Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

요약

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 calvarium의 유도 및 조 혈 모 세포의 골 수 (BM) 틈새로 engraftment 연구 유전 동물 모델에 적용 됩니다.

초록

증거를 증가 일반 조 전문된 세포 벽 중요 한 조 혈 줄기 세포 (HSC) 기능^1,2변조를 포함 하는 BM, 뚜렷한 microenvironmental 신호에 의해 규제 됩니다 나타냅니다. 실제로, 조 혈 microenvironment의 더 상세한 그림은 이제 신흥에 endosteal와 내 피 틈새 형성 정상 HSC와 그들의 자손^{3,4,5의 규칙에 대 한 기능 단위} . 새로운 연구는 adipocytes, 유지 하 고 HSC 기능^6,,78조절에 신경 세포, 혈관 주위 세포의 중요성을 계시 했다. 또한, 다른 계보, 즉 골수성과 림프 성 세포, 가정에서 세포 및 BM microenvironment 내의 특정 틈새에 있는 증거가 있다. 그러나, BM microenvironment 및 그것의 거주자의 완전 한 매핑 진행 중에서입니다.

계보 특정 형광 표식 또는 부족 BM 틈새의 특정 셀에 선택한 분자 유전자 조작 생쥐를 표현 하는 유전자 변형 마우스 긴장 지금 사용할 수 있습니다. 노크 아웃 및 혈통 추적 모델, 이식 방법, 함께에서 제공 기회 "틈새" 특정의 역할에 대 한 지식을 구체화를 세포 HSC, 같은 정의 된 조 혈 인구에 대 한 B-세포, T 세포, 골수성 세포와 erythroid 셀입니다. 이 전략은 calvarium의 2 광자 현미경의 사용을 병합 하 여 더 potentiated 될 수 있습니다. 제공 함으로써 고해상도 이미징 vivo에서 및 BM calvarium의 3 차원 렌더링, 우리가 지금 정확 하 게 위치 특정 조 혈 하위 집합은 BM에 가정과 평가 시간이 지남에 그들의 확장의 활동을 확인할 수 있습니다. 여기, 리스-GFP 유전자 변형 마우스 (골수성 세포 표시)⁹ , RBPJ (정식 노치 신호 부족 한) 녹아웃 쥐¹⁰ 사용 됩니다 IVFM와 함께에서 노치 결함이 BM microenvironment 골수성 세포 engraftment 결정 하.

서문

Intravital multiphoton 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 강력한 이미징 기술을 고해상도, 실시간 이미징 조직 깊이의 최대 허용 하는 조직에 따라 1 mm. 마우스 calvarium에 적용 하면, 그것은 60-100 μ m¹¹을 비-침략 적 방법으로 BM 내의 조 혈 모 세포의 행동을 관찰을 허용. 이 방법은 여기 engraftment 정식 노치 신호 부족 BM의 RBPJ 녹아웃 쥐에 있는 정상적인 골수성 창시자의의 활동을 결정 하기 위해 사용 됩니다.

우리 그룹에서 최근 작품 그 결함이 정식 노치 신호 myeloproliferative 같은 질병¹²BM microenvironment 리드에서 설명 했다. 노치 신호 손실 RBPJ, 하류 신호, 재결합¹⁰유도 Mx1-Cre를 사용 하 여 정식 노치의 중요 한 녹음 방송 요인의 DNA 묶는 도메인의 조건부 삭제에 의해 얻은. 이 연구에서는 Mx1-Cre/RBPJ^lox/lox 마우스 모델 사용 되었다. RBPJ의 DNA 묶는 주제의 조건부 삭제에서 모든 노치 수용 체 신호 손실 발생 합니다. Mx1-Cre 모델, Cre 식 polyI:C 여러 기관의 stromal 구성 요소에서 뿐만 아니라 혈액 세포에서 타겟된 유전자 삭제의 유도에 결과의 관리에 따라 활성화 Mx1 발기인에 의해 구동 됩니다 포함 한 BM, 비장 및 간.

Mx1-Cre⁺/RBPJ^lox/lox ,^lox/lox 마우스 Mx1-Cre^-/RBPJ polyI:C (hereon 표시 된 RBPJKO와 RBPJWT, 각각)와 유도 방사능 치명적 이었고 정상, 야생 타입 조 혈 모 세포 이식. 이식 후 4 주부터 시작 해 서, RBPJKO 받는 사람 상당한 leukocytosis로 선행 개발. RBPJKO 마우스 골수성 창시자의 증가 비율에에서 제시는 BM 주 8에서 이식 후 고 나중 시간 지점에서 비록 4-6 주에 BM의 분석 그들의 골수성 세포 콘텐츠 제어 RBPJWT에 비해 눈에 띄는 차이 공개 하지 않았다 받는 사람. BM microenvironment myeloproliferative 표현 형의 개시에 직접적인 영향을 미쳤다 Mx1-Cre 다른 조 혈 기관, 표현 된다 사실 함께이 관찰, 질문을 발생 합니다.

BM 질병 개발의 중요 한 초기 사이트 였는 지 여부를 확인 하려면 마우스 calvarium의 IVFM와 BM 이식 (BMT), RBPJ 노크 아웃 모델 계보 추적 시스템 조합에 사용 되었다. 유전자 변형 마우스 특정 lysozyme 발기인 (리스-GFP)⁹ 의 통제 EGFP 표현 BM BMT 후 이미징 동안 구상 될 수 있는 기증자 세포를 얻기 위해 사용 되었다. Lysozyme 식이 골수성 세포 특정 고 리스-GFP 성숙한 granulocyte¹³일반적인 골수성 조상 (CMP)에서 셀을 표시 합니다.

다른 시간 지점에서 BM의 IVFM는 리스 GFP 셀 BM의 RBPJWT 및 RBPJKO 받는 사람에 게 마찬가지로 홈 하지만 확장 및 BM의 RBPJKO 받는 사람에서 빨리 engrafted 시연 했다. 이 차이 이전 시간 시점 (주 2) 극적인 되었고 시간이 지남에 따라 감소 (주 4 및 6). 그러나, 이러한 나중 시간 지점에서 동일한 받는 사람에 조 혈 구획의 평가 골수성 세포는 샌드위치에 순환 수에 꾸준히 증가 보였다 고 셀의 증가 출력을 나타내는 RBPJKO 마우스의 비장에 순환에 BM. 리스-GFP 셀 지역화는 BM에 이식된 생쥐의 6 주에의 분석 컨트롤에서 보다 RBPJKO microenvironment에 골수성 세포는 맥 관 구조에서 거주 했다 밝혔다.

샨 다, 이러한 특정 동물 모델 IVFM의 조합 RBPJKO BM microenvironment 골수성 세포의 engraftment 역학에서 통찰력 제공. 실험 설계 및 여기서 설명 하는 양적 접근 비슷한 질문을 해결 하기 위해 적용할 수 있는 패러다임으로 제시 된다. 예를 들어 모델, RAG1 GFP¹⁴ 또는 Gata1 GFP¹⁵ 마우스 추적 다른 셀 특정 계보를 사용 하 여 림프의 동작에 따라 수 또는 erythroid 창시자는 BM에 각각.

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프로토콜

동물의 사용을 포함 하는 모든 절차는 동물 관리 및 사용 위원회의 인디애나 대학의과의 인증 수행 했다. 확인 작업을 수행 하는 국가의 동물 실험에 법안을 준수 합니다.

1. Mx1CreRBPJ^-/- 받는 사람 마우스의 준비

1. Mx1-Cre⁺ RBPJ^lox/lox 쥐¹⁰ Mx1-Cre를 얻을 마우스를 크로스 ^RBPJlox/lox 쥐¹² 양수와 Mx1-Cre 부정적인 RBPJ^lox/lox littermates 컨트롤로 사용 하. PCR¹⁰유전자 형을 확인 합니다.
2. 6-8 주를 사용 하 여-오래 된 Mx1Cre⁺/RBPJ^lox/lox 및 Mx1Cre^-/RBPJ^lox/lox 마우스 polyI:C 유도 수행 하려면.
3. PolyI:C 200 µ g i.p. Cre⁺ 및 Cre^- 마우스에 주사. 한 polyI:C 주사 3 일 첫 주 동안 매일 제공 합니다. 한 polyI:C 주사 두 번째 주, 이전 주입 (총에서 4 개의 주사) 후 7 일 제공 합니다.
   1. RBPJKO를 사용 하 여 (Mx1Cre 유도⁺/RBPJ^lox/lox)와 RBPJWT (유도 Mx1Cre^-/RBPJ^lox/lox) 받는 마지막 polyI:C 주입 후 3 주 사람으로 쥐.
      참고: 그것은 주입 후 3 주 pI: pC에 의해 유도 된 마우스를 사용 하 여 권장. PolyI:C에 의해 발생 하는 IFNα 응답 BM, HSC의 immunophenotypic 확장 결과에 큰 변화를 유도 하 고 주변 혈액^16,17에 성숙한 창시자의 출력을 감소. 조 혈 하위 집합의 표현은 정규화 된 3 주 후 주입 및 쥐 염증의 혼란 효과 없이 이용 될 수 있다. 이 유도 프로토콜은 RBPJ에 대 한 최적화 되었습니다. 유도 프로토콜 구문, 따라 달라질 수 있습니다 다른 유전자를 삭제 하 고 삭제를 확인 합니다. 우리는 총 4 개의 polyI:C 주사 후 RT-PCR에 의해 loxP 사이트 사이 RBPJ 영역의 ~ 100% 삭제 확인.

2. 리스 EGFP 기증자의 골 수 세포 이식에 대 한 준비

1. 한 리스 EGFP 마우스 (이산화탄소 뒤에 자 궁 경부 전위)를 안락사 1 또는 2에 이식 하기 전에 h.
2. 70% 에탄올과 동물 몸 표면 스프레이.
3. 수술가 위를 사용 하 여 두 다리 발목 주위에 피부 절 개 하 고 수술 집게로 당겨 떨어져 피부와 함께 깨끗 한 근육 조직을 노출 하는 모피.
4. 수술가 위를 사용 하 여 가능한 많은 근육 다리에서 제거. 한가 위를 사용 하 여 (무릎과 발목 관절)에서 뼈를 잘라 하 고 화관에서 tibias 거 즈 스폰지를 사용 하 여 모든 나머지 근육 조직의 청소. (2 개의 화관과 두 tibias) 뼈 포함 된 DMEM 10 %6 잘 플레이트에 배치 FBS.
5. 10 mL 감기 2 mM EDTA PBS와 피펫으로 박격포에 뼈 골 셀을 단일 셀 서 스 펜 션으로 셀을가지고 크 러시. 또는, 1 mL 주사기 각 측에서 2 mM EDTA PBS 3 시간 뼈를 플러시.
6. 15 mL 원심 분리기 관으로 70 µ m 필터를 사용 하 여 골 수 세포를 필터링 합니다. 2-3 mL PBS의 필터를 씻어. 460 x g에서 10 분 아래로 셀 회전, resuspend 10 ml 신선한 DMEM의 셀 10 %FBS.
7. hemocytometer에 골 셀을 1.5 x 10⁷ 셀/mL IMDM에 없이 혈 청 농도 조정 합니다. 200 µ L의 양으로 동물 당 3 x 10⁶ 셀을 사용 합니다. 총 BM의 약 1/3 세포는 골수성 GFP + 셀. 주입에 대 한 준비까지 얼음에 셀을 둡니다. 10⁵ 셀 x 0.5를 사용 하 여 GFP 식을 FACS⁹에 의해 결정.

3. RBPJKO 쥐로 리스 GFP 셀 골 수 이식

1. 받는 사람 마우스 원형에 제 지. 감마 방사선의 치명적인 복용량을 가진 쥐를 비추는 (1200 Rad) Cs 137 irradiator에. 분할 복용 프로토콜을 사용 하 여: 저녁에 900 래 드 300 래 드 뒤 다음날 아침 (16 h 떨어져).
2. 치명적 방사능된 RBPJWT 및 RBPJKO 받는 사람 마우스 이식 방사선의 두 번째 투여 후 5-6 h. BM 주사 셀 리스 EGFP 쥐 꼬리 정 맥 주입 (수확 제 2에 있는 셀에 대 한 세부 정보 참조) 동물 을 통해 당 3 x 10⁶ 세포의 농도에서에서 수확.
3. 다른 시간 지점에서 IVFM에 의해 이식된 생쥐의 독립적인 동료 이미지: 24 h, 그리고 2, 4, 6, 설명 대로 아래 주 (4 & 5 vivo에서 이미징 절차에 대 한 섹션 참조).

4. 수술 준비 Intravital 이미징

1. 수술 기구를 소독. 두 집게 (한 직선, 각도 하나), 좋은 좋은 위과 바늘의 한 쌍의 한 쌍. 모든 공급 절차에 필요한 요원 영역을 준비 합니다.
2. 마우스에 게 케 타 민 칵테일 마 취의 IP 주사 (Xylazine 2.5-5 m g/k g + acepromazine 1.0-2.5 m g/k g + 케 타 민 90-100 mg/kg) 26-28 G 바늘 주사기를 사용 하 여.  동물은 매 15 분 절차 동안 모니터링 될 것 이다 하 고 마 취 원래 복용량의 ¼에 필요에 따라 보완 될 것입니다.
3. 적절 한 열 소스 (37 ° C가 열 패드가 열 패드와 직접적인 접촉에서 보호 동물)에 마우스를 놓고 시각적으로 호흡 속도 모니터링 합니다.
4. 발가락을 사용 하 여 반사 꼬집어 응답을 확인 합니다. 동물 인지 확인 완전히 마 취 수술 절차를 시작 하기 전에.
5. 26-28를 사용 하 여 주고 쥐 형광 혈관 마커 (Dextran, 20 mg/mL 해결책의 100 μ)의 꼬리 정 맥 주입 바늘 주사기 게이지.
6. 두 눈에 수 의사 눈 연 고를 적용 합니다. 클립을 작은 전기 면도기와 동물의 머리의 등 쪽 표면. 제 모 크림을 제거 하 여 다음 식 염 수로 씻어 5 분 사용 거 즈 스폰지에 크림을 적용 합니다. 70% 알코올 면봉을 사용 하 여 깨끗 한 두 피를 준비.
7. 기본 등 두개골 표면 노출로 두 피에 작은 중간 피부 절 개 (10-20 m m)을 잘 집게와가 위를 사용 합니다. 5-0 수술 실크를 사용 하 여 피부 절 개를 만드는 영상에 대 한 calvarium를 노출 하는 플랩의 각 측면에 두 개의 숙박 봉합 배치.
8. 그들의 뒤에 쥐를 놓고 현미경 기름을 가득 유리 하단 접시에 노출 된 두 피를 잠수함. Mutiphoton 룸 이미징에 동물을 전송 합니다.
9. 동물에 현미경 단계 목표 위에 유리 접시에 위치 하는 calvarium와 놓고는 37 다음 커버° C가 열 패드 (동물 열와 직접적인 접촉에서 보호 되어야 합니다).

5. Vivo에서 마우스 Calvarium의 고해상도 영상

1. Multiphoton 이미징에 대 한 수정 하는 거꾸로 confocal 시스템을 사용 하 여 ( 자료 표참조). 다음 제조업체의 지침 조정 830에 2 광자 레이저 nm, 20 장소 X W, 나 0.95 렌즈 현미경 코 조각에 레이저 빔 정렬 확인.
   참고: 똑바로 현미경 시스템은 가장 일반적으로 이러한 연구에 대 한 사용 하지만 거꾸로 multiphoton 시스템 또한 활용 될 수 있습니다. 본이 연구에서는 사용자 지정 설계 된 atraumatic stereotaxic 장치 사용 되었다. 똑바로 현미경 시스템에 대 한 몇 가지 상용 stereotaxic 장치 있지만 마우스 두개골 확보 겨냥 하는 거꾸로 한 현미경 시스템에 대 한 아무 상업적으로 이용 가능한 stereotaxic 장치가입니다. 사용자 지정 stereotaxic 장치에 대 안으로, 두개골 위의 안정성에 대 한 다양 한 테이프 또는 접착제 방법을 활용 하 고 목표 위치에 보안 수 있습니다.
2. 이미지 수집 소프트웨어를 엽니다. "수집 설정"에서 패널 한 방향 스캐닝 모드 선택 됩니다 확인 합니다. 4 μ/픽셀, 512 x 512 픽셀 프레임 속도 스캔 속도를 설정 하 고 1.5로 확대. 20 X W 나 0.95 목표는 nosepiece에서 렌즈에 맞게 사용할 수 있는 렌즈의 목록에서 선택 합니다.
3. "이미지 수집" 제어판에서 "염료" 목록에 액세스 하 고 "두 광자"를 선택 합니다. "빛 경로 & 염료" 창 열고 레이저 단위 2에서에서 확인란을 선택 하 여 DM690-980 여기 DM. 2 P 레이저 셔터 열기를 선택 합니다. "현미경 컨트롤러" 창에서 RDM690 미러를 선택 합니다.
4. "피 램프"를 선택, B/G 피 필터 큐브를 선택 하 고 목표 혈관 흐름을 사용 하 여 참조로 중앙 정 맥 (a)와 (b) (그림 2A) 관상 봉합의 분기 calvarium 골 틈새를 시각화 하는 표본에 집중.
5. 비 descanned 모드를 사용 하 여 이미지를 수집 합니다. 3 외부 감지기 선택: PMT detector1 콜라겐의 SHG 신호 수집 하 (방출 필터-430/100 nm), GaAsP detector2 수집 GFP 신호 (방출 필터-525/50) 및 GaAsP detector3 TRITC-dextran의 신호를 수집 하 (방출 필터-605/90 nm).
   1. 스캔 속도 4μs/phototoxicity를 최소화 하기 위해 아무 평균 픽셀에서 이미지를 수행 합니다. 최소한의 채도와 검출기의 전체 동적 범위를 사용 하도록 조정 일정 레이저 파워 및 검출기 이득에서 이미지를 수집 합니다.
   2. Calvarium 골 수의 6 지역에서 조직 (60 x 1 μ m Z-스택)의 깊이 통해 섹션의 시리즈를 수집 합니다. 1 μ m의 단계 크기 설정을 사용 하 여, 확대/축소 1.5 및 512 x 512 픽셀 프레임 크기 (423 µ m x 423 µ m).
      참고: 전체 한 마우스를 이미지 하는 데 필요한 총 시간 1-1.5 h입니다.

6입니다. 정량 분석

1. 제조업체의 지침에 따라 전용된 3D/4d 이미지 정량 및 시각화 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 정량 및 3D 개조를 수행 ( 자료 표참조). Z-스택 최대 강렬 투 상 (MIP), 활용 하는 차원에서 알파 혼합 또는 그림자 투영 볼륨 렌더링 알고리즘을 대화식으로 시각화.
2. 사용 하 여 GFP 셀 세그먼트는 "자리 개체 세그먼트화 모듈". 스택 산술 처리 (채널 빼기) 거짓 긍정적인 수 GFP 셀 (녹색 및 빨강 채널에서 강한 형광을 표시 하는 뼈 세포의 신호 제거)를 제거 하기 위해 적용 됩니다.
3. 맥 관 구조와 뼈 표면 표면 세그먼트화 모듈을 사용 하 여의 세분화를 수행 합니다. 필요한 경우, "표면에 반점의 거리" 라고 하는 X-긴장 알고리즘을 적용 하 여 위의 표면에 세포의 거리를 계산 합니다.

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결과

2 RBPJKO 및 2 RBPJWT 받는 사람의 동료 다른 시간 지점에서 개별 이미징 세션에 몇 군데 있었다: 24 h와 2, 4 및 6 주 (워크플로 그림 1A일러스트) BM 리스-GFP 세포의 이식 후.

각 마우스에서 이미지 (그림 2A,)중앙 정 맥 그리고 관상 봉합 (그림 2A, b)의 분기점에 관하여 그들의 위치에 의?...

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토론

이 프로토콜 Intravital 형광 현미경 검사 법에 의해 최적화 engraftment 조 혈 모 세포의 활동을 연구 하는 실험 설계를 설명 합니다. 이 연구에서는 골수성 조상 세포 WT BM 또는 노치 신호 결함이 있는 BM의 확장 했다 추적 뼈 calvarium에서 다음 리스 GFP 긍정적인 골수성 세포 BMT 후 받는 사람 RBPJWT 또는 RBPJKO로. 이 접근은 주소 비슷한 질문에 예를 들면 적용 될 수 있는 모델로 제안: 나) 확장과 다른 계보의 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine cocktail	IU School of Medicine		Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextran	Tdb Consultancy	TD150-100mg	Other color dextran may be used.
Andis hair trimmer	Braintree Scientific	CLP-323 75
Gauze sponge	Med Vet International	PK224	4-ply, 2 x 2
Nair depilatory cream	Commercial store
Saline	Med Vet International	RXSAL-POD1LT	0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringe	Fisher Scientific	14-826-79	28 g, 1/2 cc
Fine Forceps	Fine Science Tools	00108-11, 00109-11	straight forcep, angled forcep
Scissor	Fine Science Tools	15018-10
Needle holder	Fine Science Tools	12002-14
5-0 silk suture	Fisher Scientific	MV-682	Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dish	WillCo	GWSt-5040
Optical microscope oil	Leica
Stereotaxic stage insert	IU School of Medicine	Custom design
Olympus FV1000 confocal microscope system	Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective	Olympus
Small heating pad	Commercial store		Zoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging software	Bitplane		3/4 D Image Visualization and Analysis software