Kombination von intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) mit genetischen Modellen Engraftment Dynamik der blutbildenden Zellen des Knochenmarks Nischen zu studieren

Zusammenfassung

Intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) von der Calvarium wird in Kombination mit genetischen Tiermodelle zur Untersuchung der Referenzfahrt und Engraftment des blutbildenden Zellen des Knochenmarks (BM) Nischen angewendet.

Zusammenfassung

Erhöhung der Beweis zeigt an, dass die normale Blutbildung durch ausgeprägte microenvironmental Hinweise in der BM reguliert wird, darunter spezialisierte zelluläre Nischen modulierende kritische hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Funktionen^1,2. In der Tat zeichnet sich ein genaueres Bild von der hämatopoetische Mikroumgebung jetzt bei dem bilden der endosteal und die endothelialen Nischen Funktionseinheiten für die Regulierung des normalen HSC und ihre Nachkommen^3,4,5, . Neue Studien haben die Bedeutung der perivaskuläre, Adipozyten und neuronalen Zellen bei der Erhaltung und Regulierung der HSC Funktion^6,7,8gezeigt. Darüber hinaus gibt es Beweise, dass Zellen aus verschiedenen Linien, d.h. myeloischen und lymphatischen Zellen, Haus und wohnen in speziellen Nischen innerhalb der BM Mikroumgebung. Allerdings ist eine vollständige Zuordnung der BM Mikroumgebung und seine Bewohner noch im Gange.

Transgenen Mausstämme Linie bestimmte fluoreszierende Markierungen oder Mäuse, die genetisch ausgeführt, um ausgewählte Moleküle in bestimmten Zellen der BM Nische fehlt auszudrücken sind jetzt verfügbar. Knock Out und Abstammung tracking-Modelle in Kombination mit Transplantation Ansätze bieten die Möglichkeit, das Wissen über die Rolle der spezifischen "Nische" zu verfeinern Zellen für definierte hämatopoetischen Bevölkerungen, wie HSC, B-Zellen, T-Zellen, myeloische Zellen und erythroiden Zellen. Diese Strategie kann weiter durch die Zusammenlegung des Einsatz von zwei-Photonen-Mikroskopie von den Calvarium verstärkt werden. Indem in Vivo hochauflösende Bildgebung und 3-d-Rendering von BM Calvarium, können wir jetzt genau die Position bestimmen, wo bestimmte hämatopoetische Teilmengen in BM zu Hause und die Kinetik der ihre Expansion im Laufe der Zeit zu bewerten. Hier werden Lys-GFP transgene Mäuse (Markierung myeloische Zellen)⁹ und RBPJ Knock-out-Mäusen (fehlender kanonische Notch signaling)¹⁰ in Kombination mit IVFM zur Engraftment myeloische Zellen eine Kerbe defekt BM Mikroumgebung zu bestimmen.

Einleitung

Intravitalen multiphoton Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) ist ein leistungsfähiges bildgebendes Verfahren, das ermöglicht die hochauflösende, Echtzeit-Bildgebung von Geweben mit Tiefe bis zu 1mm, je nach Gewebe. Bei der Anwendung auf die Maus Calvarium ermöglicht es, beobachtet das Verhalten der hämatopoetischen Zellen innerhalb der BM in eine nicht-invasive Weise bis zu 60-100 μm¹¹. Dieser Ansatz dient hier die Kinetik des Engraftment des normalen myeloische Vorfahren in den BM RBPJ Knock-out-Mäusen fehlt kanonische Kerbe Signalisierung zu bestimmen.

Neuere Arbeiten aus unserer Gruppe zeigten, dass Defekte kanonische Kerbe Signalisierung BM Mikroumgebung, führe zu einer myeloproliferative-ähnliche Erkrankung¹². Verlust der Notch signaling erhielten bedingte Löschung der DNA-bindende Domäne der RBPJ, der kritischen Transkriptionsfaktor flussabwärts der kanonischen Kerbe Signalisierung mit Mx1-Cre Rekombination¹⁰induziert. In dieser Studie wurde die Mx1-Cre/RBPJ^Lox/Lox Mäusen Modell verwendet. Bedingte Löschung des Motivs DNA-Bindung des RBPJ führt zum Verlust der Signalisierung von allen Notch Rezeptoren. In der Mx1-Cre-Modell, Cre Ausdruck durch den Mx1-Projektträger bei der Verabreichung von PolyI:C, wodurch die Induktion der gezielte gen Löschung in den Blutkörperchen sowie Stromazellen Komponenten mehrerer Organe aktiviert angetrieben wird einschließlich BM, Milz und Leber.

Mx1-Cre⁺/RBPJ^Lox/Lox und Mx1-Cre^–/RBPJ^Lox/Lox Mäusen mit PolyI:C (hereon gekennzeichnet als RBPJKO und RBPJWT, beziehungsweise) induziert wurden tödlich bestrahlt und mit normalen, Wildtyp hämatopoetischen Zellen transplantiert. Ab 4. Woche nach der Transplantation, entwickelt RBPJKO Empfänger deutliche Leukozytose gefolgt von Splenomegalie. Obwohl RBPJKO Mäuse zunehmenden Anteils myeloischer Vorläuferzellen in der BM 8. Woche nach Transplantation und zu späteren Zeitpunkten vorgestellt, offenbart Analyse des BM 4 und 6 Wochen nicht auffällige Unterschiede inhaltlich myeloische Zellen im Vergleich zur Kontrolle RBPJWT Empfänger. Diese Beobachtung zusammen mit der Tatsache, dass Mx1-Cre in verschiedenen blutbildenden Organe exprimiert wird die Frage aufgeworfen, ob die BM Mikroumgebung direkten Einfluss auf die Einleitung der myeloproliferative Phänotyp hatten.

Um festzustellen, ob der BM eine kritische erste Website der Krankheitsentwicklung war, wurde IVFM von der Maus Calvarium in Kombination mit BM-Transplantation (BMT), RBPJ-Knock-Out-Modell und eine Linie tracking-System verwendet. Transgene Mäuse, die mit dem Ausdruck EGFP unter der Kontrolle der spezifischen Lysozym Promotor (Lys-GFP)⁹ wurden verwendet, um die Spenderzellen zu erhalten, die bei BM imaging nach BMT visualisiert werden können. Lysozym Ausdruck ist spezifisch für myeloische Zellen und Lys-GFP markiert Zellen aus der gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen (CMP) zur Reife Granulozyten¹³.

IVFM des BM zu unterschiedlichen Zeitpunkten gezeigt, dass Lys-GFP Zellen ebenso an die BM der RBPJWT und RBPJKO Empfänger vernetzten, aber erweitert und schneller in der BM RBPJKO Empfänger aufgeprägt. Dieser Unterschied war dramatisch zum früheren Zeitpunkt (Woche 2) und verringerte sich im Laufe der Zeit (Wochen 4 und 6). Jedoch zu dieser späteren Zeitpunkten, Bewertung von hämatopoetischen Fach in den gleichen Empfänger zeigte eine stetige Zunahme der Zahl der myeloischen Zellen zirkulieren in der PB und lokalisiert in der Milz von Mäusen, RBPJKO, zeigt eine erhöhte Leistung von Zellen aus dem BM in den Blutkreislauf. Lys-GFP Zellen Lokalisierung in der BM von transplantierten Mäusen bei 6 Wochen ergab, dass myeloische Zellen weiter das Gefäßsystem in der Mikroumgebung RBPJKO als im Steuerelement wohnen würden.

Kollektiv, Einblicke die Kombination von IVFM mit dieser bestimmten Tiermodellen in der Engraftment Dynamik der myeloischen Zellen in die RBPJKO BM Mikroumgebung. Die Versuchsplanung und quantitative der hier beschriebene Ansatz wird vorgeschlagen, als ein Paradigma, die angewendet werden kann, um ähnliche Fragen beantworten. Beispielsweise gestatten die Verwendung der anderen Zelle spezifische Linie tracking-Modelle, wie RAG1-GFP¹⁴ oder Gata1-GFP¹⁵ Mäuse, im Anschluss an das Verhalten des lymphatischen oder erythroiden Vorläuferzellen, bzw. in dem BM.

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Protokoll

Alle Verfahren im Zusammenhang mit der Verwendung von Tieren wurden mit Genehmigung der Animal Care und verwenden Ausschuss der Indiana University School of Medicine durchgeführt. Sicherstellen Sie, dass die Einhaltung der Rechtsvorschriften über Tierversuche des Landes wo die Arbeit ausgeführt wird.

1. Vorbereitung des Mx1CreRBPJ^{- / -} Empfänger Mäuse

1. Mx1-Cre⁺ Mäuse mit RBPJ^Lox/Lox Mäusen¹⁰ Mx1-Cre zu überquerenpositive ^RBPJLox/Lox Mäusen¹² und Mx1-Cre negative RBPJ^Lox/Lox Wurfgeschwistern als Steuerelemente verwenden. Überprüfen Sie den Genotyp durch PCR-¹⁰.
2. Verwenden Sie 6-8 Wochen-alte Mx1Cre⁺/RBPJ^Lox/Lox und Mx1Cre^–/RBPJ^Lox/Lox Mäusen, die PolyI:C Induktion durchzuführen.
3. PolyI:C 200 µg i.p Cre⁺ und Cre^– Mäuse zu injizieren. Geben Sie eine PolyI:C Injektion jeden zweiten Tag für 3 Tage in der ersten Woche. Geben Sie eine PolyI:C Injektion der zweiten Woche, 7 Tage nach der letzten Injektion (insgesamt vier Injektionen).
   1. Verwenden Sie RBPJKO (induzierte Mx1Cre⁺/RBPJ^Lox/Lox) und RBPJWT (induzierte Mx1Cre^–/RBPJ^Lox/Lox) Mäuse als Empfänger 3 Wochen nach der letzten Injektion von PolyI:C.
      Hinweis: Es wird empfohlen, Mäuse induziert durch pI: pC 3 Wochen nach der Injektion zu verwenden. Die IFNα Reaktion ausgelöst durch PolyI:C erhebliche Veränderungen in der BM, was die Immunophenotypic-Erweiterung des HSC und verringerte Leistung von Reifen Stammväter in das periphere Blut^16,17. Darstellung der hämatopoetischen Teilmengen ist normalisierte 3 Wochen nach der Injektion und die Mäuse ohne verwirrende Entzündungen genutzt werden können. Diese Induktion-Protokoll ist für RBPJ optimiert worden. Wenn ein anderes gen zu löschen, die Induktion Protokoll variieren das Konstrukt und Löschung muss überprüft werden. Wir validiert ~ 100 % Streichung der RBPJ Region zwischen LoxP-Standorten durch RT-PCR nach insgesamt vier PolyI:C Injektionen.

2. Vorbereitung des Lys-EGFP Spenderzellen Knochenmark zur Transplantation

1. Einschläfern eine Lys-EGFP-Maus (Kohlendioxid gefolgt von zervikale Dislokation) 1 oder 2 h vor der Transplantation.
2. Besprühen Sie die tierischen Körper-Oberfläche mit 70 % Ethanol.
3. Können Sie chirurgische Scheren einen Hautschnitt an beiden Beinen um den Knöchel zu machen und mit chirurgischen Zangen wegziehen Haut und Fell zusammen, um saubere Muskelgewebe verfügbar zu machen.
4. Verwenden Sie chirurgische Scheren, um so viel Muskelmasse wie möglich aus den Beinen zu entfernen. Mit einer Schere schneiden die Knochen (an Knie und Sprunggelenk) und alle übrigen Muskelgewebe aus dem Oberschenkelknochen und Schienbeine mit Gaze Schwämme reinigen. Legen Sie die Knochen (zwei Oberschenkelknochen und zwei Tibien) in einer 6-Well-Platte mit DMEM 10 % FBS.
5. Zerdrücken Sie den Knochen in einem Mörser mit 10 mL kalten 2mM EDTA PBS und Pipettieren Knochenmarkzellen um die Zellen in einzellige Aussetzung zu bringen. Alternativ spülen Sie die Knochen mit 2 mM EDTA PBS 3 Mal von jeder Seite mit einer 1 mL Spritze.
6. Filtern Sie die Knochenmarkzellen mit einem 70 µm-Filter in ein Zentrifugenröhrchen 15 mL. Spülen Sie die Filter mit ca. 2-3 mL PBS. Drehen Sie die Zellen nach unten 10 min bei 460 X g, Aufschwemmen der Zellen in 10 mL frisches DMEM 10 % FBS.
7. Zählen Sie Knochenmarkzellen auf ein Hemocytometer und passen Sie die Konzentration auf 1,5 x 10⁷ Zellen/mL in IMDM ohne Serum. Verwenden Sie 3 x 10⁶ Zellen pro Tier mit einem Volumen von 200 µL. Ca. 1/3 des gesamten BM myeloische GFP + Zellen sind. Lassen Sie die Zellen auf Eis, bis bereit zur Injektion. Verwenden Sie 0,5 x 10⁵ Zellen GFP Ausdruck durch FACS⁹zu ermitteln.

(3) Knochenmark-Transplantation von Lys-GFP Zellen in RBPJKO Mäuse

1. Empfängers Mäuse in einem Kreisdiagramm Käfig zurückhalten. Mäuse mit einer letalen Dosis von Gamma-Strahlung zu bestrahlen (1.200 Rad) auf eine Cs-137-Brutapparat. Verwenden Sie eine geteilte Dosis Protokoll: 900 rads am Abend gefolgt von 300 rads am nächsten Morgen (16 h auseinander).
2. Transplant letal bestrahlten RBPJWT und RBPJKO Empfänger Mäuse 5-6 h nach der zweiten Dosis der Strahlung. BM injizieren Zellen geerntet von Lys-EGFP-Mäusen in einer Konzentration von 3 x 10⁶ Zellen pro Tier über Heck Vene Injektion (siehe Details zum Ernten von Zellen in Abschnitt 2).
3. Bild unabhängige Kohorten von transplantierten Mäusen durch IVFM zu verschiedenen Zeitpunkten: 24 h, und in der Woche 2, 4 und 6, wie beschrieben unten (siehe Abschnitt 4 & 5 für in-Vivo imaging-Verfahren).

4. chirurgische Vorbereitung intravitalen Imaging

1. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente. Zwei feine Pinzette (eine gerade, eine abgewinkelt), ein paar feine Schere und ein paar Nadelhalter. Bereiten Sie operativen Bereich mit allen Lieferungen für Verfahren benötigt.
2. Geben Sie der Maus eine IP-Injektion von Ketamin cocktail Betäubung (Xylazin 2,5-5 mg/kg + Acepromazine 1,0-2,5 mg/kg + Ketamin 90-100 mg/kg) mit einer 26-28 G Nadel Spritze.  Tier wird alle 15 Minuten während des Eingriffs überwacht werden und Narkose wird nach Bedarf auf ¼ der ursprünglichen Dosis ergänzt werden.
3. Platzieren Sie den Mauszeiger auf einer richtigen Wärmequelle (37 ° C Heizkissen, Tier geschützt vor direktem Kontakt mit Heiz-Pads) und überwachen Sie die Atemfrequenz visuell zu.
4. Überprüfen Sie Reflexe mit dem Zeh Response kneifen. Sicherstellen Sie, dass das Tier vollständig unter Narkose ist, vor Beginn jeder chirurgischen Eingriffen.
5. Verwendung eines 26-28 gauge Nadel Spritze Mäuse eine Rute Vene Injektion eines fluoreszierenden vaskuläre Marker (Dextran, 100 μL 20 mg/mL Lösung) geben.
6. Tierarzt Augensalbe auf beiden Augen anwenden. Clip der dorsalen Oberfläche des Tierkopfes mit kleinen elektrischen Haarschneider. Wenden Sie eine Haarentfernung Creme für 5 min. Einsatz Gaze Schwämme, die Creme zu entfernen und dann mit Kochsalzlösung abspülen. Vorbereitung der sauberen Kopfhaut mit 70 % Alkohol mit einem Wattestäbchen.
7. Verwenden Sie feine Pinzetten und Scheren zu einem kleinen Mittellinie Hautschnitt (10-20 mm) auf der Kopfhaut, die zugrunde liegenden dorsalen Schädel Oberfläche verfügbar zu machen. Verwenden Sie 5-0 chirurgische Seide um zwei Aufenthalt Nähte in der Haut auf jeder Seite des Schnittes, erstellen eine Klappe, die Calvarium für die Bildgebung aussetzen zu platzieren.
8. Positionieren Sie die Mäuse auf den Rücken und Tauchen Sie die exponierten Kopfhaut in eine Glasschale unten mit Mikroskop Öl gefüllt. Das Tier der Mutiphoton imaging Raum zu transportieren.
9. Legen Sie das Tier auf den Mikroskoptisch mit dem Calvarium positioniert auf die Glasschale über das Ziel und dann bedecken Sie mit einem 37° C Heizkissen (Tier muss vor direktem Kontakt mit Hitze geschützt werden).

5. in Vivo hochauflösende Bildgebung der Maus Calvarium

1. Verwenden Sie ein umgekehrte konfokale System für multiphoton Bildgebung modifiziert (siehe Materialien Tabelle). Folgende Angaben des Herstellers tune einen 2-Photonen-Laser mit 830 nm, eine 20 X W, NA 0.95 Objektiv in das Mikroskop Nasenstück und überprüfen Sie den Laser-Strahl-Ausrichtung.
   Hinweis: Aufrechte Mikroskopsysteme werden am häufigsten für diese Studien verwendet, aber eine umgekehrte multiphoton-System kann auch genutzt werden. In dieser Studie wurde eine benutzerdefinierte gestaltete atraumatische stereotaktischen Gerät verwendet. Obwohl mehrere handelsübliche stereotaktischen Geräte für aufrechte Mikroskopsysteme vorhanden sind, gibt es keine handelsübliches stereotaktischen Gerät für ein umgekehrtes Mikroskopsystem zur Sicherung des Maus-Schädels. Als alternative zu einem benutzerdefinierten stereotaktischen Gerät kann der Schädel in Position über das Ziel, die Verwendung von Klebeband oder Klebstoff Methoden zur Stabilität gesichert werden.
2. Öffnen Sie eine Bild-Datenerfassungs-Software. In den "Erwerb"Settings Panel überprüfen, ob eine direktionale Scan-Modus ausgewählt ist. Richten Sie die Geschwindigkeit des Scannens 4 µs/Pixel, Bildrate auf 512 x 512 Pixel und Zoomen Sie auf 1,5. Wählen Sie 20 X W Na 0,95 Ziel aus der Liste der verfügbaren objektiven entsprechend das Objektiv in der Nasensteg positioniert.
3. Zugriff auf die "Dye-Liste" aus der "Image Acquisition Systemsteuerung" und wählen Sie "Zwei-Photon". Öffnen Sie das Fenster "Licht Weg & Farbstoffe" und wählen Sie DM690-980 Erregung DM Open der 2P-Laser-Verschluss durch Aktivierung des Kontrollkästchens in der Laser-Unit 2. Wählen Sie im Fenster "Mikroskop Controller" RDM690 Spiegel.
4. Wählen Sie "EPI-Lampe", wählen Sie B/G-Epi-Filter-Cube und konzentrieren Sie das Ziel auf die Probe, Kreislauf fließen und die Calvarium Knochenmark Nische, mit als Referenz der Bifurkation der Zentralvene (a) und die koronare Naht (b) (Abb. 2A) zu visualisieren.
5. Sammeln Sie Bilder mit nicht descanned Modus. Wählen Sie drei externen Detektoren: PMT detector1 SHG Signal von Kollagen zu sammeln (Emission Filter - 430/100 nm), GaAsP detector2 sammeln GFP-Signal (Emission Filter - 525/50) und GaAsP detector3 Signal des TRITC-Dextran sammeln (Emission Filter - 605/90 nm).
   1. Durchführen Sie Bildgebung mit einer Scanrate von 4μs/Pixel mit keine Mittelung zur Minimierung von Phototoxizität. Sammeln Sie Bilder einen konstanten Laser Power und Detektor Gewinn so angepasst, dass um den volle Dynamikumfang des Detektors mit minimalen Sättigung zu nutzen.
   2. Sammeln Sie Serie Abschnitte durch die Tiefe des Gewebes (60 x 1 μm Z-Stapel) aus 6 Regionen Calvarium Knochenmark. Verwenden Sie Schritt Größeneinstellungen von 1 μm, zoom, 1,5 und 512 x 512 Pixel Rahmengröße (423 µm X 423 µm).
      Hinweis: Insgesamt ist total Zeitaufwand für eine Maus Bild 1-1,5 h.

(6) Quantitative Analyse

1. Die Bild-Quantifizierung und 3D Rekonstruktionen mit einer dedizierten 3D/4D Bild Quantifizierung und Visualisierung Software gemäß Herstellervorschrift auszuführen (siehe Materialtabelle). Z-Stacks in 3D mit maximaler Intensität Projection (MIP), Alpha-Mischung oder Schatten Projektion Volume Rendering Algorithmen interaktiv zu visualisieren.
2. Segment GFP Zellen unter Verwendung der "Ort Objektmodul Segmentierung". Gelten Sie Stack arithmetischen Verarbeitung (Kanal Subtraktion) um falsche positive Zählung der GFP Zellen zu beseitigen (dadurch Signal von Knochenzellen, die starke Fluoreszenz im grünen und roten Kanäle anzeigen).
3. Durchzuführen Sie Segmentierung der Gefäße und Knochen Oberfläche mit Hilfe des Moduls Oberfläche Segmentierung. Bei Bedarf berechnen Sie Entfernungen von Zellen zu einem der oben genannten Oberflächen durch X-Tension Algorithmen "Abstand von spot zu Oberfläche" genannt.

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Ergebnisse

Kohorten von 2 RBPJKO und 2 RBPJWT Empfängern wurden in eine bildgebende Einzelsitzung zu unterschiedlichen Zeitpunkten abgebildet: 24 h und 2, 4 und 6 Wochen nach der Transplantation der BM Lys-GFP Zellen (Workflow abgebildet in Figur 1A).

In jeder Maus wurden Bilder aus 6 standard Regionen der BM Calvarium, gekennzeichnet durch ihre Position in Bezug auf die Zweiteilung der Zentralvene (Abb. 2A

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Design so optimiert, dass die Kinetik der blutbildenden Zellen Engraftment studieren von fluoreszierendem intravitalen Mikroskopie. In dieser Studie wurde der Ausbau der myeloischen Vorläuferzellen in einer WT-BM oder in eine Kerbe, die Signalisierung defekt BM in den Knochen Calvarium von folgenden Lys-GFP positive myeloische Zellen nach BMT in RBPJWT oder RBPJKO Empfänger verfolgt. Dieser Ansatz wird vorgeschlagen, als ein Modell, das auf ähnliche Fragen, zum Beispiel ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine cocktail	IU School of Medicine		Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextran	Tdb Consultancy	TD150-100mg	Other color dextran may be used.
Andis hair trimmer	Braintree Scientific	CLP-323 75
Gauze sponge	Med Vet International	PK224	4-ply, 2 x 2
Nair depilatory cream	Commercial store
Saline	Med Vet International	RXSAL-POD1LT	0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringe	Fisher Scientific	14-826-79	28 g, 1/2 cc
Fine Forceps	Fine Science Tools	00108-11, 00109-11	straight forcep, angled forcep
Scissor	Fine Science Tools	15018-10
Needle holder	Fine Science Tools	12002-14
5-0 silk suture	Fisher Scientific	MV-682	Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dish	WillCo	GWSt-5040
Optical microscope oil	Leica
Stereotaxic stage insert	IU School of Medicine	Custom design
Olympus FV1000 confocal microscope system	Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective	Olympus
Small heating pad	Commercial store		Zoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging software	Bitplane		3/4 D Image Visualization and Analysis software