JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم تطبيق مجهرية الأسفار إينترافيتال (إيففم) كالفاريوم في تركيبة مع الوراثية نماذج حيوانية لدراسة صاروخ موجه وانجرافتمينت من الخلايا المكونة للدم في نخاع العظم (بي أم) منافذ.

Abstract

أدلة متزايدة تشير إلى أن هيماتوبويسيس طبيعية وينظم العظة ميكرونفيرونمينتال متميزة في بي أم، التي تشمل منافذ الخلوية المتخصصة تحوير الوظائف الحيوية من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC)1،2. وفي الواقع، صورة أكثر تفصيلاً عن المكروية المكونة للدم يظهر الآن، التي تشكل بطانة العظم وعلى منافذ غشائي الوحدات الوظيفية لتنظيم HSC العادي وعلى ذرية3،4،5 . وأظهرت الدراسات الجديدة أهمية ارتشاح الخلايا، adipocytes والخلايا العصبية في الحفاظ على وتنظم HSC الدالة6،،من78. وعلاوة على ذلك، هناك أدلة على أن الخلايا من الأنساب المختلفة، أي من الخلايا النقوي واللمفاوية، والمنزل، ويقيمون في منافذ محددة داخل المكروية BM. تعيين كامل المكروية BM وركابها غير قيد التقدم.

السلالات المحورة وراثيا الماوس يعبر عن النسب المحددة علامات مضيئة أو الفئران المهندسة وراثيا إلى الافتقار إلى جزيئات المحدد في خلايا معينة من مكانة BM متوفرة الآن. المغلوب والنسب تتبع النماذج، في تركيبة مع النهج زرع الأعضاء، وتوفير الفرصة لصقل المعارف بشأن دور محدد "المتخصصة" الخلايا لتعريف السكان المكونة للدم، مثل HSC، ب-الخلايا، خلايا تي، الخلايا النقوي و خلايا محمر. يمكن أن تكون هذه الاستراتيجية potentiated كذلك بدمج استخدام اثنين-فوتون الفحص المجهري كالفاريوم. بتوفير في فيفو تصوير عالية الدقة والتقديم ثلاثية الأبعاد من كالفاريوم بي أم، ونحن الآن تحديد دقة موقع حيث الرئيسية في بي أم في المجموعات الفرعية المكونة للدم محددة وتقييم حركية توسعها على مر الزمن. هنا، يتم استخدام ليز-بروتينات فلورية خضراء الفئران المحورة وراثيا (تمييز الخلايا النقوي)9 ورببج الفئران المغلوب (ينقصها الإشارات الشق الكنسي)10 في تركيبة مع إيففم لتحديد engraftment الخلايا النقوي إلى المكروية BM معيبة درجة.

Introduction

مجهر الأسفار مولتيفوتون إينترافيتال (إيففم) هو تقنية تصوير قوية تسمح لعاليه الدقة في الوقت الحقيقي، والتصوير من الأنسجة بعمق يصل إلى 1 مم، اعتماداً على الأنسجة. عندما يطبق على كالفاريوم الماوس، يسمح بمراقبة سلوك الخلايا المكونة للدم داخل BM بطريقة غير الغازية يصل إلى 60-100 ميكرومتر11. يتم استخدام هذا النهج هنا لتحديد حركية engraftment المتكفل النقوي العادي في الفئران المغلوب BM رببج تفتقر إلى إشارات الشق الكنسي.

العمل مؤخرا من مجموعتنا أثبتت أن عيب المتعارف عليه الشق إشارات يؤدي المكروية BM ل مرض مثل ميلوبروليفيراتيفي12. حصل فقدان الإشارات الشق شرطية حذف مجال رببج، عامل النسخ الحرجة المصب الشق الكنسي يشير، باستخدام Mx1-لجنة المساواة العرقية التي يسببها جزئ10ربط الحمض النووي. في هذه الدراسة، استخدم نموذج الفئرانلوكس/لوكس Mx1-Cre/رببج. يؤدي حذف الشرطي لفكرة ربط الحمض النووي من رببج فقدان الإشارات من جميع حز المستقبلات. في طراز Mx1-لجنة المساواة العرقية، لجنة المساواة العرقية التعبير محكوم بالمروج Mx1 المنشط لدى إدارة polyI:C أدى إلى تنظيم دورات تعريفية لحذف الجينات المستهدفة في خلايا الدم فضلا عن مكونات stromal من أجهزة متعددة، بما في ذلك بي أم والطحال والكبد.

Mx1-لجنة المساواة العرقية+/RBPJلوكس/لوكس و Mx1-لجنة المساواة العرقية–/RBPJلوكس/لوكس الفئران التي يسببها مع polyI:C (الممتلكات المشار إليها بوصفها رببجكو ورببجوت، على التوالي) دكت المشع وزرع الخلايا المكونة للدم نوع البرية العادية،. ابتداء من الأسبوع الرابع بعد زرع الأعضاء، وضع رببجكو المستلمين كبير الكريات متبوعاً بتضخم الطحال. على الرغم من أن عرضت الفئران رببجكو زيادة النسبة المئوية لموروث النقوي في بي أم في الأسبوع 8 بعد زرع وفي نقاط زمنية لاحقة، تحليل BM في الأسابيع 4 و 6 لم تكشف عن اختلافات ملفتة للنظر في مضمونها النقوي الخلية مقارنة بالتحكم رببجوت المستلمين. هذه الملاحظة، جنبا إلى جنب مع حقيقة أن هو أعرب عن Mx1-لجنة المساواة العرقية في مختلف الهيئات المكونة للدم، إلى التساؤل عما إذا كان المكروية BM أثر مباشر على الشروع في النمط الظاهري ميلوبروليفيراتيفي.

تحديد ما إذا كان BM موقع أولى حاسمة لتطوير المرض، استخدمت إيففم كالفاريوم الماوس في تركيبة مع بي أم زرع (BMT)، ونموذج المغلوب رببج، ونسب تتبع النظام. الفئران المعدلة وراثيا معربا عن اجفب تحت سيطرة المروج (Lys-التجارة والنقل) lysozyme محددة9 استخدمت للحصول على خلايا المانحين التي يمكن تصور خلال BM التصوير بعد BMT. التعبير lysozyme محددة للخلايا النقوي و Lys-التجارة والنقل يمثل خلايا من السلف النقوي المشتركة (CMP) المحببات ناضجة13.

إيففم BM في نقاط زمنية مختلفة أظهرت أن الخلايا Lys-التجارة والنقل المخزن وبالمثل إلى المستلمين BM رببجوت ورببجكو، لكن توسع وانجرافتيد أسرع في المستلمين BM رببجكو. هذه الفرق كانت مثيرة في النقطة الزمنية السابقة (الأسبوع الثاني) وانخفض مع مرور الوقت (أيام 4 و 6). ومع ذلك، عند هذه النقاط وقت لاحق، التقييم المقصورة المكونة للدم في نفس المتلقي أظهرت زيادة مطردة في عدد الخلايا النقوي المتداولة في الجريدة الرسمية والمترجمة في طحال الفئران رببجكو، مما يدل زيادة ناتج من الخلايا من BM في الدورة الدموية. كشف تحليل للتعريب الخلايا Lys-التجارة والنقل في بي أم فئران زرع في 6 أسابيع أن الخلايا النقوي كانوا يقيمون أبعد عن المفرج في المكروية رببجكو مما في عنصر التحكم.

جماعياً، مزيج إيففم مع هذه النماذج الحيوانية محددة قدمت أفكاراً في ديناميات الخلايا النقوي في المكروية BM رببجكو engraftment. التصميم التجريبي والنهج الكمي الموصوفة هنا يقترح نموذجا يمكن تطبيقه لمعالجة مسائل مماثلة. على سبيل المثال، قد يسمح استخدام النسب المحددة خلية أخرى تتبع النماذج، مثل التجارة والنقل RAG114 أو15 Gata1-بروتينات فلورية خضراء الفئران، في أعقاب سلوك اللمفاوية أو فروعه محمر، على التوالي، في بي أم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات التي تنطوي على استخدام الحيوانات بإذن للعناية بالحيوان واستخدام اللجنة لولاية إنديانا مدرسة الطب في جامعة. ضمان الالتزام بالتشريعات المتعلقة بالتجارب الحيوانية في البلد حيث يتم تنفيذ العمل.

1-إعداد الفئران المستفيدة-/- Mx1CreRBPJ

  1. عبر الفئران Mx1-لجنة المساواة العرقية+ مع رببجلوكس/لوكس الفئران10 للحصول على Mx1-لجنة المساواة العرقيةالإيجابية رببجلوكس/لوكس الفئران12 و Mx1-لجنة المساواة العرقية السلبية رببجلوكس/لوكس ليتيرماتيس لاستخدامها كعناصر تحكم. تحقق من النمط الوراثي PCR10.
  2. استخدم الأسبوع 6-8-Mx1Cre القديمة+/RBPJلوكس/لوكس و Mx1Cre–/RBPJلوكس/لوكس الفئران لأداء التعريفي polyI:C.
  3. حقن polyI:C 200 ميكروغرام القائمة في لجنة المساواة العرقية+ ولجنة المساواة العرقية– الفئران. إعطاء حقن polyI:C واحد كل يوم لمدة 3 أيام في الأسبوع الأول. إعطاء حقن polyI:C واحدة في الأسبوع الثاني، 7 أيام بعد الحقن السابقة (حقن أربعة في المجموع).
    1. استخدام رببجكو (التي يسببها Mx1Cre+/RBPJلوكس/لوكس) ورببجوت (الناجم عن Mx1Cre–/RBPJلوكس/لوكس) الفئران كمتلقين 3 أسابيع بعد الحقن polyI:C الماضي.
      ملاحظة: من المستحسن استخدام الفئران التي تسببها pI: pC 3 أسابيع بعد الحقن. يؤدي إلى تغييرات كبيرة في BM، أدى إلى توسيع إيمونوفينوتيبيك HSC الاستجابة IFNα الناجمة عن polyI:C وانخفض ناتج فروعه ناضجة في ال16،الدم المحيطي17. تمثيل المجموعات المكونة للدم تطبيع 3 أسابيع بعد الحقن والفئران يمكن أن تستخدم دون التباس آثار الالتهاب. وقد تم تحسين هذا البروتوكول التعريفي رببج. إذا حذف مورثة مختلفة، البروتوكول التعريفي قد تختلف تبعاً للبناء، ويجب أن يتم التحقق من صحة الحذف. علينا التحقق من صحة الحذف ~ 100% من منطقة رببج بين مواقع لوكسب قبل RT-PCR بعد ما مجموعة أربعة polyI:C الحقن.

2-إعداد خلايا النخاع المانحة Lys-اجفب لزرع الأعضاء

  1. Euthanize واحد ليز اجفب الماوس (ثاني أكسيد الكربون تليها التفكك عنق الرحم) 1 أو 2 ح قبل عملية الزرع.
  2. رذاذ على سطح جسم الحيوان مع الإيثانول 70%.
  3. استخدم المقص الجراحي لشق جلد على ساقيه حول الكاحل ومع الملقط الجراحي سحب بعيداً الجلد والفراء معا لفضح أنسجة العضلات نظيفة.
  4. استخدم المقص الجراحي لإزالة العضلات قدر من الساقين قدر الإمكان. استخدام مقص، قص العظام (في الركبة والكاحل) وتنظيف أي أنسجة العضلات المتبقية من قصبة وتيبياس باستخدام الأسفنج الشاش. ضع العظام (قصبة اثنين وهما تيبياس) في لوحة 6-كذلك يتضمن دميم 10% FBS.
  5. سحق العظام في قذيفة هاون مع 10 مل الباردة 2 مم يدتا برنامج تلفزيوني وبيبيت خلايا نخاع العظام لإحضار الخلايا إلى تعليق خلية واحدة. وبدلاً من ذلك، مسح العظام مع 2 مم يدتا برنامج تلفزيوني 3 مرات من كل جانب بحقنه 1 مل.
  6. تصفية الخلايا نخاع العظام باستخدام عامل تصفية 70 ميكرومتر في أنبوب الطرد مركزي 15 مل. شطف تصفية مع 2-3 مل من برنامج تلفزيوني. تدور الخلايا أسفل 10 دقائق في 460 x ز، ريسوسبيند الخلايا في 10 مل دميم الطازجة 10% FBS.
  7. عد الخلايا نخاع العظام في هيموسيتوميتير وضبط تركيز إلى 1.5 × 107 خلايا/مل في إيمدم دون المصل. استخدم 3 × 106 خلايا للحيوان الواحد بحجم 200 ميليلتر. هي خلايا حوالي 1/3 من مجموع BM النقوي بروتينات فلورية خضراء + الخلايا. ترك الخلايا على الجليد حتى جاهزة للحقن. استخدام 0.5 × 105 خلايا لتحديد التعبير التجارة والنقل بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية9.

3-النخاع العظمى زرع الخلايا Lys-التجارة والنقل في الفئران رببجكو

  1. كبح جماح الفئران المستفيدة في قفص دائري. تشعيع الفئران بجرعة قاتلة من أشعة غاما (1,200 راد) في إيرادياتور Cs 137. استخدام بروتوكول تقسيم جرعة: 900 راد في المساء تليها 300 راد في صباح اليوم التالي (إلى جانب 16 ح).
  2. زرع الفئران المستفيدة المشع دكت رببجوت ورببجكو ح 5-6 بعد الجرعة الثانية من الإشعاع. حقن BM الخلايا حصادها من الفئران Lys-اجفب بتركيز 3 × 106 خلايا للحيوان عن طريق حقن الوريد الذيل (انظر التفاصيل لحصاد الخلايا في القسم 2).
  3. صورة أفواج مستقلة فئران زرع بها إيففم في نقاط زمنية مختلفة: 24 ح، وفي أسابيع 2 و 4 و 6، كما هو موضح أدناه (انظر القسم 4 و 5 في فيفو التصوير الداخلي).

4-العمليات الجراحية التحضير لتصوير إينترافيتال

  1. تعقيم الأدوات الجراحية. اثنين غرامة الملقط (واحد على التوالي، أحد الزاوية)، زوج واحد مقص جيد وزوج واحد من أصحاب الإبرة. إعداد مجال المنطوق مع جميع اللوازم الضرورية للإجراء.
  2. إعطاء الماوس حقنه IP من مخدر الكيتامين كوكتيل (Xylazine 2.5-5 مغ/كغ + أسيبرومازيني 1.0-2.5 ملغم/كغم + الكيتامين 90-100 مغ/كغ) باستخدام حقنه إبرة ز 26-28.  سيتم رصد الحيوان كل 15 دقيقة أثناء الإجراء ومخدر وسوف تستكمل حسب الاقتضاء في ربع الجرعة الأصلي.
  3. ضع الماوس على مصدر حرارة مناسبة (لوحة تدفئة 37 درجة مئوية، والحيوانات المحمية من الاتصال المباشر مع تدفئة وسادة) وبصريا رصد معدل التنفس.
  4. تحقق من ردود الفعل باستخدام إصبع القدم قرصه استجابة. التأكد من أن الحيوان تماما تحت التخدير قبل البدء بأي من العمليات الجراحية.
  5. قياس استخدام 26-28 حقنه الإبرة لإعطاء الفئران حقن الوريد ذيل علامة نيون الأوعية الدموية (ديكستران، 100 ميكروليتر من حل 20 ملغ/مل).
  6. تطبيق مرهم العين الطبيب البيطري لكلتا العينين. مقطع السطح الظهرية من رأس الحيوان مع لوس أنجليس كليبرز الكهربائية الصغيرة. تطبيق لإزالة شعر كريم للاسفنج الشاش استخدام 5 كحد أدنى إزالة الكريم وشطف ثم مع المالحة. الإعدادية فروة الرأس نظيفة مع 70% من الكحول باستخدام مسحه القطن.
  7. استخدام الملقط غرامة ومقص جعل شق جلد خط الوسط صغيرة (10-20 مم) في فروة الرأس لتعريض سطح الجمجمة الظهرية الكامنة. استخدام الحرير الجراحية 5-0 لوضع اثنين إقامتهم خياطة الجروح في الجلد على كل جانب من الشق، خلق رفرف لفضح كالفاريوم للتصوير.
  8. ضع الفئران على ظهورهم وتغرق فروة الرأس المكشوفة في صحن أسفل زجاج مليئة بالنفط المجهر. نقل الحيوان إلى موتيفوتون غرفة التصوير.
  9. ضع الحيوان في مرحلة مجهر مع كالفاريوم المتمركزة على الطبق الزجاج فوق الهدف وتغطي ثم مع 37وسادة تدفئة درجة مئوية (يجب حماية الحيوانات من الاتصال المباشر مع الحرارة).

5-في فيفو التصوير بدقة عالية من كالفاريوم الماوس

  1. استخدام نظام مقلوب [كنفوكل] تعديل لتصوير مولتيفوتون (انظر المواد الجدول). إرشادات الشركة المصنعة التالية لضبط ليزر 2-فوتون إلى 830 نانومتر، مكان 20 ث س، غ 0.95 عدسة الهدف في المجهر الآنف قطعة والاختيار محاذاة شعاع الليزر.
    ملاحظة: تستخدم نظم مجهر تستقيم الأكثر شيوعاً لهذه الدراسات، ولكن يمكن أيضا استخدام نظام مولتيفوتون لمقلوب. في هذه الدراسة، تم استخدام جهاز ستيريوتاكسيك أتروماتيك تصميم مخصص. على الرغم من أن هناك عدة أجهزة ستيريوتاكسيك المتاحة تجارياً لأنظمة المجهر تستقيم، لا يوجد متاح تجارياً ستيريوتاكسيك جهاز لنظام مجهر مقلوب يهدف إلى تأمين الجمجمة الماوس. كبديل لجهاز ستيريوتاكسيك مخصص، يمكن تأمين الجمجمة في الموقف أعلاه الهدف استخدام مختلف الأساليب الشريط أو الغراء للاستقرار.
  2. فتح برنامج الحصول على صورة. في "إعدادات اقتناء" تحقق الفريق إذا تم تحديد أحد اتجاهي وضع المسح الضوئي. قم بإعداد سرعة المسح الضوئي إلى 4 ميكروثانية بيكسل، معدل الإطار إلى 512 × 512 بكسل وتكبير/تصغير إلى 1.5. حدد 20 X ث نا 0.95 الهدف من قائمة العدسات الهدف المتاحة لمطابقة عدسة المتمركزة في نوسيبيسي.
  3. الوصول إلى قائمة "صبغة" من لوحة "صورة اكتساب التحكم" وحدد "فوتون اثنين". فتح إطار "الأصباغ مسار الضوء" وحدد الإثارة DM690 980 مارك ألماني-فتح مصراع الليزر ف 2 عن طريق التحقق من خانة الاختيار في "وحدة الليزر" 2. في الإطار "وحدة تحكم المجهر"، حدد مرآة RDM690.
  4. حدد "برنامج التحصين الموسع مصباح" واختر المكعب برنامج التحصين الموسع-تصفية B/G ويركز الهدف على العينة لتصور تدفق الأوعية الدموية ومكانه نخاع العظم كالفاريوم، تستخدم كمرجع في التشعب في الاتجاه المركزي (أ) وخياطة الشريان التاجي) ب (الشكل 2A).
  5. جمع الصور باستخدام وضع غير ديسكانيد. حدد ثلاثة أجهزة لكشف خارجي: detector1 PMT لجمع إشارة SHG الكولاجين (تصفية الانبعاثات-430/100 نانومتر)، جاسب detector2 لجمع بروتينات فلورية خضراء إشارة (تصفية الانبعاثات-525/50) و detector3 جاسب جمع إشارة تريتك-ديكستران (تصفية الانبعاثات-605/90 نانومتر).
    1. القيام بتصوير بيكسل 4μs مع لا في المتوسط لتقليل الضيائية بمعدل المسح الضوئي. جمع الصور في اكتساب السلطة وكاشف ليزر مستمر تعديلها للاستفادة من النطاق الديناميكي الكامل للكشف مع الحد الأدنى من الإشباع.
    2. جمع مجموعة من الفروع إلى العمق النسيج (60 × 1 ميكرومتر مكدسات Z) من 6 مناطق نخاع العظم كالفاريوم. استخدام إعدادات حجم الخطوة 1 ميكرومتر، والتكبير 1.5 و 512 × 512 بكسل حجم الإطار (423 مكم x 423 ميكرومتر).
      ملاحظة: عموما إجمالي الوقت المطلوب للصورة الماوس واحد ح 1-1.5.

6-التحليل الكمي

  1. القيام بعمليات كوانتيتيشن و 3D صورة استخدام برمجيات كوانتيتيشن والتصور مكرسة 3D/4d صورة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول المواد). تصور بشكل تفاعلي Z-مكدسات في 3D استخدام الإسقاط حدة الأقصى (MIP)، ألفا-مزيج أو الظل الإسقاط حجم التقديم الخوارزميات.
  2. تقسيم الخلايا بروتينات فلورية خضراء باستخدام "بقعة كائن تجزئة الوحدة النمطية". تطبيق المعالجة الحسابية (قناة الطرح) مكدس الذاكرة المؤقتة للقضاء على الكونت إيجابية كاذبة من الخلايا بروتينات فلورية خضراء (وهذا يلغي إشارة لخلايا العظام عرض fluorescence قوية في قنوات الأخضر والأحمر).
  3. إجراء تجزئة سطح المفرج والعظام باستخدام الوحدة النمطية السطحية تجزئة. إذا لزم الأمر، حساب مسافات خلايا لأي من السطوح أعلاه عن طريق تطبيق خوارزميات X-التوتر تسمى "المسافة من بقعة على السطح".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

أفواج من رببجكو 2 و 2 رببجوت المستلمين تم تصويرها في جلسة تصوير فردية في نقاط زمنية مختلفة: ح 24 و 2، 4 و 6 أسابيع بعد زرع الخلايا BM Lys-التجارة والنقل (سير العمل يتضح في الشكل 1A).

في كل الماوس، الصور تم الحصول عليها من 6 مناطق القياسية كال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ويصف هذا البروتوكول تصميم تجريبي الأمثل لدراسة حركية engraftment الخلايا المكونة للدم "الفحص المجهري الفلورسنت إينترافيتال". في هذه الدراسة، كان توسيع نطاق الخلايا السلف النقوي في BM WT أو في الشق إشارات BM المعيبة تعقبها في كالفاريوم العظام التالية Lys-بروتينات فلورية خضراء إيجابية النقوي الخلاي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

أجرى تصوير في مركز إنديانا "الميكروسكوب البيولوجي" في جامعة إنديانا، الموجهة من قبل الدكتور كين دن. جهاز ستيريوتاكسيك نموذج تصميم ومارك سونبا، آبار مركز بحوث "طب الأطفال". وأيد هذا العمل بالمعاهد الوطنية للصحة/R01DK097837-09 (نورث كارولاينا)، والمعاهد الوطنية للصحة/R01HL068256-05 (NC)، والمعاهد الوطنية للصحة/NIDDK1U54DK106846-01 (NC)، البحوث MPN مؤسسة (NC) و "التعاونية كتسي" مشروع كلية/Notre Dame (NC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ketamine cocktailIU School of MedicineKetamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextranTdb ConsultancyTD150-100mgOther color dextran may be used.
Andis hair trimmerBraintree ScientificCLP-323 75
Gauze spongeMed Vet InternationalPK2244-ply, 2 x 2
Nair depilatory creamCommercial store
SalineMed Vet InternationalRXSAL-POD1LT0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringeFisher Scientific14-826-7928 g, 1/2 cc
Fine ForcepsFine Science Tools00108-11, 00109-11straight forcep, angled forcep
ScissorFine Science Tools15018-10
Needle holderFine Science Tools12002-14
5-0 silk sutureFisher ScientificMV-682Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dishWillCoGWSt-5040
Optical microscope oilLeica
Stereotaxic stage insert IU School of MedicineCustom design
Olympus FV1000 confocal microscope system Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective Olympus
Small heating padCommercial storeZoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging softwareBitplane3/4 D Image Visualization and Analysis software

References

  1. Carlesso, N., Cardoso, A. A. Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).
  2. Lo Celso, C., Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).
  3. Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
  4. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  5. Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).
  6. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
  7. Naveiras, O., et al. Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).
  8. Scheiermann, C., et al. Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues. Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).
  9. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 716-726 (2000).
  10. Han, H., et al. Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision. Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).
  11. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
  12. Wang, L., et al. Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner. Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).
  13. Miyamoto, T., et al. Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment. Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).
  14. Luc, S., et al. Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential. Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).
  15. Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation. Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).
  16. Essers, M. A., et al. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).
  17. Pietras, E. M., et al. Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons. J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).
  18. Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. J Vis Exp. (91), e51683(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

121

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved