Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek

Özet

İntravital Floresans mikroskobu (IVFM) hasta, posta ve kemik iliği (BM) niş içine hematopoetik hücrelerin engraftment çalışmaya genetik hayvan modelleri ile birlikte uygulanır.

Özet

Kanıt artan o normal hematopoiesis kritik hematopoetik kök hücre (HSC) işlevleri^1,2oransal özel hücresel nişler dahil farklı microenvironmental cues BM içinde düzenlenir gösterir. Nitekim, hematopoetik microenvironment daha ayrıntılı bir resim şimdi, endosteal ve endotel nişler normal HSC ve onların döl^{3,4,5 düzenlenmesi için işlevsel birimler şeklinde ortaya çıkmaktadır} . Yeni çalışmalar Perivasküler hücreleri, adipositler ve bakımı ve HSC işlevi^6,7,8düzenleyen nöronal hücre önemini ortaya koymuştur. Ayrıca, kanıt hücreleri farklı soy, Yani myeloid ve lenfoid hücrelerin, ev ve BM microenvironment içinde belirli niş yer alır. Ancak, tam eşleme BM microenvironment ve onun işgalcilere hala devam ediyor.

Lineage belirli floresan işaretçileri veya BM niş belirli hücreleri seçili molekülleri eksikliği için genetik olarak fareler ifade transgenik fare suşları are şimdi elde edilebilir. Knock-out ve modelleri, nakli yaklaşımlar, birlikte izleme soyu sağlamak bilgi özel "niş" rolünü iyileştirmek için fırsatın hücreleri gibi HSC, tanımlanmış hematopoetik nüfus için B-hücreleri, T-hücreleri, myeloid hücrelerin ve erythroid hücreleri. Bu strateji daha fazla hasta İki fotonlu mikroskobu kullanımını birleştirerek potentiated. Vivo içinde yüksek kararlılık düşsel ve 3-b BM hasta işlenmesini sağlayarak, Şimdi tam olarak nerede belirli hematopoetik alt kümeleri içinde BM ana sayfa ve zaman içinde kendi genişleme Kinetik değerlendirmek yerini belirleyebilirsiniz. Burada, Lys-GFP transgenik fareler (myeloid hücrelerin işaretleme)⁹ ve RBPJ knock-out fareler (kurallı çentik sinyal eksik)¹⁰ IVFM ile birlikte bir çentik arızalı BM microenvironment myeloid hücrelerin engraftment belirlemek için kullanılır.

Giriş

İntravital multiphoton Floresans mikroskobu (IVFM) yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı derin dokuların kadar görüntüleme için izin veren bir tekniktir güçlü görüntüleme doku bağlı olarak 1mm. Fare hasta uygulandığında, 60-100 mikron¹¹' e non-invaziv bir şekilde hematopoetik hücrelerin içinde BM davranışını gözlemlemek izin verir. Bu yaklaşım burada normal Miyeloid ataları kurallı çentik sinyal eksik RBPJ BM knock-out farelerde engraftment Kinetik belirlemek için kullanılır.

Bizim grup son işten o arızalı kurallı çentik BM microenvironment yol miyoproliferatif benzeri hastalık¹²içinde sinyal gösterdi. Çentik sinyal kaybı DNA bağlayıcı etki RBPJ, nehrin aşağısında kurallı çentik sinyal, Rekombinasyon¹⁰indüklenen Mx1-Cre kullanarak, kritik transkripsiyon faktörü, koşullu silme tarafından elde edildi. Bu çalışmada, Mx1-Cre/RBPJ^{füme balığı/füme balığı} fare modeli kullanılmıştır. Tüm çentik reseptörleri sinyal kaybı RBPJ DNA'ya bağlanıcı motif koşullu silinmesiyle sonuçlanır. Mx1-Cre modelinde, ifade birden çok organlar, kan hücrelerinde de stromal bileşenleri gibi hedeflenen gen silinmesi indüksiyon içinde kaynaklanan polyI:C İdaresi üzerine harekete geçirmek Mx1 organizatörü tarafından tahrik edilmektedir Cre BM, dalak ve karaciğer de dahil olmak üzere.

Mx1-Cre⁺/RBPJ^{füme balığı/füme balığı} ve Mx1-Cre^-/RBPJ^{füme balığı/füme balığı} fare (Bu andan RBPJKO ve RBPJWT, sırasıyla gösterilir) polyI:C ile indüklenen öğrenirim ışınlanmış ve normal, vahşi türü hematopoetik hücreler ile nakledilmektedir. Hafta 4 nakli sonra başlayarak, RBPJKO alıcıları önemli lökositoz splenomegali tarafından takip geliştirdi. BM analizi 4 ve 6 hafta olmadığını göstermiştir RBPJKO fareler Miyeloid ataları artış yüzdesi BM hafta 8 nakli sonra ve daha sonra zaman noktalarda sunulan rağmen myeloid hücre içeriklerini kontrol RBPJWT göre çarpıcı farklılıklar alıcılar. BM microenvironment miyoproliferatif fenotip başlatılması üzerinde doğrudan etkisi olup olmadığını Mx1-Cre farklı hematopoetik organlarda ifade edilir aslında birlikte bu gözlem soru kaldırdı.

BM hastalığın gelişiminin kritik bir başlangıç sitesi olup olmadığını belirlemek için fare hasta IVFM BM nakli (BMT), RBPJ knock-out modeli ve izleme sistemi bir soyu ile birlikte kullanılmıştır. Transgenik fareler EGFP belirli lizozim organizatörü (Lys-GFP)⁹ kontrol altında ifade BM BMT sonra görüntüleme sırasında görüntülenmeyecektir donör hücreleri elde etmek için kullanılmıştır. Lizozim ifade myeloid hücrelerin belirli ve ortak Miyeloid yaratıcı (CMP) hücrelerden olgun granülosit¹³Lys-GFP işaretler.

Farklı zaman noktalarda BM IVFM Lys-GFP hücreleri benzer şekilde RBPJWT BM ve RBPJKO alıcıya bağlantılı ama genişletilmiş ve daha hızlı RBPJKO BM alıcıları engrafted gösterdi. Bu fark daha önceki zaman noktada (2. hafta) dramatik ve zamanla azalmıştır (hafta 4 ve 6). Ancak, daha sonra bu zaman noktalarda aynı alıcının hematopoetik kompartımanda değerlendirilmesi karton kapak dolaşan myeloid hücrelerin sayısı sürekli bir artış gösterdi ve RBPJKO fareler, hücreleri artan bir çıkışını gösteren dalak lokalize kan dolaşımı içine BM. Lys-GFP hücreleri yerelleştirme BM içinde transplante farelerin 6 hafta analizi myeloid hücrelerin RBPJKO microenvironment denetimdeki damarlara kadar uzak ikamet ortaya koydu.

Toplu olarak, bu belirli hayvan modelleri ile IVFM birlikte anlayışlar engraftment dynamics RBPJKO BM microenvironment myeloid hücrelerin içinde sağlanan. Deneysel tasarım ve kantitatif yaklaşım burada açıklanan benzer soruları gidermek için uygulanan bir paradigma olarak önerilmiştir. Örneğin, RAG1-GFP¹⁴ ya da Gata1-GFP¹⁵ fareler gibi modeller, izleme diğer hücre belirli lineage kullanımı lenfoid davranışını izin verebilir veya erythroid ataları, sırasıyla, BM içinde.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvanlar kullanımını içeren tüm yordamları kullanmak Komitesi, Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi ve hayvan bakım onay ile gerçekleştirilmiştir. Hayvan deney çalışma yapılacağı yeri ülke mevzuatına uymak için emin olun.

1. Mx1CreRBPJ^{- / -} alıcı fareler hazırlanması

1. Mx1-Cre⁺ fareler Mx1-Cre elde etmek için RBPJ^{füme balığı/füme balığı} fareler¹⁰ ile çaprazolumlu ^{RBPJfüme balığı/füme balığı} fareler¹² ve Mx1-Cre negatif RBPJ^{füme balığı/füme balığı} littermates denetimleri kullanmak için. Genotip PCR¹⁰tarafından doğrulayın.
2. 6-8 hafta kullanın-eski Mx1Cre⁺/RBPJ^{füme balığı/füme balığı} ve Mx1Cre^-/RBPJ^{füme balığı/füme balığı} fareler polyI:C indüksiyon gerçekleştirmek için.
3. PolyI:C 200 µg ı.p. Cre⁺ ve Cre^- fareler enjekte. Bir polyI:C iğne 3 gündür ilk hafta her gün yapın. Bir polyI:C enjeksiyonu ikinci haftanın 7 gün önceki enjeksiyon (Toplam dört enjeksiyon) sonra yap.
   1. Kullanmak RBPJKO (Mx1Cre indüklenen⁺/RBPJ^{füme balığı/lox}) ve RBPJWT (Mx1Cre indüklenen^-/RBPJ^{füme balığı/lox}) alıcılar 3 hafta sonra son polyI:C enjeksiyon olarak fareler.
      Not: Bu 3 hafta sonra enjeksiyon PI: pC tarafından indüklenen fare kullanmak için tavsiye edilir. PolyI:C tarafından tetiklenen IFNα yanıt HSC immunophenotypic genişlemesi sonucunda BM, önemli değişikliklere neden olmaktadır ve olgun ataları çıkışını periferik kan^16,17düşmüştür. Normalleştirilmiş 3 hafta sonra enjeksiyon ve fare-ebilmek var olmak kullanmak iltihap karıştırıcı etkileri olmadan hematopoetik alt kümeleri gösterimidir. Bu indüksiyon Protokolü RBPJ için optimize edilmiştir. Eğer farklı bir gen silme, indüksiyon Protokolü yapı bağlı olarak değişiklik gösterebilir ve silme doğrulanması gerekir. ~ %100 silme loxP siteler arasında RT-PCR tarafından sonra dört polyI:C enjeksiyonları toplam RBPJ bölgesinin geçerliliği.

2. nakli için hazırlık Lys-EGFP donör kemik iliği hücrelerinin

1. Bir Lys-EGFP fare (karbon dioksit servikal çıkığı tarafından takip) ötenazi 1 veya 2 önce nakli s.
2. Hayvan vücudun % 70 etanol ile sprey.
3. Cerrahi makas kullanmak her iki ayak bileklerinden üzerinde bir cilt kesi yapmak ve cerrahi Forseps ile uzak deri ve kürk birlikte temiz kas dokusu ortaya çıkarmak için çekin.
4. Cerrahi makas kadar kas mümkün olduğunca legs--dan kaldırmak için kullanın. Bir makas kullanırken, kemiklere (diz ve bilek) kesme ve uyluk ve gazlı bez sünger kullanarak yırtılmalarıteşhis kalan herhangi bir kas dokusu temiz. Kemikleri (iki uyluk ve iki yırtılmalarıteşhis) DMEM % 10 içeren bir 6-şey plaka yerleştirin FBS.
5. 10 mL soğuk 2 mM EDTA PBS ve damlalıklı harçla kemiklerde hücreleri tek hücre süspansiyon getirmek için kemik iliği hücreleri ezmek. Alternatif olarak, kemikleri 2 mM EDTA PBS 3 kez ile her taraftan 1 mL şırınga ile yıkayın.
6. Kemik iliği hücreleri bir 15 mL santrifüj tüpüne 70 µm filtre kullanarak filtre. 2-3 mL PBS filtresiyle durulayın. Hücre 10 dk 460 x g az aşağı spin, taze DMEM 10 mL hücrelerde % 10 resuspend FBS.
7. Bir hemasitometre üzerinde kemik iliği hücreleri saymak ve konsantrasyon 1.5 x 10⁷ hücre/mL IMDM serum olmadan için ayarlayın. 3 x 10⁶ hücre, hayvan başına 200 µL hacmi ile kullanın. Toplam BM hücrelerinin yaklaşık 1/3 ü Miyeloid GFP + hücreler vardır. Hücreleri enjeksiyon için hazır kadar buz üzerinde bırakın. 0.5 x 10⁵ hücreleri GFP ifade FACS⁹tarafından belirlemek için kullanın.

3. kemik iliği nakli Lys-GFP hücre içine RBPJKO fareler

1. Bir pasta kafeste alıcı fareler dizginlemek. Öldürücü dozda gama radyasyon ile fareler ışınlatayım (1.200 Rad) bir Cs 137 irradiator üzerinde. Bir bölünmüş doz protokolünü kullanan: 900 rad akşam takip tarafından 300 rad ertesi sabah (16 h dışında).
2. Öğrenirim radyoaktif RBPJWT ve RBPJKO alıcı fareler nakli 5-6 h sonra ikinci dozda radyasyon. BM enjekte hayvan ile kuyruk ven enjeksiyon (Bölüm 2 hücrelerinde hasat için detaylar See) başına 3 x 10⁶ hücre bir konsantrasyon, Lys-EGFP fareler gelen hasat hücreleri.
3. Görüntü farklı zaman noktalarda IVFM tarafından nakledilen farelerin bağımsız tabur: 24 h ve 2, 4 ve 6, açıklandığı gibi altı haftalıkken (4 ve 5 için yordam Imaging vivo içinde bölümüne bakın).

4. cerrahi hazırlık Intravital görüntüleme için

1. Cerrahi aletler sterilize. İki güzel forseps (bir düz, açılı bir tane), ince makas ve iğne sahipleri bir çift bir çift. Yordam için gerekli tüm malzemeleri ile operatif alan hazırlamak.
2. Fareyi bir IP iğne ketamin kokteyl anestezi (Xylazine 2.5-5 mg/kg + acepromazine 1.0-2.5 mg/kg + ketamin 90-100 mg/kg) 26-28 G iğne kullanarak.  Hayvan her 15 dk işlem sırasında izlenecek ve anestezi özgün doz ¼, gerektiği gibi takıma.
3. Fareyi bir uygun ısı kaynağı (37 ° C Isıtma yastığını, hayvan yastık Isıtma ile doğrudan temas korunuyorsunuz) yerleştirin ve görsel olarak solunum hızı izlemek.
4. Ayak parmağı kullanarak refleksleri yanıt çimdik kontrol edin. Hayvan tamamen herhangi bir cerrahi işlemler başlamadan önce anestezi altında olduğundan emin olun.
5. Kullanım bir 26-28 fareler bir kuyruk ven floresan vasküler işaretleyici (Dextran, 20 mg/mL solüsyon 100 μL) iğne için iğne şırınga ölçmek.
6. Veteriner göz merhem her iki gözde için geçerlidir. Hayvanın kafası dorsal yüzeyi küçük elektrik makasları ile küçük. Epilasyon 5 dk. kullanım gazlı bez sünger krem kaldırmak ve serum durulama için krem uygulayın. Temiz kafa derisi bir pamuklu çubukla kullanarak % 70 alkol ile hazırlayın.
7. Bir küçük deri Ensizyon (10-20 mm) yapmak için iyi forseps ve makas kafa derisi üzerinde temel dorsal kafatası yüzey göstermek için kullanın. 5-0 cerrahi ipek cilt kesi hasta görüntüleme için ortaya çıkarmak için bir flep oluşturma, her tarafında iki konaklama dikiş eklemenizi sağlar.
8. Fareler onların arkasına getirin ve mikroskop yağ dolu bir cam alt tabak içinde maruz kafa derisi daldırın. Oda Imaging mutiphoton için hayvan taşıma.
9. Hayvan hedefi yukarıda cam tabak üzerinde konumlandırılmış hasta ile mikroskop sahnesinde yerini ve 37 ile kapak° C Isıtma yastığını (hayvan gerekir korumalı gelen ısı ile doğrudan temas).

5. in Vivo fare hasta yüksek kararlılık düşsel

1. Ters bir confocal sistemi multiphoton görüntüleme için kullanın ( malzemeler tablobakın). Aşağıdaki prosedürü yerine getirin ayarlamak için 830 2-Foton lazer nm, yerime gel 20 X W, NA 0,95 objektif lens mikroskop temizler ve onay lazer ışını hizalama.
   Not: Dik mikroskop sistemleri en yaygın bu çalışmalar için kullanılır, ama ters bir multiphoton sistemi de kullanılan. Bu çalışmada, bir özel tasarlanmış Atravmatik stereotaksik cihaz kullanıldı. Birkaç ticari olarak mevcut stereotaksik aygıt dik mikroskop sistemler olmakla birlikte, piyasada bulunan hiçbir stereotaksik aygıtı için fare kafatası güvenliğini sağlama amaçlı bir ters mikroskop sistemi vardır. Alternatif olarak özel bir stereotaksik aygıt, kafatası istikrar için çeşitli bant veya yapıştırıcı yöntemler kullanan hedef konumda güvenli olabilir.
2. Bir görüntü alma yazılımını açın. "Satın alma ayarları" paneli kontrol edin tek yönlü tarama modunu seçtiyseniz. 4 μs/piksel, kare hızı 512 x 512 piksel için tarama hızını ayarlayın ve 1.5 için yakınlaştırma. 20 X W Na 0,95 amaç lenslerin kullanılabilir amaç yangın gövdeler içinde konumlandırılmış objektif eşleştirmek için listeden seçin.
3. "Görüntü edinme kontrol" panelinde erişim "Boya listesi" ve "İki foton" seçin. "Işık yolu & boya" penceresini açın ve DM690-980 uyarma DM. açık 2 P lazer çekim 2 lazer birimi onay kutusunu işaretleyerek seçin. "Mikroskop denetleyicisi" penceresinde RDM690 mirror seçeneini seçin.
4. "EPI lamba" seçin, B/G epi-filtre küp seçmek ve amaç vasküler akışı ve çatallanma Merkezi ven (a) ve (b) (şekil 2A) koroner dikiş referans olarak kullanarak hasta kemik iliği niş görselleştirmek için numune üzerine odaklanır.
5. Sigara descanned modu kullanarak görüntüleri toplamak. Üç harici dedektörleri seçin: kollajen SHG sinyal toplamak için Devresel_ödeme detector1 (emisyon filtre - 430/100 nm), GaAsP detector2 toplamak GFP sinyal (emisyon filtre - 525/50) ve TRITC-dextran sinyal toplamak için GaAsP detector3 (emisyon filtre - 605/90 nm).
   1. Görüntüleme yok fototoksisite en aza indirmek için ortalama ile 4μs/pixel inceden inceye gözden geçirmek oranında gerçekleştirmek. Görüntüleri değerinde bulmak en az doygunluk ile tam dinamik aralığını kullanmak için ayarlanmış sabit lazer güç ve Dedektör kazanç toplamak.
   2. Doku (60 x 1 mikron Z-yığınlar) derinliği aracılığıyla bölümleri dizi hasta kemik iliği 6 bölgelerden toplamak. 1 mikron, adım boyutu ayarlarını kullanın, 1.5 ve 512 x 512 piksel çerçeve boyutu (423 µm x 423 µm) zoom.
      Not: Genel olarak 1-1.5 saat toplam süre bir fare görüntü için gerekli olduğunu.

6. kantitatif analiz

1. Üreticinin talimatlarına göre özel 3D/4 D resim Nefelometri ve görselleştirme yazılımı kullanarak görüntü Nefelometri ve 3D rekonstrüksiyonlar gerçekleştirmek ( Malzeme tabloyabakın). Etkileşimli olarak Z yığınlarının maksimum yoğunluk projeksiyon (MIP) kullanan 3D Alfa-karıştırma veya gölge projeksiyon ses işleme algoritmaları gözünde canlandır.
2. GFP hücreleri kullanarak segment "nokta nesne bölümleme modülü". Yanlış pozitif sayısı (Bu sinyal güçlü floresan yeşil ve kırmızı kanalları görüntüleme kemik hücrelerinin ortadan kaldırır) GFP hücrelerinin ortadan kaldırmak için yığın aritmetik işlemi (kanal çıkarma) uygulama.
3. Segmentasyon damarlara ve kemik yüzeyi yüzey segmentlere ayırma modülünü kullanarak gerçekleştirin. Gerekirse, "mesafe yüzeye spot" denilen X-gerilim algoritmaları uygulayarak mesafeler hücre herhangi yukarıdaki yüzeylerin hesaplayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Tabur 2 RBPJKO ve 2 RBPJWT alıcıların farklı zaman noktalarda bir bireysel görüntüleme oturumda görüntüsü: 24 h ve 2, 4 ve 6 hafta sonra ( şekil 1A' iş akışı resimli) BM Lys-GFP hücre nakli.

Her fare görüntüleri Merkezi ven (şekil 2A, bir) ve koroner dikiş (şekil 2A, b) ile ilgili olarak bifurkasyon konumlarını tarafından tanımlanan BM...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı hematopoetik hücrelerin engraftment Kinetik çalışmaya Intravital floresan mikroskopi tarafından en iyi duruma getirilmiş bir deneysel tasarım açıklar. Bu çalışmada, myeloid progenitör hücre WT BM veya arızalı BM sinyal bir çentik genişlemesi kemik hasta aşağıdaki Lys-GFP olumlu Miyeloid hücreleri tarafından BMT sonra RBPJWT veya RBPJKO alıcı takip edildi. Bu yaklaşım için adresi benzer sorular, örneğin uygulanabilir bir model olarak önerilmiştir: Ben) genişleme ve di?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine cocktail	IU School of Medicine		Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextran	Tdb Consultancy	TD150-100mg	Other color dextran may be used.
Andis hair trimmer	Braintree Scientific	CLP-323 75
Gauze sponge	Med Vet International	PK224	4-ply, 2 x 2
Nair depilatory cream	Commercial store
Saline	Med Vet International	RXSAL-POD1LT	0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringe	Fisher Scientific	14-826-79	28 g, 1/2 cc
Fine Forceps	Fine Science Tools	00108-11, 00109-11	straight forcep, angled forcep
Scissor	Fine Science Tools	15018-10
Needle holder	Fine Science Tools	12002-14
5-0 silk suture	Fisher Scientific	MV-682	Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dish	WillCo	GWSt-5040
Optical microscope oil	Leica
Stereotaxic stage insert	IU School of Medicine	Custom design
Olympus FV1000 confocal microscope system	Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective	Olympus
Small heating pad	Commercial store		Zoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging software	Bitplane		3/4 D Image Visualization and Analysis software