Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour l'étude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions

Résumé

Ce test d'adhésion de flux fournit un modèle d'impact simple, élevé d'interactions cellulaires de cellules épithéliales T. Une pompe à seringue est utilisée pour générer une contrainte de cisaillement, et la microscopie confocale capture des images pour la quantification. Le but de ces études est de quantifier efficacement l'adhérence des cellules T en utilisant des conditions d'écoulement.

Résumé

Dans l'ensemble, l'adhérence des cellules T est une composante essentielle de la fonction, ce qui contribue aux processus distincts de recrutement cellulaire à des sites d'inflammation et de l'interaction avec les cellules présentatrices d'antigènes (APC) dans la formation des synapses immunologiques. Ces deux contextes de T adhésion cellulaire diffèrent en ce que T interactions cellule-APC peuvent être considérés comme statique, alors que les interactions des vaisseaux cellules T dans le sang sont contestées par la contrainte de cisaillement générée par la circulation elle-même. les interactions cellule T-APC sont classés comme statique en ce que les deux partenaires cellulaires sont statiques par rapport à l'autre. En règle générale, cette interaction se produit dans les ganglions lymphatiques. Comme une cellule T interagit avec la paroi du vaisseau sanguin, les cellules arrêtent et doivent résister à la contrainte de cisaillement générée. ^1,2 Ces différences mettent en évidence la nécessité de mieux comprendre l' adhérence statique et l' adhérence dans des conditions d'écoulement comme deux processus réglementaires distincts. La régulation de T adhérence cellulaire peut être très succinctement décrit comme conpêche à la traîne de l'état de molécules d'intégrine exprimées sur la surface cellulaire, et régulant ainsi l'interaction des intégrines avec les ligands de molécules d'adhérence exprimées à la surface de la cellule d'interaction d'affinité. Notre compréhension actuelle de la réglementation des intégrines états d'affinité provient souvent simpliste dans des systèmes modèles in vitro. L'essai d'adhérence en utilisant des conditions d'écoulement décrites ici permet la visualisation et la quantification précise des interactions cellulaires de cellules épithéliales T en temps réel, suite à un stimulus. Une adhérence sous test d'écoulement peut être appliqué à l'étude de l'adhérence de signalisation au sein des cellules T après un traitement avec des substances inhibitrices ou stimulateurs. De plus, ce dosage peut être étendu au-delà de la signalisation des cellules T à une population leucocytaire adhésif et une paire quelconque d'une molécule d'intégrine-adhérence.

Introduction

Adhérence des lymphocytes T médiatise un certain nombre de processus distincts dans un système immunitaire sain, ³ jouant un rôle essentiel dans le trafic des lymphocytes T et la présentation de l' antigène. Que ce soit lors de la surveillance immune ou une réponse immunitaire active ces deux tâches d'adhérence sont critiques. ⁴ Les événements de signalisation physiologiques des interactions cellulaires de cellules endothéliales T sont distinctes des cellules T cellule présentatrice d' antigène (APC) des interactions, et donc nécessitent des méthodes distinctes de étude pour comprendre mieux les cascades de signalisation impliquées. L'adhérence ferme d'une cellule T à une paroi du vaisseau sanguin pendant l'extravasation des lymphocytes nécessite une activation rapide et dynamique intégrine. L'interaction étroite entre une intégrine et d' adhérence des molécules d'État actifs le long de l'endothélium conduit à résistant à l'écoulement du sang adhérence, qui permet aux cellules T à ramper le long de la surface à la recherche d'une zone permissive au passage cellulaire. ⁵ L'exploration d'un bi cellulaire T -directionally alonga paroi du vaisseau sanguin est tributaire de l' adhésion polarisée, avec une extrémité avant adhésive distincte de la cellule T. ⁶ Plus important encore , l' adhésion ferme et la transmigration exigent une résistance à la force de cisaillement générée par la circulation du flux sanguin.

Lors de la conception des expériences pour étudier l'adhérence des lymphocytes, l'attention devrait être accordée à la relance d'intérêt spécifique. Bien que l'activation des intégrines est un composant commun et critique de toutes les formes de T adhésion cellulaire, les cascades d'activation sont susceptibles d'être unique en aval des récepteurs individuels et co-récepteurs. De même, les paires d'intégrine et la molécule d'adhésion en fonction des micro-environnements spécialisés et sur des sous-populations spécifiques. De cette façon, ces paires peuvent être réglées différemment. Le modèle présenté ici est idéal pour l'étude des cascades conduisant à l' activation qui se déroule dans des conditions de contrainte de cisaillement intégrine de signalisation. ⁷ Ces interactions ne peuvent être compris de manière adéquate dans un ADHESI statiquesur le système en raison de l'impact a été démontré que ces forces d'avoir directement sur ​​le comportement des cellules T. ⁸ Bien que présenté ici avec des cellules T et CHO (ovaire de hamster chinois) , les cellules modifiées pour exprimer (cellules CHO-ICAM) ICAM-1 humain , le système peut facilement être modifié pour étudier différentes populations leucocytaires ou des molécules d'adhésion.

Cet essai fournit un procédé pour quantifier adhésivité des cellules T et l'activation de l'intégrine en utilisant une contrainte de cisaillement, en fournissant un modèle pour la phase solide d'adhérence de leucocyte extravasation. Grâce à l'utilisation de cellules CHO-ICAM l'affinité de LFA-1 pour son ligand dans les cellules vivantes peuvent être examinées en temps réel en réponse à divers stimuli d'intérêt. Cette technique nécessite facilement obtenu, disponibles dans le commerce des chambres micro-flux en combinaison avec une pompe seringue, grandement simplifier l'équipement nécessaire pour modéliser le flux sanguin et la contrainte de cisaillement par rapport aux autres modèles. ⁹ Un autre avantage majeur de cette analyse est que la signalisation spécifiquecascades et l'état d'activation résultant des intégrines individuelles peuvent être étudiées proprement grâce à l'utilisation de cellules CHO modifiées exprimant des molécules d'adhésion humaines d'intérêt. En outre, la combinaison des données quantitatives avec l'imagerie des cellules vivantes est un avantage important de cette méthode. Dans l'ensemble, tandis qu'un certain nombre d'essais de statique adhérence des cellules T ont été décrit que bien modéliser les interactions des cellules T-APC, ces modèles ne sont pas suffisantes pour capturer le processus dynamique de T adhérence de cellules épithéliales. Pour cette raison, lors du choix d'un test d'adhérence du stimulus en question doit être envisagée.

Protocole

1. Placage les cellules CHO-ICAM

Remarque: Le but de cette étape est de plaquer les cellules CHO-ICAM dans les chambres d'écoulement pour la croissance durant la nuit dans le but de générer une monocouche confluente.

1. Maintenir les cellules CHO-ICAM dans 10 cm de culture de tissus traités boîtes de culture dans 10 ml de milieu RPMI supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (CHO-ICAM milieu de culture complet) à 37 ° C avec 5% CO _2.
2. Pour recueillir les cellules, ajouter 1 ml de 0,5% de trypsine-EDTA, et on incube à température ambiante pendant 1 min avec agitation douce. Neutraliser la trypsine avec 4 ml de milieu.
3. Compter les cellules CHO-ICAM en utilisant un hématimètre et calculer 0,75 x 10 ⁵ cellules par chambre. Remarque: Dans cette expérience: 2,25 x 10 ⁵ cellules seront nécessaires pour ensemencer 3 chambres.
4. Centrifugeuse 0,75 x 10 ⁵ cellules CHO-ICAM par chambre pendant 5 min à 500 x g, température ambiante et à remettre en suspension le culot cellulaire dans 30 pl par la chambre de CHOICAM milieu complet de culture.
   Remarque: Dans cette expérience, 90 pi seront nécessaires pour ensemencer 3 chambres.
5. ajouter lentement les cellules dans un réservoir de la chambre d'écoulement. Laisser les cellules sédimenter pendant 5 min dans l'incubateur à 37 ° C avec 5% de CO _2.
6. Ajouter 200 ul de milieux de culture complets sur les deux réservoirs de chaque chambre. additions alterner entre les deux pour éviter le mouvement des cellules que le système équilibrant.
7. Incuber les cellules pendant une nuit dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO _2.

2. Préparation des cellules T

Remarque: Ce test peut être effectué avec des cellules T humaines primaires ou d'une lignée de lymphocytes T. Un protocole sur l' isolement à partir du sang des cellules T a été décrit précédemment. ¹⁰ Si l' aide de cellules T humaines primaires utilisent des cellules fraîchement isolées pour de meilleurs résultats. Si l'on utilise une lignée de cellules T, suivre le protocole de culture spécifiée par la source des cellules. Afin de détecter les cellules sur une microsco fluorescentepe les cellules T sont marquées avec un ester de succinimidyle carboxy-fluorescéine (CFSE).

1. Compter les cellules T en utilisant un hématimètre et calculer 2 x 10 ⁶ cellules par chambre. Note: Dans cette expérience, 6 x 10 ⁶ cellules seront nécessaires pour 3 chambres.
2. Centrifugation de 2 x 10 ⁶ cellules T par la chambre pendant 5 min à 500 x g, température ambiante et à remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon phosphate salin (PBS) contenant 1% de glucose ou 2% de FBS.
3. Ajouter CFSE à 1: 1000 dilution (actions faite à 5 mM). Couvrir de la lumière et incuber pendant 8 min à température ambiante
4. Spin à 500 xg pendant 5 min, RT.
5. Resuspendre le culot cellulaire avec 240 pi par condition (voir la section 4 "Note") de sérum manquant RPMI médiatique. Dans cette expérience, resuspendre le culot cellulaire dans 720 pi de RPMI. Diviser les cellules dans 1,5 ml vides tubes étiquetés pour chaque chambre, 240 pl par tube. Gardez les cellules dans un bloc C de chaleur 37 ° jusqu'à utilisation.

3. Mise en place d'ee Input / Hosing de sortie et seringue

1. Réchauffer la chambre d'imagerie en direct de microscope à 37 ° C.
2. Préparer le tuyau d'entrée:
   1. Remplir une bouteille en verre de 500 ml avec de l'eau et faire 2 trous dans le couvercle. Marquez les trous "dans" et "out". Ceci agira comme un bain d'eau de chauffage pour le support d'entrée.
   2. Exécuter l'entrée de jet d' eau à travers les trous dans le couvercle et dans le bain d'eau. Assurez -vous que le côté du jet d' eau qui se connecte à la seringue vient à travers la "dans" trou et le côté qui va se connecter au réservoir d'entrée vient à travers le trou "out".
   3. Rincer l'entrée hosing avec 60 ml d'eau pour éliminer tout l' air du système.
   4. Premier entrée hosing avec un milieu RPMI sans sérum chauffé à 37 ° C. Remplir une seringue de 60 ml et pousser à travers les médias jusqu'à ce que le tuyau est complètement apprêté et sans bulles d'air.
      Remarque: Selon le length de tube utilisé le volume requis pour amorcer variera.
      1. Calculer le volume de supports requis pour l'expérience en multipliant le débit d'écoulement (ici 0,3 ml / min) par le nombre de minutes (5 min) en fonction du nombre de chambres dans l'expérience (ici 3); dans cette expérience, utiliser 4,5 ml médias. Note: Nous recommandons d'avoir 5 ml de volume supplémentaire (ici un total de 9,5 ml) restant dans la seringue après l'amorçage.
   5. Placez la configuration d'entrée entière dans l'enceinte de l' imagerie en direct du microscope pour maintenir 37 ° C. Exécutez le tuyau et la seringue hors de l'enceinte et de charger la seringue dans la pompe seringue.
3. Préparer le tuyau de sortie:
   1. Faire un trou dans le couvercle d'une bouteille de 250 ml à utiliser en tant que déchets de sortie.
   2. Faire fonctionner le tube de sortie à travers le trou et dans la bouteille. Librement fixer le couvercle, ne pas fermer tout le chemin.
   3. Placez la configuration de sortie dans l'enceinte d'imagerie en direct de la microscope.
4. Calculer le débit (ml / min) nécessaire pour générer la contrainte de cisaillement souhaitée (dynes / ^cm2). La contrainte de cisaillement varie dans les différents compartiments vasculaires, donc prendre en compte le modèle global, y compris les types de cellules à étudier et les traitements au moment de décider sur un niveau de contrainte de cisaillement.
   Note: Ces expériences sont menées à 0,4 dyn / cm ² pour imiter étroitement un cadre de petite veine.
   1. Prenez les dimensions de la chambre en compte lors du calcul de la contrainte de cisaillement. Utilisez la formule suivante (fournie par le fabricant ¹¹⁾ pour les chambres d'écoulement utilisées ici (voir le tableau des matériaux): T = η * 176.1 * ø où le stress T = cisaillement, η = viscosité dynamique, ø = débit. Remarque: La viscosité dynamique du milieu RPMI à 37 ° C est de 0,007.

4. Chargement des Chambres de débit et de stimulation des cellules

Remarque: Afin d'initier l'adhésion,les cellules T doivent être stimulés. Dans l'expérience suivante , les cellules seront soit rester ou non stimulées sont stimulées par SDF-1α ¹² ou phorbol myristate acétate (PMA; contrôle positif) ^13. Pour une bonne présentation des chimiokines à des lymphocytes T, des cellules CHO-ICAM sont préincubées avec le SDF-1α (suivie par des lavages en série), permettant la présentation sur la surface cellulaire. La PMA est un ester de phorbol qui est structurellement similaire au second messager diacyle glycérol (DAG); Ici, il est utilisé comme témoin positif. Les cellules T sont directement traitées avec du PMA avant le chargement dans la chambre d'écoulement.

1. Placer la lame de la chambre d'écoulement sur le microscope et définir le plan focal de la monocouche des cellules CHO-ICAM en utilisant l'objectif 20X.
2. Gardez les cellules T CFSE colorées pour toutes les autres conditions dans le bloc C de chaleur 37 °. Préparer les cellules CHO-ICAM ou T comme suit immédiatement avant l'essai pour cette condition:
   1. Pour la condition non stimulées (chambre 1), gardez un tube / flux chambre non traité, pour servir de témoin négatif pour la stimulation.
   2. Pour PMA stimulation (chambre 2), stimuler un tube de cellules T avec PMA (10 ng / ml) pour servir comme témoin positif; traiter immédiatement avant le chargement dans la chambre d'écoulement.
   3. Pour la stimulation SDF-1α, (chambre 3), de stimuler la chambre d'écoulement troisième avec le SDF-1α (100 ng / ml) en enlevant 70 ul à la fois 3 fois depuis le réservoir supérieur (réservoir de sortie), puis en ajoutant 70 ul de SDF -1α (100 ng / ml) dans le réservoir inférieur (réservoir d'entrée). Incuber pendant 5 min.
3. Retirer et jeter 70 pi à un moment 3 fois à partir du réservoir de sortie d'une chambre.
4. Ajouter 70 pi de suspension pré-traitée (selon le cas) cellules T dans le réservoir d'entrée 3 fois. Attendez 5 min pour permettre aux cellules de se déplacer de l'entrée de la chambre ( "In"), et d'atteindre la sortie proximale ( "Out") de la chambre.
5. Pendant ce temps, l'image 5champs pour les cellules T CFSE colorées. Choisir des champs qui sont dispersés dans tout le centre de la chambre (figure 1). Utiliser les conditions d'excitation / émission suivantes: excitation longueur d'onde du laser: 488 nm; émission filtre de collection: 500 - 540 nm. Ces images serviront les comptages de cellules pré-flux.
6. Attacher la tubulure d'entrée et de sortie simultanément dans les réservoirs de la chambre d'écoulement.
   Remarque: Fixation du tube simultanément est essentiel afin de ne pas introduire de bulles d'air dans la chambre et le maintien de l'équilibre global dans la chambre.
7. Commencez débit à 0,3 ml / min (0,4 dyn / cm ²⁾ tout en visualisant les cellules T CFSE colorées. Comme l'écoulement commence, surtout avec la première chambre, il y a souvent un décalage entre initier l'écoulement et l'observation de roulement des cellules T, commencent donc le moment 5 min au début du mouvement des cellules T.
8. Terminate écoulement après 5 min, et l'image 5 champs dans le canal CFSE. Choisissez les champs dispersés au hasard throughout le centre de la chambre d'écoulement (figure 1). Ces images serviront les comptages de cellules post-flux.

5. Déterminer le pourcentage de cellules adhérentes

Note: La détermination du nombre de cellules dans les images acquises est réalisé de manière objective avec un logiciel automatisé. Pour nos études, nous avons utilisé le logiciel Volocity (Version 6.2.1), mais d'autres logiciels tels que ImageJ (version 1.48V) sont également applicables.

1. Déterminer le nombre de cellules par champ pré-flux pour chaque condition. La moyenne des champs 5 est le "nombre moyen des cellules pré-flux." ⁷
2. Déterminer le nombre de cellules par champ post-flux pour chaque condition. La moyenne des champs 5 est le "nombre moyen des cellules post-flux." ⁷
3. Calculer le pourcentage de cellules adhérentes à l' aide de la formule suivante: Pourcentage de cellules adhérentes = (nombre de cellules moyenne post-débit) / (nombre de cellules moyenne pré-débit) x 100%.

Résultats

Les résultats représentatifs sont présentés dans le test d'adhérence de l' écoulement à l' aide de Jurkat et des cellules T CD3 ⁺ humaines primaires, comme indiqué, stimulées par le SDF-1α. Les contrôles négatifs dans toutes les expériences présentées sont des cellules non stimulées. Un seuil de base pour cent l'adhésion des cellules non stimulées est comprise entre 5 - 10%; adhérence de base, notamment au-dessus de cette fourchette indique u...

Discussion

Afin d'analyser correctement T l' adhésion cellulaire, le stimulant à inclure dans l'étude doit être pris en compte lors du choix d' une méthode in vitro. Bien qu'il existe plusieurs tests pour étudier les signaux menant à LFA-1 activation et ICAM-1 liant toutes les méthodes ne sont pas interchangeables. Un essai d'adhérence statique ¹⁰ est le mieux adapté pour étudier les interactions des cellules T-APC; En variante, le procédé de la contrainte de cisaillement d?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
T cell samples (cell line or primary)	ATCC	TIB-152	Peripheral human T cells
CHO-ICAM-1 cells	ATCC	CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat	ibidi	80606
500 ml glass bottle	Fisher	FB800500
250 ml glass bottle	Fisher	FB800250
Silicone tubing 0.8 mm	ibidi	10841
Confocal microscope with incubator chamber	Ziess	700	Any wide field fluorescent microscope
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
60 ml syringe	BD	309653
CFSE	eBioscience	65-0850
SDF-1α	R&D	350-NS-010/CF
RPMI	Lonza	12-702F/12
PBS	Lonza	17-516F
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
PMA	Sigma Aldrich	16561-29-8
Volocity software	Perkin Elmer	Version 6.2.1
ImageJ software	NIH	Version 1.48V
Tissue-culture treated culture dishes	Falcon	353003
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red	Gibco	25200114
Heat Inactivated FBS	Denville	FB5001-H
Penicillin/Streptomycin	Fisher	BP295950