骨髄ニッチに造血細胞の生着のダイナミクスを研究する遺伝的モデルと生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) を組み合わせること

要約

ホーミングや骨髄 (BM) のニッチに造血細胞の生着を研究する遺伝的動物モデルとの組み合わせで、calvarium の生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) が適用されます。

要約

増加する証拠は、その正常造血が特殊な細胞ニッチ重要な造血幹細胞 (HSC) 機能^1,2を調節することを含む、BM の個別のアイソレータケージ手がかりによって規制されてを示します。確かに、造血微小環境のより詳細な画像は今浮上して、骨と血管内皮のニッチが正常 HSC とその子孫^{3,4,5 の規制の機能ユニットを形成}.新しい研究は、血管周囲細胞、脂肪細胞、神経細胞の維持と HSC 機能^6,7、8を規制することの重要性を明らかにしました。さらに、異なる系統、すなわち骨髄性とリンパ性細胞、家から細胞、骨髄微小環境の内で特定のニッチに存在する証拠があります。しかし、BM 微小環境とその居住者の完全なマッピングは、まだ進行中です。

トランスジェニック マウス系統系統固有蛍光マーカーあるいは BM のニッチの特定のセルに選択した分子を欠いた遺伝子改変マウスの表現ができます。ノックアウトと系列移植アプローチとの組み合わせで、モデルを追跡、HSC などの定義済みの造血集団の固有の「ニッチ」の役割に関する知識を絞り込むこと細胞 B 細胞、T 細胞、骨髄細胞、赤芽球系細胞。この戦略は、マージ、calvarium の 2 光子顕微鏡を使用することによってさらに増強することができます。体内の高分解能イメージングと BM calvarium の 3d レンダリングを提供することにより造血の特定のサブセットが BM のホームし、時間をかけて彼らは拡張の動態を評価の場所正確に今判断できます。ここでは、Lys GFP トランスジェニック マウス (骨髄細胞マーキング)⁹と RBPJ (正規 Notch シグナルに欠けている) ノックアウト マウス¹⁰はノッチ欠陥 BM の微小環境に骨髄系細胞の生着を確認する IVFM との組み合わせで使用されます。

概要

生体多光子蛍光顕微鏡 (IVFM) は、高解像度、リアルタイム イメージングの深さを持つ組織の最大のことができる強力なイメージング技術によって組織の 1 mm。マウスの calvarium を適用すると、60-100 μ m¹¹を非侵襲的な方法で BM 内造血細胞の挙動を観察が許可されます。このアプローチは、正規 Notch シグナルに欠けている BM の RBPJ ノックアウト マウスで通常の骨髄前駆細胞の生着の動態を決定するここで使用です。

私達のグループからの最近の作品は、その欠陥正規 Notch シグナルのような骨髄増殖性疾患¹²BM 微小環境リードを示した。Notch シグナルの損失は、RBPJ、下流正規 Notch シグナル、組換え¹⁰を誘発 Mx1 Cre を使用しての重要な転写因子の DNA 結合ドメインの条件付き削除によって得られました。本研究では Mx1-Cre/RBPJ^lox/loxマウス モデルが使用されました。RBPJ の DNA 結合モチーフの条件付き削除すべてのノッチの受容体から信号の損失で起因します。式は複数の臓器の間質成分のだけでなく、血液細胞のターゲット遺伝子欠失の誘導の結果 polyI:C の管理時にアクティブ Mx1 プロモーターによる Cre Mx1 Cre モデルで BM、脾臓と肝臓を含みます。

Mx1-Cre⁺/RBPJ^lox/loxと Mx1 Cre^-/RBPJ^lox/loxマウス (ここに至って示される RBPJKO と RBPJWT、それぞれ) polyI:C による致死的照射し、正常な野生型造血細胞移植されました。移植後 4 週目から始まって、RBPJKO の受信者は脾腫に続いて重要な白血球を開発しました。RBPJKO マウスでは、移植後およびそれ以降の時点で BM の 8 週目骨髄前駆細胞の増加割合を提示、週 4 と 6 で BM の分析はコントロール RBPJWT と比較して、骨髄球系細胞内容に顕著な違いを明らかにしなかった受信者。この観測は、一緒に実際に Mx1 Cre が異なる造血臓器の単位があること提起した BM 微小環境骨髄増殖性の表現型の発生に直接的な影響を持っていたかどうか。

BM が病気の開発の重要な最初のサイトであるかどうかを判断するには、マウス calvarium の IVFM は BM の移植 (BMT)、RBPJ ノック アウト モデル系列のシステムを追跡との組み合わせで使用されました。特定リゾチーム プロモーター (Lys GFP)⁹の制御の下で EGFP を発現するトランスジェニック マウスを用いて BM BMT 後の画像の中に可視化することができるドナー細胞を入手します。リゾチーム発現は骨髄細胞に固有、Lys GFP が成熟した顆粒球¹³(CMP) 一般的な骨髄前駆細胞をマークします。

異なる時点で BM の IVFM を示した、Lys GFP の細胞同様に BM の RBPJWT と RBPJKO の受信者にホーム拡大や高速 RBPJKO BM 受信者の中にしみ込んでいます。この違い以前の時点 (2 週目) で劇的だったし、時間の経過とともに減少 (週 4 と 6)。しかし、これらの後の時点で PB で循環する骨髄細胞数の着実な増加を示した同じ受信者の造血のコンパートメントの評価、細胞の高められた出力を示す RBPJKO マウスの脾臓でローカライズ循環に BM。Lys GFP の細胞における局在の解析 BM 移植マウスの 6 週間では、骨髄細胞がコントロールにより RBPJKO 微小環境で血管系から遠い寝泊まりしていたことを明らかにしました。

総称して、これらの特定の動物モデルと IVFM の組み合わせは RBPJKO BM 微小環境における骨髄系細胞の生着の動力学の洞察力を提供されています。同じような質問に対処するため適用することができますパラダイムとして実験的なデザインとここで説明する定量的な手法を提案する.たとえば、RAG1 GFP¹⁴または¹⁵ Gata1 GFP マウスなどのモデルを追跡他のセルの特定の血統を使用する次のリンパの動作許可可能性がありますや赤芽球系前駆細胞、BM のそれぞれ。

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プロトコル

動物の使用を含むすべてのプロシージャを動物のケアおよび使用委員会のインディアナ大学医学部の承認を行った。行われる国の動物実験に関する法律を遵守することを確認します。

1. Mx1CreRBPJ^-/-受信者のマウスの作製

1. Mx1-Cre⁺ RBPJ^lox/loxマウス¹⁰ Mx1 Cre を取得するマウスをクロス正^RBPJlox/loxマウス¹²と Mx1 Cre 負 RBPJ^lox/lox同腹子コントロールとして使用します。PCR¹⁰遺伝子型を確認します。
2. 6-8 週を使用して-古い Mx1Cre⁺/RBPJ^lox/loxと Mx1Cre^-/RBPJ^lox/loxマウス polyI:C 誘導を実行します。
3. PolyI:C 200 μ g i. p. Cre⁺と Cre^-マウスでを挿入します。1 つの polyI:C 注入 3 日間最初の週の毎日を与えます。1 つの polyI:C 注入 7 日 (合計で 4 回の注射) の前の注入後第 2 週を与えます。
   1. RBPJKO を使用 (Mx1Cre を誘導⁺/RBPJ^{液体酸素/液体酸素}) と RBPJWT (Mx1Cre を誘導^-/RBPJ^{液体酸素/液体酸素}) 最後の polyI:C 注射後 3 週間の受信者としてマウス。
      注: 注射後 3 週間 pI: pC によるマウスを使用することをお勧めします。PolyI:C によって引き起こされるインターフェロン応答は HSC の肺浸潤拡大の結果、BM の重要な変化を誘導して末梢血^16,17に成熟した前駆細胞の出力を減少します。造血のサブセットの表現は、正規化された 3 週間後に炎症の交絡影響せず利用できる注入とマウスです。この誘導のプロトコルは、RBPJ のために最適化されています。異なる遺伝子の削除、誘導プロトコルは、構成によって異なる場合があります、削除を検証する必要があります。合計 4 つ polyI:C 注射後 RT-PCR による loxP サイト間 RBPJ 地域の ~ 100% 削除を検証しました。

2. Lys EGFP ドナー骨髄細胞の移植のための準備

1. 1 つの Lys EGFP マウス (頚部転位続いて二酸化炭素) を安楽死させる 1 または 2 の移植の前に h。
2. 70% エタノールで動物の体の表面をスプレーします。
3. 足首周りの両方の足で皮膚切開を行い、手術用鉗子を引いて離れて一緒にきれいな筋肉組織を公開する毛皮外科はさみを使用します。
4. 外科はさみを使用して、可能な限り足から同様に多くの筋肉を削除します。はさみを使用して、(膝・足関節の骨を切り取ってきれいに大腿骨と脛骨のガーゼを使用してから任意の残りの筋肉組織。DMEM に 10% を含む 6 ウェル プレートに (2 つの大腿骨および脛骨の 2 つ) の骨を置く政府短期証券。
5. ピペット 10 mL 冷たい 2 mM EDTA PBS とモルタルで噛み砕く骨髄細胞単一細胞懸濁液に細胞をさせる。また、1 mL 注射器で各側面から 2 mM EDTA PBS 3 回で骨をフラッシュします。
6. 骨髄細胞を 15 mL 遠心管に 70 μ m フィルターを使用してフィルターします。2-3 ml の PBS のフィルターをすすいでください。460 x g で 10 分間ダウン セルをスピン、10 %10 mL の新鮮な DMEM に細胞を再懸濁します FBS。
7. 診断に骨髄細胞をカウントし、1.5 倍の 10⁷セル/mL を IMDM の血清濃度を調整します。200 μ L のボリュームを持つ動物あたり 3 x 10 の⁶セルを使用します。合計 BM の約 1/3 セル骨髄性 GFP + セルです。注射の準備ができるまで、氷の上セルを残します。10⁵セル × 0.5 を使用して、FACS⁹GFP 発現を確認します。

3 RBPJKO マウスに Lys GFP 細胞骨髄移植

1. パイ ケージで受信者のマウスを抑制します。ガンマ放射の致命的な線量を持つマウスに照射 (1,200 Rad) Cs 137 照射に。分割投与プロトコルを使用: 夕方 900 ラドに続いて 300 ラド (離れて 16 h) 次の朝。
2. 致死的放射線照射した RBPJWT と RBPJKO の受信者マウス移植放射線の 2 回目投与後 5 〜 6 時間。BM を注入動物を介して尾静脈注射 (セクション 2 のセルを収穫の詳細を参照してください) あたり 3 x 10 の⁶セルの濃度リス EGFP マウスから採取した細胞。
3. 異なる時点での IVFM による移植マウスの独立したコホートのイメージ: 24 h のと週 2、4、6、前述の下で (4

4. 手術に備えて生体イメージング

1. 手術器具を滅菌します。2 本の細い鉗子 (1 つストレート、角度の 1 つ)、1 組の高級はさみとニードル ホルダーの 1 つのペア。手続きに必要なすべての供給で術野を準備します。
2. 麻酔薬ケタミン カクテルの IP 注入マウスを与える (キシラジン 2.5-5 mg/kg + アセプロマジン 1.0 〜 2.5 mg/kg + ケタミン 90-100 mg/kg) 26-28 G 針の注射器を使用して。 動物のプロシージャの間に 15 分毎が監視され、元の用量の 1/4 で必要に応じて麻酔薬、補われます。
3. 適切な熱源 (37 ° C 加熱パッド、パッドを加熱との直接接触から保護動物) の上にマウスを置くし、視覚的に呼吸数を監視します。
4. つま先を利用した反射がピンチの応答を確認します。確実に動物完全に麻酔、手術を開始する前に。
5. 使用 26 28 ゲージ与えるマウス蛍光血管マーカー (デキストラン、20 mg/mL の溶液 100 μ L) の尾静脈注射針注射器です。
6. 両方の目に獣医眼軟膏を適用されます。小さな電気バリカンで動物の頭の背側表面をクリップします。脱毛クリームを削除し、生理食塩水、すすぎを 5 分使用ガーゼ スポンジにクリームを適用します。綿棒を使用して 70% アルコールできれいな頭皮を準備します。
7. 微細鉗子、はさみを使用して小さな正中皮膚切開 (10-20 mm) を基になる背側頭骨表面を公開するのに頭皮に。5-0 外科シルクを使用すると、イメージングのため calvarium を公開するのにフラップを作成する、切開の各側に皮膚の縫合糸に宿泊 2 を配置します。
8. 自分の背中にマウスを置き、顕微鏡油で満たされたガラス底皿に露出した頭皮が水没します。多光子イメージング部屋に動物を輸送します。
9. 顕微鏡ステージ上目的上ガラス皿の上に配置 calvarium と動物を配置し、37 でカバーします° C 加熱パッド (動物は熱との直接接触から保護する必要があります)。

5 体内マウス Calvarium の高分解能イメージング。

1. 多光子イメージングの変更倒立共焦点システムを使用して (材料の表を参照してください)。次の製造元の指示調整 830 2 光子レーザー nm、20 の場所 X W、NA 0.95 顕微鏡鼻部分およびチェック レーザーのビーム配置の対物レンズ。
   注: 正立顕微鏡システムはこれらの研究でよく使用が、反転の多光子吸収システムも利用できます。本研究では、カスタム設計された非外科的脳定位固定装置が使用されました。正立顕微鏡システムのいくつかの市販脳定位固定装置が市販脳定位固定装置マウス頭蓋骨のセキュリティ保護を目的とした倒立顕微鏡システムはありません。カスタムの脳定位固定装置に別の方法として、上記の安定性のための様々 なテープや接着剤の手法を活用して目的位置に頭蓋骨を保護できます。
2. 画像集録ソフトウェアを開きます。「設定の取得」パネルは、1 方向スキャン モードを選択した場合確認してください。4 μ s/ピクセル、512 × 512 ピクセルにフレーム レートのためにスキャンの速度を設定し、1.5 にズームします。レボルバで配置されているレンズに合わせて利用可能な対物レンズのリストから 20 X W Na 0.95 目的を選択します。
3. 「画像取得制御」パネルから「色素リスト」にアクセスし、、「光子」を選択します。「光パス & 染料」ウィンドウを開き、レーザー ユニット 2 のチェック ボックスをチェックすることによって DM690 980 励起 DM 2 P レーザー シャッターの開きを選択します。「顕微鏡コント ローラー」ウィンドウで RDM690 のミラーをを選択します。
4. 「エピ ランプ」を B/G エピ フィルター キューブを選択選択して血流と中心静脈 (a) と (b) (図 2 a) 冠状縫合の分岐を参照として使用して、calvarium 骨髄ニッチを視覚化する試料の上に目的に焦点を当てます。
5. 非 descanned モードを使用して画像を収集します。外部検出器を選択: コラーゲンの SHG 信号を収集する PMT detector1 (排出フィルター - 430/100 nm)、収集の GFP 信号 (排出フィルター - 525/50) GaAsP detector2 と TRITC デキストランの信号を収集する GaAsP detector3 (排出フィルター - 605/90 nm)。
   1. 光毒性を最小限に抑えるための平均で 4μs/ピクセルのスキャン レートでイメージングを実行します。一定のレーザー パワーと検出器のゲインが最小限の飽和検出器のダイナミック レンジを活用する調整で画像を収集します。
   2. Calvarium 骨髄の 6 地域から一連の組織 (60 × 1 μ m Z スタック) の深さによってセクションを収集します。ズーム 1.5 と 512 × 512 ピクセルのフレーム サイズ (423 μ x 423 μ m)、1 μ m のステップ サイズ設定を使用します。
      注: 全体的に 1 つのマウスを画像に必要な合計時間は 1 〜 1.5 h です。

6. 定量解析

1. 製造元の指示に従って専用 3 D ・ 4 D 画像の定量化と可視化ソフトウェアを使用して画像の定量と 3 D 再構成を行う (表を参照)。対話的にアルファ ブレンドまたはシャドウ射影ボリューム レンダリング アルゴリズム最大強度投影法 (MIP) を利用した 3 D で Z スタックを視覚化します。
2. セグメントの GFP の細胞を使用して、"スポット オブジェクト分割モジュール"。(これは緑と赤のチャンネルで強い蛍光を表示する骨細胞の信号を排除) GFP の細胞数の偽肯定的な排除するスタック算術処理 (チャネル減算) を適用します。
3. 曲面の分割モジュールを使用して血管と骨の表面の分割を実行します。必要な場合は、「表面にスポットの距離」と呼ばれるエックス テンション アルゴリズムを適用して細胞上の表面のいずれかへの距離を計算します。

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結果

2 RBPJKO、2 RBPJWT 受信者のコホートを異なる時点で各撮像セッションでイメージしました: 24 h、2、(ワークフロー、図 1 aに示されている) BM Lys GFP の細胞移植後 4 〜 6 週間。

各マウスの画像に(図 2 a、)中心静脈と冠動脈縫合 (図 2 a、b) の分岐に関連して彼らの位置によって識...

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ディスカッション

このプロトコルでは、生体の蛍光顕微鏡による造血細胞移植の動力学を調査するように最適化実験デザインについて説明します。本研究では WT BM または欠陥のある BM をシグナリング ノッチ骨髄前駆細胞の拡張追跡された骨 calvarium で次 Lys GFP 陽性骨髄性細胞によって BMT 後 RBPJWT または RBPJKO の受信者に。たとえばアドレス同様の質問に適用できるモデルとしてこのアプローチが提案されて: ...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine cocktail	IU School of Medicine		Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextran	Tdb Consultancy	TD150-100mg	Other color dextran may be used.
Andis hair trimmer	Braintree Scientific	CLP-323 75
Gauze sponge	Med Vet International	PK224	4-ply, 2 x 2
Nair depilatory cream	Commercial store
Saline	Med Vet International	RXSAL-POD1LT	0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringe	Fisher Scientific	14-826-79	28 g, 1/2 cc
Fine Forceps	Fine Science Tools	00108-11, 00109-11	straight forcep, angled forcep
Scissor	Fine Science Tools	15018-10
Needle holder	Fine Science Tools	12002-14
5-0 silk suture	Fisher Scientific	MV-682	Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dish	WillCo	GWSt-5040
Optical microscope oil	Leica
Stereotaxic stage insert	IU School of Medicine	Custom design
Olympus FV1000 confocal microscope system	Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective	Olympus
Small heating pad	Commercial store		Zoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging software	Bitplane		3/4 D Image Visualization and Analysis software