע דרך "ב" חור והצד שיחבר למאגר קלט מגיע דרך החור "החוצה".
   3. שטוף את קלט hosing עם 60 מ"ל של מים כדי להסיר כל האוויר מהמערכת.
   4. ראש קלט hosing עם התקשורת RPMI חסר בסרום חימם עד 37 מעלות צלזיוס. ממלאי מזרק 60 מ"ל ולדחוף באמצעות התקשורת עד hosing הוא דרוך לחלוטין וחסר כל בועות אוויר.
      הערה: בהתאם length של צינורות השתמש הנפח נדרש ממשלה ישתנה.
      1. חשב את נפח של התקשורת הדרושים הניסוי על ידי הכפלת קצב הזרימה (כאן 0.3 mL / min) במספר דקות (5 דק ') במספר תאי בניסוי (כאן 3); בניסוי זה, השתמש 4.5 מיליליטר תקשורת. הערה: אנו ממליצים ליצור 5 מ"ל נפח נוסף (כאן בסך 9.5 מ"ל) שנותרו המזרק לאחר תחול.
   5. מניח את התקנת הקלט כולו לתוך מתחם הדמית חיה של מיקרוסקופ כדי לשמור על 37 מעלות צלזיוס. הפעל את hosing ומזרק מתוך המתחם ולטעון את המזרק לתוך משאבת מזרק.
3. הכן את hosing פלט:
   1. עושים חור במכסה של בקבוק 250 מ"ל להשתמש כפסולת פלט.
   2. הפעל את צינורות פלט דרך החור לתוך הבקבוק. רופף לאבטח את המכסה, לא לסגור את כל הדרך.
   3. מניח את ההתקנה פלט לתוך מתחם הדמית החיה של המילcroscope.
4. חשב את קצב הזרימה (mL / min) דרושים כדי ליצור את לחץ הגזירה הרצוי (dyn / cm ^2). שאר מתח משתנה בתאים וסקולרית שונים, ולכן לקחת בחשבון את המודל בכללותו כולל סוגי תאים להיחקר וטיפולים כאשר מחליטים על רמת מאמץ הגזירה.
   הערה: בניסויים אלה נערכים 0.4 dyn / ² סנטימטרים לחקות באופן הדוק הגדרת וריד קטנה.
   1. קח את ממדי תא בחשבון בעת ​​חישוב מאמץ הגזירה. השתמש בנוסחה הבאה (שסיפק היצרן ¹¹⁾ לתאי הזרימה משמש כאן (ראו טבלה של חומרים): T = η * 176.1 * ø איפה T = גזירה מתח, η = צמיגות דינמיות, מ = והספיקה. ההערה: הצמיגות הדינמית של RPMI תקשורת ב 37 ° C היא 0.007.

טוען 4. של צ'יימברס זרימת הגירוי של התאים

הערה: על מנת ליזום הדבקה,יש לגרות תאי T. בניסוי הבא התאים יהיה גם להישאר unstimulated או מגורה עם אצטט myristate phorbol ¹² או SDF-1α (PMA; בקרה חיובית) ^13. עבור הצגה נאותה הכמוקין לתא T, תאים CHO-ICAM הם preincubated עם-1α SDF (ואחריו שוטף סדרתי), המאפשר הצגה על פני התא. PMA היא אסתר phorbol כי היא מבנית דומה גליצרול שליח diacyl השני (DAG); כאן הוא משמש כביקורת חיובית. תאי T מטופלות ישירות עם PMA לפני הטעינה לתוך תא הזרימה.

1. מניחים את השקף תא הזרימה על המיקרוסקופ ולהגדיר את מישור המוקד על monolayer CHO-ICAM באמצעות המטרה 20X.
2. שמור את התאים T CFSE מוכתם לכל התנאים האחרים בבלוק חום 37 מעלות צלזיוס. להכין את התאים CHO-ICAM או T כדלקמן ערב assay עבור ובלבד:
   1. עבור תנאי unstimulated (תא 1), לשמור ch צינור / זרימה אחדענבר לא מטופל, לשרת בקרה שלילית כמו לגירוי.
   2. עבור גירוי PMA (תא 2), לעורר צינור אחד של תאי T עם PMA (10 ng / ml) לשרת בקרה חיובית כמו; לטפל מייד לפני הטעינה לתוך תא זרימה.
   3. עבור גירוי SDF-1α, (תא 3), לעורר את תא הזרימה השלישי עם-1α SDF (100 ng / ml) על ידי הסרת 70 μl בכל פעם 3 פעמים מהמאגר העליון (מאגר פלט) ולאחר מכן להוסיף 70 μl של SDF -1α (100 ng / ml) לתוך (מאגר קלט) מהמאגר התחתון. דגירה במשך 5 דקות.
3. סר וזורק 70 μl בכל פעם 3 פעמים ממאגר הפלט של תא אחד.
4. להוסיף 70 μl של שטופל מראש (לפי עניין) השעית תא T אל תוך מאגר הקלט 3 פעמים. מתן 5 דקות כדי לאפשר לתאים לנוע המכניסה של החדר ( "ב"), וכדי להגיע לשקע הפרוקסימלית ( "מתוך") של החדר.
5. במהלך תקופה זו, תמונה 5שדות עבור תאי T מוכתמות CFSE. בחר שדות פזורים במרכז החדר (איור 1). השתמש תנאי עירור / פליטה הבאה: אורך גל ליזר עירור: 488 ננומטר; פליטה לסנן אוסף: 500 - 540 ננומטר. תמונות אלה תשמשנה ספירת התאים מראש הזרימה.
6. צרף צינורות הקלט ופלט זמנית למאגרי תא זרימה.
   הערה: חיבור הצינורות במקביל הוא קריטי כדי לא להכניס בועות אוויר לתוך התא ושמירת שיווי משקל הכולל בתוך החדר.
7. בגין הזרימה ב 0.3 מ"ל / דקה (0.4 dyn / ² ס"מ) בעוד לדמיין את תאי ה- T-מוכתמים CFSE. כזרימה מתחילה, במיוחד עם התא הראשון, על פי רוב קיים פער בין ייזום זרימה וההתבוננות מתגלגל תא T, ולכן מתחיל דקות עיתוי 5 עם תחילת התנועה של תאי T.
8. סיים זרימה לאחר 5 דק ', ותמונת 5 שדות בערוץ CFSE. בחר שדות התפזרו באופן אקראי throughout במרכז תא הזרימה (איור 1). תמונות אלה תשמשנה ספירת התאי שלאחר הזרימה.

5. קביעת אחוז התאים חסידים

הערה: קביעת מספר תאי התמונות שנרכשו נעשית באופן אובייקטיבי עם תוכנות אוטומטיות. עבור מחקרים שלנו השתמשנו בתוכנה Volocity (גרסה 6.2.1), אבל תוכנות אחרות כגון ImageJ (1.48V Version) חלים גם.

1. קבע את מספר תאים לכל זרימת מראש שדה לכל מצב. הממוצע של 5 שדות הוא "ספירת תאי הממוצע מראש הזרימה." ⁷
2. קבע את מספר תאים לכל זרימת פוסט שדה לכל מצב. הממוצע של 5 השדות הוא "ספירת תאים הממוצעת שלאחר הזרימה." ⁷
3. חישוב אחוזי התאים חסידים באמצעות הנוסחא הבאה: אחוז התאים החסידים = (ספירת תאים ממוצעת שלאחר זרימה) / (ספירת תאי ממוצע מראש זרימה) x 100%.

תוצאות

תוצאות נציג מוצגים מתוך assay הידבקות זרימה באמצעות Jurkat ואנושי העיקרי תאים CD3 ⁺ T, כפי שצוין, מגורה עם-1α SDF. הפקדים השליליים בכל הניסויים המוצגים הם תאי unstimulated. הידבקות אחוזי הבזליים סף של תאי unstimulated היא בין 5 - 10%; הידבקות בסיס בעיקר מעל לטווח זה מצבי...

Discussion

כדי כראוי לנתח הידבקות תא T, את החומר מהגוף להיכלל במחקר יש לקחת בחשבון בעת בחירת שיטה במבחנה. אמנם יש מספר מבחנים ללמוד אותות שמובילים הפעלת LFA-1 ו- ICAM-1 מחייב כל השיטות אינן ניתנות להחלפה. Assay הידבקות סטטית ¹⁰ הוא המתאים ביותר כדי לחקור אינטראקציות T תא-APC; לחלו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
T cell samples (cell line or primary)	ATCC	TIB-152	Peripheral human T cells
CHO-ICAM-1 cells	ATCC	CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat	ibidi	80606
500 ml glass bottle	Fisher	FB800500
250 ml glass bottle	Fisher	FB800250
Silicone tubing 0.8 mm	ibidi	10841
Confocal microscope with incubator chamber	Ziess	700	Any wide field fluorescent microscope
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
60 ml syringe	BD	309653
CFSE	eBioscience	65-0850
SDF-1α	R&D	350-NS-010/CF
RPMI	Lonza	12-702F/12
PBS	Lonza	17-516F
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
PMA	Sigma Aldrich	16561-29-8
Volocity software	Perkin Elmer	Version 6.2.1
ImageJ software	NIH	Version 1.48V
Tissue-culture treated culture dishes	Falcon	353003
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red	Gibco	25200114
Heat Inactivated FBS	Denville	FB5001-H
Penicillin/Streptomycin	Fisher	BP295950