JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الثقافات العصبية هي نموذج جيد لدراسة تقنيات تحفيز الدماغ الناشئة عن طريق تأثيرها على الخلايا العصبية واحدة أو عدد من الخلايا العصبية. تظهر هنا طرق مختلفة لتحفيز الثقافات العصبية منقوشة من حقل كهربائي تنتج مباشرة من أقطاب حمام أو التي يسببها المجال المغناطيسي متغير الوقت.

Abstract

وهناك الخلايا العصبية النار إمكانات العمل عندما تتجاوز إمكانات الغشاء عتبة معينة. في النشاط نموذجي من الدماغ، ويحدث هذا نتيجة المدخلات الكيميائية لنقاط الاشتباك العصبي في. ومع ذلك، الخلايا العصبية ويمكن أيضا أن ولع حقل كهربائي المفروضة. على وجه الخصوص، والتطبيقات السريرية الأخيرة تنشيط الخلايا العصبية عن طريق تهيئة المجال الكهربائي خارجيا. ولذلك من مصلحة لمعرفة كيف تستجيب الخلايا العصبية إلى الميدان الخارجي وما يتسبب في إمكانات العمل. لحسن الحظ، التطبيق الدقيق ورقابة من حقل كهربائي خارجي ممكن للخلايا العصبية الجنينية التي يتم رفعه، فصلها وتزرع في الثقافات. وهذا يسمح للتحقيق في هذه المسائل في نظام تكرار للغاية.

في هذه الورقة يتم مراجعة بعض التقنيات المستخدمة لتطبيق رقابة من الحقل الكهربائي الخارجي على الثقافات العصبية. يمكن للشبكات أن تكون إما واحدة الأبعاد، نمط أي في الخطأشكال ص أو سمحت أن ينمو على متن الطائرة كلها من الركيزة، وبالتالي ثنائية الأبعاد. وعلاوة على ذلك، فإن الإثارة يمكن أن تنشأ عن طريق التطبيق المباشر لحقل كهربائي عبر الأقطاب الكهربائية مغمورة في السائل (أقطاب حمام) أو عن طريق حفز الحقل الكهربائي باستخدام إنشاء البعيد من نبضات مغناطيسية.

Introduction

التفاعل بين الخلايا العصبية والمجالات الكهربائية الخارجية له آثار الأساسية فضلا عن تلك العملية. في حين أنه من المعروف منذ زمن فولتا أن الحقل الكهربائي تطبيقها خارجيا يمكن أن تثير الأنسجة، والآليات المسؤولة عن إنتاج إمكانات العمل الناتجة في الخلايا العصبية فقط تبدأ في الآونة الأخيرة إلى أن انحلت 1، 2، 3، 4. وهذا يشمل إيجاد أجوبة على أسئلة بخصوص الآلية التي تسبب الاستقطاب من غشاء المحتملة، ودور خصائص الغشاء ومن القنوات الأيونية، وحتى المنطقة في الخلايا العصبية التي تستجيب لمجال كهربائي 2 و 5. تحفيزا عصبيا 6، 7، 8، 9 العلاجية، 10 منهجيات تعتمد بشكل خاص على هذه المعلومات، التي يمكن أن تكون حاسمة لاستهداف المناطق المنكوبة ولفهم نتائج العلاج. ويمكن لهذا الفهم أن يساعد أيضا في تطوير بروتوكولات العلاج وأساليب جديدة لتحفيز مناطق مختلفة في الدماغ.

قياس التفاعل داخل الجسم الحي في الدماغ يضيف عنصرا هاما لهذا الفهم، ولكن يعوقها عدم الدقة والتحكم المنخفض للقياسات داخل الجمجمة. في المقابل، القياسات في الثقافات يمكن بسهولة أن يؤديها في ارتفاع حجم بدقة عالية، إشارة ممتازة لأداء الضوضاء ودرجة عالية من استنساخ والسيطرة. باستخدام الثقافات مجموعة كبيرة ومتنوعة من خصائص الخلايا العصبية من سلوك الشبكة الجماعي يمكن توضيحها 11، 12، 13، 14، 15 و 16. وبالمثل، يتوقع هذا النظام تسيطر عليها بشكل جيد للغاية أن تكون فعالة في توضيح الآلية التي تعمل وسائل التحفيز الأخرى، على سبيل المثال كيفية قناة الافتتاح خلال التحفيز البصري في الخلايا العصبية نشطة optogenetically 17 و 18 و 19 هو المسؤول عن خلق إمكانات العمل.

هنا يتم التركيز على وصف تطوير وفهم من الأدوات التي يمكن أن تثير كفاءة الخلايا العصبية عن طريق المجال الكهربائي الخارجي. في هذه الورقة وصفنا إعداد ثنائي الأبعاد والثقافات الحصين المزخرفة ذات بعد واحد، والتحفيز باستخدام أشكال مختلفة واتجاه الحقل الكهربائي تطبيقها مباشرة من قبل أقطاب حمام، وأخيرا تحفيز ثنائية الأبعاد ونقوش الثقافات ذات بعد واحد من قبل الحقل المغناطيسي، والذي يدفع حقل كهربائي زمنية متفاوتة5 ، 20 ، 21 .

Protocol

بيان األخالقيات: تم تنفيذ اإلجراءات التي تشمل التعامل مع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية) إاكوك (لمعهد وايزمان للعلوم، والقانون اإلسرائيلي المالئم. وقد تم اعتماد معهد وايزمن من قبل جمعية لتقييم واعتماد المختبر رعاية الحيوان الدولية (ألاك). وقد وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في فايزمان هذه الدراسة، التي أجريت مع الخلايا العصبية الحصين.

1. إعداد ثنائي الأبعاد (2D) وثنائية الأبعاد (1D) الثقافات الحصين

  1. إعداد كوفرسليبس للثقافات 2D.
    1. إعداد وسط الطلاء (بيإم) تتألف من: 0.9 مل الحد الأدنى من وسائل الإعلام الأساسية (ميم) + الجيل الثالث 3G، 0.05 مل مصل العجل الجنين (فس)، 0.05 مل الحرارة المصل الحصان المعطل (هاي هس) و 1 ميكرولتر من الملحق B27. ملاحظة: ميم + 3G يحتوي على كل 500 مل من ميم × 1، 1 مل من الجنتاميسين، 5 مل من مستقر L- الجلوتامين 100X (انظر جدول المواد / الكواشف) و 5 مل من 60٪ D - (+) - الجلوكوز.
    2. إعداد العازلة بورات تتألف من: 1.9 ز البوراكس (تيترابوريت الصوديوم ديكاهيدرات) في 200 مل مزدوج الماء المقطر (دو) (مزيج في 60 درجة مئوية) و 1.24 غ حمض البوريك في 200 مل دو. الحل النهائي المعايرة لدرجة الحموضة 8.5 باستخدام 1 M حمض الهيدروكلوريك. ملاحظة: الحل النهائي هو 400 مل 0.1 م بورات العازلة.
    3. تزج الزجاج كوفرسليبس في 65٪ حمض النتريك لمدة 2 ساعة. شطف ثلاث مرات في دو تليها ثلاثة يشطف مع كاشف التحليلي المطلق (عبس أر) الإيثانول.
    4. تمرير كل ساترة لفترة وجيزة من خلال لهب الموقد بنسن مرتين أو ثلاث مرات لمدة 1 - 2 ثانية، ومن ثم ترك لاحتضان بين عشية وضحاها في 24 لوحات جيدا مع 1 مل بولي L- يسين 0.01٪ محلول مخفف 1: 5 في العازلة بورات 0.1 م، ودرجة الحموضة 8.4). ثم شطف كوفرسليبس في دو ثلاث مرات وترك مع 1 مل بيإم لكل بئر في 37 درجة مئوية القياسية، 5٪ كو 2 حاضنة بين عشية وضحاها.
  2. إعداد كوفرسليبس ل 1 D الثقافات.
    1. تنظيف gcoverslips معشوقة عن طريق الغمر في محلول قاعدة سمكة البيرانا تتكون من 75 مل DDW، 25 مل 25٪ محلول الأمونيا و 25 مل 30٪ بيروكسيد الهيدروجين. مكان حل مع الزجاج coverslips على طبق من التدفئة في ~ 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم تجفيف coverslips الزجاج مع النيتروجين.
    2. coverslips معطف لأول مرة مع طبقة رقيقة من الكروم (99.999٪) من سماكة 6 Å تليها طبقة 30 Å من الذهب (99.999٪)، وذلك باستخدام إما بخار أو تفل ترسب.
      1. لتحقيق معدل الاخرق من ،05-1 A / S استخدام آلة الاخرق مع 2 الحزم الإلكترونية ونظام فراغ من 260 لتر / ثانية مع الهدف الأحجام 2 "و 4". استخدام مرحلة التناوب التي يمكن أن تذهب 0-100 طلقة في الدقيقة الواحدة (RPM). استخدام التيار المباشر (DC) تفل قوة 0-750 واتس.
      2. استخدام التناوب من 30 دورة في الدقيقة والأرجون 99.999٪ للحصول على البلازما في 10 ضغط mTorr في الغرفة.
      3. تشغيل إمدادات الطاقة من المدافع الاخرق في 40 W DC قوة تفل للالكروم، مما يؤدي إلى ~ 0.12 Å / ثانية معدل التغطية وفي 10 W DC تفل السلطة عن الذهب، مما يؤدي إلى ~ 0.28 Å / ثانية.
    3. حل 0.1 غرام 1-octadecanethiol في 100 مل ايثانول ABS AR باستخدام الموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة. وضع الكروم، الاتحاد الافريقي coverslips المغلفة لمدة 2 ساعة في هذا الحل، ثم تغسل مع AR الإيثانول ABS والجافة مع النيتروجين.
    4. يعد حل من 100 الفوسفات المالحة مل Dulbecco ومخزنة (D-PBS) و 3.5 غرام من ثلاثي كتلة البوليمر المشترك (انظر جدول المواد / الكواشف) من خلال التحريك لمدة 1-2 ساعات في 600-700 دورة في الدقيقة. ضع coverslips في حل لمدة 1 ساعة. coverslips الجافة مع النيتروجين.
    5. حفر ميكانيكيا النمط المطلوب من قبل خدش طبقة رفض الحيوي 22. القيام بذلك باستخدام راسمة القلم، حيث يتم استبدال القلم قبل إبرة الحفر. اخدش نمط من خلال طبقات معدنية للوصول إلى الزجاج الأساسي. التحكم في هذه العملية من خلال جهاز كمبيوتر لتحقيق نمط المطلوب تكرارها. أنماط تشكلها هذه العملية هي إظهار د في الشكل (2) والشكل (3).
    6. إعداد طبقة الحيوية متوافق من 100 مل D-PBS، 3.5 غرام ثلاثي كتلة البوليمر المشترك، 35.7 ميكرولتر / مل فبرونيكتين و 29 ميكرولتر / مل laminin.
      1. تعقيم coverslips في الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة على الأقل. احتضان coverslips في إعداد الحل بين عشية وضحاها الحيوية متوافق.
        ملاحظة: الطبقة الحيوية متوافق تشكل فقط حيث تم محفورا طبقة الرفض الحيوي قبالة في الخطوة السابقة.
      2. على غسل اليوم التالي coverslips مرتين مع P-DBS. احتضان coverslips في ليلة وضحاها PM. Coverslips هي الآن جاهزة للطلاء الخلية.
  3. أداء تشريح وفقا للإجراءات القياسية التي تم نشرها على نطاق واسع من قبل 23 و 24.
    1. في قصيرة، واستخراج الحصين أو قشرة من أجنة الفئران، وعادة في يوم E19، أو من الفئران، وعادة في يوم E17 23،كلاس = "كريف"> 24.
    2. فصل الخلايا أولا في حل غراء لمدة 20 - 30 دقيقة، تليها تريتشوراتيون الميكانيكية 24 مع ماصات الزجاج التي النصائح هي مصقول النار.
      ملاحظة: إذا كانت الخلايا تأتي من الفئران المعدلة وراثيا ثم الأنسجة من كل جنين ينبغي الحفاظ عليها في أنبوب بلاستيكي 1.5 مل منفصلة خلال العملية برمتها.
    3. عد الخلايا مع الأزرق التريبان قبل البذر.
      ملاحظة: بالنسبة للحيوانات المعدلة وراثيا العد ينبغي أن يتم بشكل منفصل لكل جنين.
    4. لثقافات 2D، والخلايا العصبية الماوس البذور في 750،000 والخلايا العصبية الفئران في 850،000 خلية لكل بئر. ل 1 D، البذور في 650،000 خلية لكل بئر. هزة لوحة قليلا مباشرة بعد البذر لضمان تغطية متجانسة ساترة.
  4. صيانة الثقافات العصبية.
    1. إعداد المتوسطة المتغيرة (سم) تتألف من (لكل مل): 0.9 مل ميم + 3G، 0.1 مل هاي هس، 10 ميكرولتر 5 فلورو -2'- ديوكسيوريدين (فودر) مع أوريدين 100X.
    2. إعداد المتوسطة النهائي (FM) تتكون من (لكل مليلتر): 0.9 مل MEM + 3G و 0.1 مل مرحبا HS.
    3. استبدال PM مع 1-1.5 مل CM بعد 4 أيام في المختبر (DIV). في 6 DIV، استبدال 50٪ من CM مع CM الطازجة. في DIV 8، تغيير المتوسط ​​إلى 1.5 مل FM، يعقبه تغيير 50٪ من FM كل يوم 2. بعد حوالي أسبوع واحد يظهر النشاط متزامن من تلقاء أنفسهم.
  5. التصوير من النشاط العفوي أو طرحه عام الثقافات العصبية مع الأصباغ الفلورية.
    1. يعد حل 50 ميكروغرام الكالسيوم صبغة الفلورسنت حساسة (انظر جدول المواد / الكواشف) في 50 ميكرولتر DMSO (سلفوكسيد ثنائي ميثيل).
    2. يعد حل تسجيل خارج الخلية (EM) تحتوي على (مم) 10 HEPES، 4 بوكل، 2 CaCl 2، 1 MgCl 2، 139 كلوريد الصوديوم، و 10 D-الجلوكوز، والسكروز 45 (7.4 درجة الحموضة).
    3. احتضان ثقافة العصبية في 2 مل EM مع 8 ميكرولتر من الكالسيوم حساسة حل صبغة الفلورسنت لمدة 1 ساعة. بعيدا عن الضوء وتناوب بلطف لضمان homogenانتشار الأوس من الصبغة إلى الخلايا.
    4. استبدال حل مع EM جديدة قبل التصوير. وأظهر التصوير فلوري في الشكل (4).
    5. الصورة في مضان المجهر مع المرشحات الضوئية للتصوير مضان الكالسيوم (ذروة الإثارة في 488 نانومتر، وذروة الانبعاثات في 520 نانومتر)، وذلك باستخدام كاميرا والبرامج القادرة على قياس كثافة من أي منطقة من الفائدة (ROI) ضمن مجال الرؤية من المجهر.

2. تحفيز كهربائي الثقافات

ملاحظة: يتم عرض الإعداد الأساسي لتحفيز كهربائي في الشكل 1. يتم وضع زلة تغطية على الذي قد نمت ثقافة العصبية لمدة 14 يوما في طبق بيتري تحت المجهر مضان. وتصوير النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية باستخدام الكالسيوم الأصباغ الحساسة في حين يتم تطبيق الجهد عن طريق اثنين من أزواج من أقطاب حمام أن يتم وضعه خارج الثقافة. هي التي تحرك الأقطاب بنسبةمولد ignal الذي يتم تضخيمه من قبل مكبر للصوت قناة الانتاج المزدوج. ويفضل السيطرة على الجهد للتحفيز على الرقابة الحالية أكثر القياسية 25 و 26 ليتم تحديد ناقلات الحقل الكهربائي مباشرة، وبالتالي تمكين واضحة بالإضافة ناقلات والجمع. هذا لا يتطلب الاختيار الدقيق للتوحيد الحقل الكهربائي، والتي يمكن أن يؤديها على عينة كاملة للقضية السيطرة على الجهد. متى يجب أن تؤخذ باستخدام الرعاية السيطرة على الجهد لتجنب أي حلقات الأرض، وينبغي التحقق منها تجانس الحقل الكهربائي (انظر 2.2 أدناه).

  1. لتحفيز كهربائي مع الحقل الكهربائي متجانسة استخدام زوج من الأسلاك الكهربائي موازية.
    1. استخدام أقطاب كهربائية مصنوعة من البلاتين مع سمك في حدود 0.005 '' (127 ميكرون). عندما تستخدم مع لل coverslips 13 ملم، تأكد من أن المسافة بين القطبين حوالي 11 ملم، ووضع القطبالصورة 1 مم فوق الثقافة.
      ملاحظة: لجعل حامل القطب (أرقام 5A و6A) استخدام تترافلوروإيثيلين (PTFE). حفر ثقوب ضيقة من خلال PTFE لإدراج الأقطاب. يجب أن يكون الجهاز أعلى من حل خارج الخلية بحيث الطرف العلوي، حيث يتعرض الأقطاب، لن يأتي في اتصال مع الحل. للعزل، استخدام الغراء الايبوكسي على أي جزء من يقود الكهربائي التي يمكن أن يتعرض لها.
    2. استخدام شكل نبض مربع مع دورة عمل 50٪، مع عدم وجود عنصر DC لتجنب التحليل الكهربائي. تختلف نبض مدة تتراوح بين 10 ميكرو ثانية و 4 مللي ثانية إلى يسبب التحفيز الفعال دون حرق الثقافة. تأكد من أن السعة هي في حدود ± 22 V (انظر الشكل 5). نبض مربع يمكن ملاحظتها على الذبذبات متصلة على التوازي لالأقطاب.
      ملاحظة: للحصول على برمجة سهلة في أي الموجي المطلوب، واستخدام برامج تحرير الموجي التجاري (انظر قائمة المواد ). أدخل رسوميا الموجي المطلوب وإرساله إلى مولد الموجي.
  2. لاختبار التجانس الميداني استخدام القطب التحقيق. استخدام شبكة لا يقل عن 1 مم × 1 مم للسماح للتحقيق في نقلها في المنطقة بين الأقطاب وقياس القدرة الكهربائية.
    1. قياس القدرات الكهربائية. استعمال figure-protocol-11210 لحساب المجال الكهربائي. استخدام واحد من الأقطاب كقطب مرجعي. قياس المجال الكهربائي مع فترات نبض متفاوتة بين 100 μs إلى 4 مللي ثانية (انظر الشكل 5B لمثال 100 μs مدة النبض) للتحقق من أن الحقل متجانسة ضمن مجموعة من فترات تحفيز.
      ملاحظة: انظر الشكل 5D لمثال تجانس المجال الكهربائي المقيس عندما كانت مدة النبضة 1 مللي ثانية.
  3. استخدام 2 أزواج عمودي من أقطاب حمام لإنتاج أكثر تعقيدا أشكال المجال الكهربائي، وإلىتكون قادرة على توجيه المجال في اتجاهات مختلفة (انظر الشكل 6B). الجهاز مع 2 أزواج من الأقطاب الكهربائية سيتم استخدامها، وسيتم لاحظ إشارة على كل زوج من الأقطاب الكهربائية على اثنين من الذبذبات منفصلة.
    1. ضع الأقطاب 1 مم فوق الثقافة وعلى مسافة من 10-11 ملم من بعضها البعض. تأكد من أن كلا الزوجين القطب تطفو (لا علاقة الأرض)، وليس لديهم أي أرضية مشتركة من خلال قياس المقاومة بين أي مجموعة من الأقطاب الكهربائية والتأكد من عدم وجود الدارات القصيرة بين أي من الأقطاب الكهربائية. التحقق من أن جميع المعدات المستخدمة، وهذا مرتبط إلى الأقطاب (مثل الذبذبات، ومكبرات الصوت، ومولدات إشارة، وما إلى ذلك) يعوم فيما يتعلق أرض الواقع من خلال التأكد من أن جميع المعدات يعوم وأن أيا من أقطاب المرجعية لمس أي معدات على الارض.
    2. لتغيير اتجاه المجال، تختلف السعة من الجهد لتغذية أزواج القطب مع اثنين من الدقةpect لبعضها البعض (انظر الشكل 7A). على سبيل المثال، ل0 درجة استخدام ± 22 V على الزوج الكهربائي التي هي عمودي على نمط و0 V لالقطب الآخر. 45 °، استخدم ± 15.6 V على كل زوج من الأقطاب الكهربائية مع عدم وجود مرحلة متخلفة، مقابل مبلغ ناقلات سعة 15.6 2 +15.6 2 = 22 2.
    3. لتطبيق حقل الدورية استخدام الموجي واحد من نبض الجهد شرط والموجي واحد من نبض جيب التمام الجهد لاثنين من أزواج من الأقطاب الكهربائية لإنتاج السعة ثابتة الدورية الحقل الكهربائي (انظر الشكل 6B).
      ملاحظة: كما يمكن أن ينظر إليها في الشكل 6B، عند استخدام دورة واحدة من موجة جيبية مع ± 22 V في القطب واحد ودورة واحدة من موجة جيب التمام مع ± 22 V في القطب الآخر، ومجموع ناقلات هو الحقل الكهربائي بالتناوب مع مدة دورة نفس الجيب وجيب التمام الموجات، ومع اتساع ± 22 V.
  4. لقياس وحساب كرونaxie وقرارة التيار من المحاور في ثقافة العصبية مقابل التشعبات في نفس الثقافة بتنفيذ الخطوات التالية.
    1. استخدام الكالسيوم صبغة الفلورسنت حساس للتصوير الكالسيوم كما هو موضح في جدول المواد / الكواشف وفي 1.5) مع ثقافة 1D على نمط رقيقة (170 ميكرون)، طويلة (10 مم) خطوط. سيتم تطبيق الكالسيوم صبغة حساسة للثقافة، وحضنت لمدة 45 دقيقة. سيتم غسل الصبغة عن طريق استبدال بمحلول تسجيل جديد.
    2. افصل الشبكة لتحقيق الإحصاءات السكانية للاستجابة مباشرة لالتحفيز الكهربائي، من دون تأثير من انتقال متشابك. للقيام بذلك، وتطبيق مجموعة من 40 ميكرومتر من bicuculline، الذي يمنع العمل المثبطة من أشعة غاما الغاما حمض-A (GABA A) المستقبلات، 10 ميكرومتر من 6 cyano-7-nitroquinoxaline-2،3-ديون (CNQX) ، لمنع α-الأمينية-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-isoxazolepropionic (أمبا) ومستقبلات kainate و 20 ميكرومتر (2R) -amino-5-phosphonovaleحمض ريك (APV)، الذي يمنع N-ميثيل-D اسبارتاتي (NMDA) مستقبلات. سيتم إضافة حاصرات إلى حل التسجيل.
    3. تطبيق نبض مربع كما هو موضح في 2.1 و 2.3 مع اختلاف فترات الزمنية بين 100 ميكرو ثانية و 4 مللي ثانية. إشارة يمكن ملاحظتها على الذبذبات.
    4. استخدام المجهر مضان مع برنامج الحصول على الصور (انظر 1.5) لمراقبة كثافة العابرين الكالسيوم في العديد رويس، تحتوي كل منها على بضعة مئات من الخلايا العصبية. الحصول على صور باستخدام كاميرا EMCCD الحساسة (انظر قائمة المواد)، قادرة على معدل الحصول على الصور لا يقل عن 20 لقطة في الثانية. التغير في شدة الضوء يتناسب مع كمية الخلايا العصبية التي تحفز. تقدير جزء من الخلايا العصبية حفز باستخدام التغير النسبي في كثافة.
    5. لكل مدة النبضة (100 ميكرو ثانية إلى 4 مللي ثانية)، وتغيير السعة من الجهد المطبق على الأقطاب بدءا من الجهد حيث يعتبر أي تغيير في كثافة (بضعة فولت)، إلى thالجهد ه حيث التغيرات في شدة بسبب الجهد التطبيقي والمشبعة (حتى ± 22 V).
      ملاحظة: سيتم توزيع تغير كثافة بوصفها جاوس 5 التراكمي فيما يتعلق الجهد التطبيقية لتحفيز لكل المدة الزمنية للنبض الجهد.
    6. تناسب توزيع جاوس التراكمي لشدة مقابل الجهد المطبق على كل مدة واستخراج المتوسط ​​الضبابي من هذا مناسبا.
      ملاحظة: هذا يعني هو الجهد التمثيلي التي وردت في الخلايا العصبية.
    7. في نهاية هذه العملية الحصول على كل مدة التحفيز وسيلة الجهد الذي استجابت الخلايا العصبية. استخدام هذه الأزواج من المدد والقوة لرسم منحنيات القوة المدة (انظر الشكل 7).

3. تحفيز المغناطيسي الثقافات

ملاحظة: يتم عرض الإعداد الأساسي لتحفيز المغناطيسي في الشكل 2. في أعلى اليمين هو مبينالمجهر مضان مقلوب التي تستخدم لالأصباغ الحساسة صورة الكالسيوم في الخلايا العصبية. لفائف المغناطيسي (الدوائر الزرقاء) يتم وضع حوالي 5 ملم بتكثف فوق ثقافة حلقة العصبية، (المخطط الأزرق). لفائف صغيرة (الدائرة الحمراء) على محيط طبق بيتري تراقب التيار الكهربائي الناجم عن النبض المغناطيسي. في أعلى يسار يظهر ديناميات قياس لفائف مشجعا المغناطيسي (MS) مع حمولة مكثف الجهد من 5000 كيلو فولت، كجزء لا يتجزأ من لفائف صغيرة. وصفت الحقل الكهربائي الناجم (يحسب لدائرة نصف قطرها حلقة من 14 ملم) باللون الأخضر في حين وصفت الحقل المغناطيسي للأرض في الزرقاء. في الجزء السفلي وتظهر الصور من ثقافة العصبية. في الجزء السفلي الأيسر هو صورة حقل مشرق من منقوشة ساترة 24 ملم. المناطق البيضاء هي الخلايا العصبية. ويتكون نمط تصويرها الثقافات حلقة متحدة المركز مع أنصاف أقطار مختلفة. في أسفل اليمين هو التكبير على قطعة قصيرة من الحلقات، والتي تبين الخلايا العصبية الفردية. لنطاق، دور المرأة في التنمية حلقات "عشر حوالي 200 ميكرون.

  1. تنمو الخلايا العصبية في نمط حلقة دائرية (محفورا كما هو موضح في 1.2.5) لتحفيز ثقافة 1D. استخدام الكالسيوم صبغة الفلورسنت حساس للتصوير الكالسيوم (كما هو موضح في القسم 1.5) مع ثقافة 1D على نمط رقيقة (170 ميكرون)، طويلة (10 مم) خطوط.
    1. استخدام لفائف مغناطيسية دائرية ووضع طبق بتري حوالي 5 ملم أدناه ومتحدة مع الملف. استخدام لفائف عادة ما يقرب من 30 ملم (القطر الداخلي، وقطره الخارجي 46 ملم) لفائف مع الحث من L = 90 MH يقودها MS محلية الصنع أو تجارية محملة الجهد القصوى من 5 كيلو فولت.
    2. تصريف الجهد العالي والحالي من خلال لفائف إجراء باستخدام مفتاح عالية الحالية عالية الجهد لتحفيز مغناطيسيا الثقافات العصبية. منشط المغناطيسي (MS) يمكن أن يبنى كما هو موضح في 21 باستخدام المكثفات الكبيرة، بناء على أمر من 100 MF، للحصول على الجهد العالي من 1-5 كيلو فولت. بدلا من ذلك استخدام تجاريامتاح مس (انظر جدول المواد / الكواشف ).
      ملاحظة: استخدام الأسلاك النحاسية المستطيلة البوليستر المغلفة بسمك 0.254 مم و 6.35 مم لتفريق لفائف محلية الصنع 21 . تحويل الأسلاك على إطارات حسب الطلب، معزول مع الألياف الزجاجية ويلقي في الايبوكسي (انظر جدول المواد / الكواشف ). بدلا من ذلك استخدام لفائف المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد / الكواشف ).
  2. استخدام الدوارة المجالات المغناطيسية لتحفيز الثقافات 2D.
  3. الآن، استخدم المجالات المغناطيسية الدورية لتحفيز الثقافات 2D. النار تمس مع عدم وجود ثقافة في الطبق، في شدة مختلفة، لإظهار الارتباط الخطي للقراءة لفائف مع شدة.
  4. المقبل، في حين تسجيل العابرين الكالسيوم مع ثقافة الخلايا العصبية، بدء اطلاق تمس في زيادة كثافة أثناء تسجيل كل من العابرين الكالسيوم والملف. في البداية، لاحظت رشقات شبكة كما العابرين الكالسيوم كبيرة، شويونيتبول لا يتزامن مع التقاط المسامير لفائف TMS. الاستمرار في زيادة كثافة، في مرحلة ما، يبدأ العابرين الكالسيوم لتصبح متزامنة مع ارتفاع TMS. بدلا من ذلك، أو بالإضافة، بعد تحقيق استجابة متزامنة، تبدأ خفض شدة حتى يتم إلغاء التزامن، لتحديد عتبة TMS.
    ملاحظة: يجب أن تكون شروط الحفاظ ثابتة بدقة لكل من الاجهزة، وذلك باستخدام حجم المحدد في كل مرة، ونفس السفن ومواقف لفائف الدقيق والتوجهات.
    1. جبل لفائف صغيرة على قاعدة الطبق تسجيل بحيث يكون في طائرة وبالتوازي مع ثقافة العصبية وفي وضع ثابت فيما يتعلق الثقافة.
      ملاحظة: هذا يضمن أن اعتماد المواقع من لفائف صغيرة فيما يتعلق المغناطيس هو وفيا لموقف الثقافة وأن أي تباينات في تحديد المواقع ستكون يذكر على قراءات بيك اب لفائف.
      1. استخدام ملفين المستقلة التي هيوضع عمودي على بعضها البعض (الشكل 8B) لإنشاء الدورية المجال الكهربائي المغناطيسي والتي يسببها. ربط كل ملف إلى MS الخاصة. تأكد من أن التحفيز والتشجيع تصريف تيارات مماثلة في تأخر مرحلة 90 درجة (الشكل 10A)، مما أدى إلى الحقل المغناطيسي بالتناوب الذي يمسح 270 درجة من الفضاء الحقيقي في حقل الحد الأقصى ل~ 270 V / م (الشكل 10B).
      2. ضع ثقافة العصبية داخل وعاء زجاجي كروية مليئة حل تسجيل خارجي (EM).
      3. مراقبة التحفيز (التغير في كثافة مضان من الخلايا العصبية) مع الكاميرا كما هو موضح في الخطوة 2.4.4.
      4. في حالة لفائف عبر (الشكل 8B)، ضع بالتوازي بيك اب لفائف وعلى مسافة محددة دون ثقافة العصبية. بعناية الحفاظ على هذا التكوين في جميع أنحاء التجارب.
  5. حساب تحليلي الحقل الكهربائي لconfigura 1D( E ماكس = k 1 بر) حيث E ماكس هو السعة القصوى للمجال الكهربائي المستحث، ويتم توجيهه على طول المماس للحلقات ذات نصف القطر r . B هو اتساع نبض المغناطيسي و ك 1 هو ثابت التناسب الأبعاد التي يمكن قياسها باستخدام لفائف صغيرة ( الشكل 8A ).
  6. استخدام حزمة المحاكاة العددية (انظر قائمة المواد) لمحاكاة العددي المجال الكهربائي 21 .

النتائج

بروتوكول المعروضة يسمح للالزخرفة سهلة من الثقافات العصبية. عندما يتم دمجها مع العديد من الطرق التي قمنا بتطويرها لتحفيز، فإنه تمكن من إجراء قياسات بعض خصائص الخلايا العصبية الذاتية مثل الزمنة وقرارة التيار 5، مقارنة خصائص الخلايا ?...

Discussion

1D الزخرفة هو أداة هامة التي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات. على سبيل المثال، استخدمنا 1D الزخرفة لخلق بوابات منطقية من الثقافات العصبية 29 ومؤخرا لقياس كروناكسي و ريوباس من الخلايا العصبية قرن آمون الفئران 5 ، وتباطؤ سرعة انتشار إ...

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

الكتاب أشكر أوفر فينرمان، فريد ولف، مناحيم سيغال، أندرياس نيف وإيتان ريوفيني لإجراء مناقشات مفيدة جدا. الكتاب أشكر إيلان بريسكين وجوردي سوريانو لتطوير الإصدارات القديمة من هذه التكنولوجيا. الكتاب أشكر تسفي تلوستي وجان بيير إيكمان للمساعدة في المفاهيم النظرية. وأيد هذا البحث من قبل مؤسسة منيرفا، وزارة العلوم والتكنولوجيا، وإسرائيل، ومنحة مؤسسة العلوم اسرائيل 1320-1309 ومنحة مؤسسة ثنائية القومية للعلوم 2008331.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
APVSigma-AldrichA8054Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 suppGibco17504-044Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicucullineSigma-Aldrich14343Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate)Sigma-AldrichS9640Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acidFrutarom LTD5550710Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1 MFluka 21098Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
CNQXSigma-AldrichC239Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
COMSOLCOMSOL IncMultiphysics 3.5Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1 MSigma-Aldrich65146Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2
D-PBSSigma-AldrichD8537Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
FCS (FBS)Gibco12657-029Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
FibronectinSigma-AldrichF1141Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4AMLife technologiesF14201Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5
FUDRSigma-AldrichF0503Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
GentamycinSigma-AldrichG1272Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100xGibco35050-038Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1 MSigma-AldrichH0887Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
HI HSBI04-124-1APlating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2
KCl,  3 MMerck1049361000Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin Sigma-AldrichL2020Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1Gibco21090-022Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1 MSigma-AldrichM1028Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4 MBio-Lab19030591Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
OctadecanethiolSigma-Aldrich01858Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF PrillBASF Corparation 50475278Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution Sigma-Aldrich P47075Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1 MSigma-AldrichS1888Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Thiol Sigma-Aldrich1858Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINESigma-AldrichU3750Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machineAJA International, IncATC Orion-5Series coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter Hewlett Packard HP 7475AEtching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires A-M Systems, Carlsborg WA767000Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5
Signal generatorBKPrecision4079Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
AmplifierHomemadeVoltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supplyMatrix MPS-3005 LK-3 Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulationMagstim, Spring Gardens, UKRapid 2Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4
EpoxyCognisVersamid 140Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
EpoxyShellEPON 815 Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,  Carlsborg WA 767000Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coilHomemadeMagnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SWB&K Precision Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897AndorSensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4

References

  1. Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
  2. Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
  3. Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
  4. Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
  5. Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577 (2015).
  6. Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
  7. Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
  8. Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, S44-S53 (2009).
  9. Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
  10. Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
  11. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
  12. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
  13. Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
  14. Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
  15. Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
  16. Soriano, J., Rodriguez Martinez, ., Tlusty, M., T, E., Moses, Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
  17. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  18. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  19. Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287 (2013).
  20. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
  21. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
  22. Feinerman, O., Moses, E. A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
  23. Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
  24. Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
  25. Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
  26. Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
  27. Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
  28. Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794 (2014).
  29. Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
  30. Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
  31. Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
  32. Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
  33. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
  34. Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680 (2015).
  35. Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

123

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved