在剪切粘结力的测定T淋巴细胞粘附分子相互作用的研究

摘要

这种流动粘附实验提供了T细胞的上皮细胞间的相互作用一个简单的，高冲击的模型。的注射器泵用于产生剪切应力，和共聚焦显微镜捕捉图像进行定量。这些研究的目标是使用流动条件，有效地量化的T细胞粘附。

摘要

总体而言，T细胞的粘附是功能的关键组成部分，有助于细胞招募的不同的过程，以炎症和与免疫突触的形成抗原呈递细胞（APC）的相互作用的位点。这两个T细胞粘附的背景下在T细胞相互作用的APC可以认为是静态的不同，而T细胞的血管相互作用由循环本身产生的剪切应力的挑战。 T细胞的APC的相互作用被归类为在静态的两个蜂窝伙伴是相对于彼此静止。一般，这种相互作用淋巴结内发生。作为T细胞与血管壁相互作用，细胞逮捕和必须抵制产生的剪切应力^。1,2这些差异突出了需要更好地了解流动条件下的静态强度和附着力为两个不同的监管程序。 T细胞粘附的调节可以最简洁地描述为CON曳整合在细胞表面上表达的分子，并从而调节与相互作用细胞的表面上表达的粘附分子的配体整合素相互作用的亲和力状态。我们目前的整合亲和力国家调控的认识来自于体外模型系统常常简单化。使用此处描述的流动条件附着力的测定允许可视化和实时以下一个刺激的T细胞的上皮细胞的相互作用准确定量。流测定下的粘合可以应用于在用抑制或刺激物质治疗的T细胞内信令粘附研究。另外，该测定可超出T细胞信号被扩展到任何粘合剂白细胞种群和任何整合素的粘附分子对。

引言

T淋巴细胞的粘附介导许多不同的过程中健康的免疫系统^，3中的T细胞贩卖和抗原呈递发挥重要作用。是否免疫监视或主动免疫应答用于粘附这两大作用是至关重要的过程^。4的T细胞-内皮细胞相互作用的生理信号事件是从T细胞的抗原呈递细胞（APC）的相互作用不同，因此需要的不同的方法研究以更好地了解所涉及的信号通路。 T细胞向淋巴细胞外渗期间的血管壁的牢固粘附，需要快速和动态的整合激活。沿内皮激活状态整合和粘附分子之间的紧密相互作用导致密合性的血液流动性，从 ​​而使T细胞沿着搜索容许到孔通道区域的表面爬行^。5 T细胞双向的抓取-directionally ALONガ血管壁是在偏振粘附依赖，与T细胞的不同粘合剂前端⁶最重要的，牢固粘附和轮回需要由循环血液流动产生的剪切力的阻力。

当设计实验来研究细胞粘连，应注意感兴趣的特定的刺激。而整合激活是各种形式的T细胞粘附的常见和重要组成部分，活化的级联很可能是唯一的个人受体和共同受体的下游。同样，整合和黏附分子对在专门的微环境和特定亚群的功能。以这种方式，这些对可以相当不同的管制。这里提出的模型是理想的信号级联，导致整活化发生的剪切应力条件下的研究^。7这些相互作用不能充分在静态adhesi理解系统由于冲击这些力已显示直接对T细胞的行为^。8虽然与T细胞和CHO（中国仓鼠卵巢）细胞工程化以表达人ICAM-1（CHO-ICAM细胞）的系统可以在这里提出很容易被修改，以研究不同白细胞群或粘附分子。

此法提供了使用剪切应力，为白细胞外渗的牢固粘附阶段的模型来量化T细胞的粘附性和整合激活的方法。通过使用CHO-ICAM细胞LFA-1为它的活细胞中配体的亲合性可以实时响应于感兴趣的各种刺激进行检查。需要容易地获得该技术中，在组合市售微流腔室用注射器泵，极大地简化必要的血液流动和剪切应力建模设备相比其他模型⁹该测定的另一主要优点在于，特定的信令级联和单个整合的所得活化状态可以通过使用表达所关注的人的粘附分子工程改造的CHO细胞的被干净了研究。此外，量化数据的与活细胞成像的组合是此方法的一个显著优势。总体而言，虽然许多静态的T细胞粘附试验中已经描述了很好地建模T细胞的APC的相互作用，这些模型中捕获的T细胞上皮粘附的动态过程不充分。由于这个原因，选择一个粘附试验时有问题的刺激必须加以考虑。

研究方案

1.电镀CHO-ICAM细胞

注意:该步骤的目的是与产生一个汇合单层的目标镀CHO-ICAM细胞在流动室生长过夜。

1. 保持于10cm组织培养处理过的培养皿的CHO-ICAM细胞中，在37℃在补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素（CHO-ICAM完全培养基），用5％10毫升RPMI培养基_的 CO _2。
2. 以收集细胞，加入1ml的0.5％胰蛋白酶-EDTA，并在室温下孵育1分钟，轻轻摇动。中和胰蛋白酶用4ml的介质。
3. 算使用血细胞计数器的CHO-ICAM细胞，并计算每室0.75×10 ^5个细胞。注意:在这个实验:将需要2.25×10 ^5个细胞播种3的腔室。
4. 离心机0.75×10 ^5个每室的CHO-ICAM细胞5分钟，在500 xg离心，室温，并重新悬浮在每CHO的室30微升细胞沉淀-ICAM完整的培养基。
   注:在这个实验中，将需要90微升种子3室。
5. 慢慢加入细胞进入流室的一个储存器。使细胞在37℃培养箱，用5％ _的 CO ₂沉降5分钟。
6. 加入200μl完全培养基穿过每个腔室的两个储存器。两者之间交替加法，以避免细胞的运动作为系统达到平衡。
7. 孵育细胞过夜37℃培养箱，用5％ _的 CO ₂的内部。

2. T细胞的制备

注意:此测定法可以与初级人T细胞或T细胞系​​进行。从血T细胞分离的协议已如前所述^。10如果使用原代人T细胞用新鲜分离细胞，以取得最佳效果。如果使用T细胞系，按照由单元的源所指定的培养协议。为了检测在荧光microsco细胞PE的T细胞标记有羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）。

1. 算使用血细胞计数器的T细胞，并计算每腔室2×10 ^6个细胞。注意:在这个实验中，6×10 ^6个细胞将需要3的腔室。
2. 离心机2×10 ^6个 T细胞每室，用于在500 xg离心，室温下5分钟，重悬在1ml磷酸盐缓冲盐水含有1％葡萄糖或2％FBS的细胞（PBS）中。
3. 1添加CFSE:1000稀释液（股票5毫米制造）。从灯盖和在室温下孵育8分钟
4. 旋转，在500×g离心5分钟，室温。
5. 每240条件微升悬浮细胞沉淀（见第4节"说明"）RPMI媒体缺乏血清。在该实验中，重悬细胞沉淀在720微升纯的RPMI。分裂细胞转化为标示每室，每管240微升空1.5毫升管。保存在37℃加热块电池备用。

3.设置日Ë 输入/输出软管和注射泵

1. 暖显微镜实时成像室至37℃。
2. 准备输入软管:
   1. 填的500毫升玻璃瓶与水和使2个孔到盖子。标签上的孔"中"和"out"。这将作为一个加热水浴输入媒体。
   2. 运行输入通过在盖和进入水浴中的孔冲水。确保连接到注射器的软管的一侧来通过"中的"孔和将连接到输入储存器的一侧来通过"去"的孔。
   3. 刷新输入用60ml水冲水以从体系中除去任何空气。
   4. 素输入用RPMI培养基缺少血清冲水加热到37℃。填充60毫升注射器，并通过媒体推，直到软管完全底漆，缺乏任何气泡。
      注:根据lengt油管h的使用要求总理将改变音量。
      1. 由分钟（5分钟）通过的室的数目的数目在实验（这里3）流量（这里0.3ml /分钟）的速率乘以计算的实验所需的介质的体积;在这个实验中，使用4.5毫升介质。注意:我们建议有5毫升额外的体积（这里共9.5ml）中剩余的注射器吸了。
   5. 将整个输入设置到显微镜的实时成像外壳保持37℃。运行软管和注射器滑出机壳和注射器加载到注射器泵。
3. 准备输出软管:
   1. 使在250毫升瓶作为输出废物用的盖的孔。
   2. 运行通过孔并进入瓶的输出管道。松散的固定盖板，不关闭所有的方式。
   3. 放置输出设置成英里的实时成像外壳croscope。
4. 计算的流量（毫升/分钟）必要以产生期望的剪切应力（达因/厘米^2）。剪应力在不同血管隔室而变化，因此，考虑到包括待研究的细胞类型并在剪应力水平决定何时治疗的总体模型。
   注意:这些实验是在0.4达因/厘米²进行密切模仿小静脉设置。
   1. 计算剪切应力时拿腔尺寸考虑在内。使用下面的公式为此处使用的流动室（由生产商¹¹提供）（参见材料表）T =η* 176.1 *直径:其中T =剪切应力η=动态粘度，直径=流速。注意:RPMI培养基在37℃下的动力粘度为0.007。

4.装载细胞的流动室和刺激

注意:为了启动粘附，T细胞需要被刺激。在以下实验中，细胞将或者保持未刺激或^SDF-1α12或佛波醇肉豆蔻乙酸酯（PMA;阳性对照）被刺激^13。对T细胞的趋化因子的适当呈现，CHO-ICAM细胞预温育与SDF-1α（后跟串行洗涤），允许在细胞表面上呈现。 PMA是一个佛波酯在结构上类似于第二信使二酰基甘油（DAG）;此处它被用作阳性对照。 T细胞被直接用PMA装载到流动室前处理。

1. 放置在显微镜流室的幻灯片，并设置使用20X客观的CHO-ICAM单层焦平面。
2. 保持CFSE染色T细胞在37℃加热块的所有其他条件。制备的CHO-ICAM或T细胞如下之前立即测定该条件:
   1. 对于未刺激条件（室1），保持一管/流量通道琥珀未经处理的，以服务为刺激作为阴性对照。
   2. 对于PMA刺激（室2），刺激T细胞用PMA（10毫微克/毫升），作为阳性对照一管;立即装入流室之前对待。
   3. 为SDF-1α刺激，（室3），通过每次从上部储存器（ 输出水库）除去70微升3次，然后加入70微升的SDF的刺激与SDF-1α（100毫微克/毫升）的第三流动腔室-1α（100毫微克/毫升）到下部容器（ 输入容器）。孵育5分钟。
3. 从一个腔室的输出贮存器中删除，并在一个时间丢弃70微升3倍。
4. 加70微升预处理（如适用）的T细胞悬液到输入储存器3次。等待5分钟，使细胞从室（"以"）的入口移动，并且到达腔室的近端出口（"输出"）。
5. 在此期间，图像5对于CFSE染色T细胞领域。选择分散在整个腔室（ 图1）的中心领域。使用下面的激发/发射条件:激发激光波长:488纳米;排放收集过滤器:500 - 540纳米。这些图像将作为预流动细胞计数。
6. 同时附加的输入和输出管连接到流动室水库。
   注意:同时附加管路是至关重要的，以便不引入气泡进入室和保持室中整体平衡。
7. 以0.3毫升/分钟（0.4达因/厘米^2）开始流动，同时可视化的CFSE染色的T细胞。如流程开始，特别是与第一腔室，经常会有引发流动和观察T细胞轧制之间的滞后，因此，在T细胞的运动的发生开始定时5分钟。
8. 终止流动5分钟后，并在CFSE通道图像5字段。选择随机分散的救援人员到场领域ughout流动室的中心（ 图1）。这些图像将作为流动后细胞计数。

5.确定粘附细胞的百分比

注意:在所获取的图像中的细胞的数目的测定用自动软件客观完成。对于我们的研究，我们使用的软件Volocity（版本6.2.1），但是其他的软件如ImageJ的（版本1.48V）也是适用的。

1. 确定每个场的预流对于每个条件的细胞的数量。 5场的平均是"流预平均细胞数^。"7
2. 确定每场的后流的每个条件的细胞的数量。 5场的平均是"流后平均细胞数^。"7
3. 计算使用下面的公式贴壁细胞的百分比: 贴壁细胞=（流量后平均细胞数）/（流预平均细胞数）的百分比×100％。

结果

代表性的结果从使用Jurkat和初级人CD3 ⁺ T细胞的流动粘附实验中所示，所指示的，与SDF-1α刺激。在所有所示实验的阴性对照是未刺激细胞。未刺激细胞的基础门槛百分之附着力5之间 - 10％;基附着力特别是高于此范围表示一个有问题的实验，并建议T细胞的起始群体中非特异地在制备预活化。折叠在贴壁细胞中超过未刺激细胞的每个条件流动后可以除了百分之粘附的...

讨论

为了适当地分析T细胞的粘附，将包括在该研究中的兴奋剂选择的体外方法时必须加以考虑。虽然有多种测定法来研究信号导致LFA-1的活化和ICAM-1的结合的方法都不能互换。静态粘附实验¹⁰是最适合于研究T细胞APC相互作用;另外，这里详细的剪切应力的方法是理想的模型T细胞上皮细胞间的相互作用在体内 ，趋化因子沿内皮提出，滚动T细胞必须牢牢坚持和抗血液的剪切应力流

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
T cell samples (cell line or primary)	ATCC	TIB-152	Peripheral human T cells
CHO-ICAM-1 cells	ATCC	CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat	ibidi	80606
500 ml glass bottle	Fisher	FB800500
250 ml glass bottle	Fisher	FB800250
Silicone tubing 0.8 mm	ibidi	10841
Confocal microscope with incubator chamber	Ziess	700	Any wide field fluorescent microscope
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
60 ml syringe	BD	309653
CFSE	eBioscience	65-0850
SDF-1α	R&D	350-NS-010/CF
RPMI	Lonza	12-702F/12
PBS	Lonza	17-516F
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
PMA	Sigma Aldrich	16561-29-8
Volocity software	Perkin Elmer	Version 6.2.1
ImageJ software	NIH	Version 1.48V
Tissue-culture treated culture dishes	Falcon	353003
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red	Gibco	25200114
Heat Inactivated FBS	Denville	FB5001-H
Penicillin/Streptomycin	Fisher	BP295950