Externe Anregung von Neuronen mittels elektrische und magnetische Felder in One- und Zweidimensionale Kulturen

Zusammenfassung

Neuronale Kulturen sind ein gutes Modell für die Untersuchung Schwellen Hirnstimulation Techniken über ihre Wirkung auf die einzelnen Neuronen oder einer Population von Neuronen. Dargestellt hier sind verschiedene Verfahren zur Stimulation von gemusterten neuronalen Kulturen durch ein elektrisches Feld erzeugt wird direkt durch Badelektroden oder induziert durch ein zeitlich veränderliches Magnetfeld.

Zusammenfassung

Ein Neuron wird ein Aktionspotential ausgelöst, wenn dessen Membranpotential einen bestimmten Schwellenwert überschreitet. In typischer Aktivität des Gehirns, tritt dies als Ergebnis chemischer Eingänge seine Synapsen. Allerdings Neuronen können auch durch ein auferlegtes elektrisches Feld angeregt werden. Insbesondere aktivieren bisherige klinische Anwendungen Neuronen, die durch ein elektrisches Feld von außen zu schaffen. Es ist daher von Interesse, zu untersuchen, wie das Neuron zum äußeren Feld reagiert und was bewirkt, dass das Aktionspotential. Glücklicherweise ist eine präzise und kontrollierte Anwendung eines externen elektrischen Feldes möglich ist, für die embryonale neuronale Zellen, die herausgeschnitten werden, dissoziiert und in Kulturen gezüchtet. Dies ermöglicht die Untersuchung dieser Fragen in hochreproduzierbarer System.

In diesem Papier einige der Techniken für die kontrollierte Anwendung von externem elektrischem Feld auf neuronalen Kulturen verwendet werden, überprüft. Die Netzwerke können entweder eindimensional sein, dh in linea gemustertr Formen oder auf der gesamten Ebene des Substrats wachsen gelassen, und somit zweidimensional. Darüber hinaus kann die Anregung durch das direkte Anlegen des elektrischen Feldes über die Elektroden in dem Fluid (Badelektroden) oder durch Induzieren des elektrischen Felds unter Verwendung der Fern Schaffung magnetischer Impulse erzeugt wird eingetaucht.

Einleitung

Die Wechselwirkung zwischen Neuronen und externen elektrischen Feldern hat sowohl grundlegende Implikationen als auch praktische. Während es seit den Zeiten von Volta bekannt ist, dass ein extern angelegtes elektrisches Feld Gewebe anregen kann, sind die Mechanismen, die für die Produktion eines resultierenden Aktionspotentials in Neuronen verantwortlich sind, erst vor kurzem aufgefangen ^{1 , 2 , 3 , 4} . Hierbei handelt es sich um Antworten auf Fragen, die den Mechanismus betreffen, der die Depolarisation des Membranpotentials, die Rolle der Membraneigenschaften und der Ionenkanäle und sogar die Region im Neuron, die auf das elektrische Feld ^{2 , 5} reagiert, verursacht. Therapeutische Neurostimulation ^{6 , 7 , 8 , 9 ,} 10 Methoden sind besonders abhängig von diesen Informationen, die für die Ausrichtung der betroffenen Gebiete von entscheidenden Bedeutung sein kann und das Ergebnis der Therapie für das Verständnis. Ein solches Verständnis kann auch helfen, Behandlungsprotokolle und neue Ansätze zur Stimulation verschiedenen Bereiche im Gehirn zu entwickeln.

Messen der Wechselwirkung innerhalb des in - vivo - Gehirns fügt eine wichtige Komponente dieses Verständnisses, sondern wird durch die Ungenauigkeit und niedrige Steuerbarkeit der Messungen innerhalb des Schädels behindert. Im Gegensatz dazu können die Messungen in den Kulturen mit hohen Präzision leicht, exzellenten Signal-Rausch-Leistung und einem hohen Grad an Reproduzierbarkeit und der Kontrolle in hohem Volumen durchgeführt werden. Mit Kulturen eine große Vielfalt von neuronalen Eigenschaften des kollektiven Verhalten des Netzwerks können ¹¹ aufgeklärt ^{werden, 12, 13, 14, 15, 16.} In ähnlicher Weise ist dies gut kontrolliert werden , um hocheffiziente System erwartet , dass der Mechanismus in Aufklären , durch die anderen Stimulationsverfahren arbeiten, wie zum Beispiel Kanalöffnung während der optischen Stimulation in optogenetically aktiven Neuronen ^{17, 18, 19} ist verantwortlich für die Erstellung von Aktionspotential.

Hier liegt der Schwerpunkt auf der Beschreibung der Entwicklung und das Verständnis von Werkzeugen, die effizient das Neuron über ein externes elektrisches Feld anregen kann. In diesem Papier beschreiben wir die Herstellung von zweidimensionaler und eindimensionalen gemusterten hippocampalen Kulturen, Stimulation verschiedene Konfigurationen und Orientierung eines direkt angelegten elektrischen Feld von Badelektroden verwenden und schließlich Stimulation von zweidimensionalen und bemustert eindimensionalen Kulturen nach a zeitlich veränderliches Magnetfeld, das ein elektrisches Feld induziert,^{5, 20, 21.}

Protokoll

Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierische Handhabung wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) des Weizmann Institute of Science und dem entsprechenden israelischen Rechts getan. Das Weizmann Institut wird von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) akkreditiert. Das Weiz Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt diese Studie mit Hippocampus-Neuronen durchgeführt.

1. Herstellung von zweidimensionalen (2D) und eindimensional (1D) Hippocampal Cultures

1. Herstellung von Deck für 2D-Kulturen.
   1. Bereiten Plattierungsmedium (PM), bestehend aus: 0,9 ml Minimum Essential Medium (MEM) + 3G, 0,05 ml fötalen Kälberserum (FCS), 0,05 ml hitzeinaktiviertem Pferdeserum (HS HALLO) und 1 ul B27 Ergänzung. Hinweis: MEM + 3G enthält für jede 500 ml MEM x 1, 1 ml Gentamycin, 5 ml stabilisiert L-Glutamin 100x (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien) und 5 ml 60% D - (+) - Glukose.
   2. Bereiten Boratpuffer, bestehend aus: 1,9 g Borax (Natriumtetraboratdecahydrat) in 200 ml doppelt destilliertem Wasser (DDW) (bei 60 ° C mischte) und 1,24 g Borsäure in 200 ml DDW. Titrieren Endlösung auf pH 8,5 unter Verwendung von 1 M HCl. Anmerkung: Die Endlösung ist 400 ml 0,1 M Boratpuffer.
   3. Tauchen Deckgläser in 65% iger Salpetersäure 2 Stunden. Spülen dreimal in DDW, gefolgt von drei Spülungen mit absolutem analytischem Reagens (ABS AR) ethanol.
   4. Übergeben jedes Deckglas kurz durch die Flamme eines Bunsenbrenners zwei- oder dreimal mit 1 - 2 s, und verlassen dann über Nacht in 24-Well-Platten mit 1 ml Poly-L-Lysin 0,01% ige Lösung inkubieren, verdünnt 1: 5 in Boratpuffer ( 0,1 M, pH 8,4). Dann spülen Deckgläser in DDW dreimal und läßt mit 1 ml PM pro Vertiefung in einem Standard - 37 ° C, 5% CO ₂ über Nacht Inkubator.
2. Herstellung von Deck für 1D-Kulturen.
   1. saubere glass Deckgläser durch Eintauchen in eine Lösung, bestehend aus Basis Piranha 75 ml DDW wurden 25 ml 25% ige Ammoniaklösung und 25 ml 30% iges Wasserstoffperoxid. Ort Lösung mit den Deckgläsern aus Glas auf einer Heizplatte bei ~ 50 ° C für 30 min und dann trocknen die Deckgläser mit Stickstoff.
   2. Coat Deck zunächst mit einem dünnen Chromfilm (99,999%) 6 mit einer Dicke, gefolgt von einer 30-Å-Schicht aus Gold (99,999%), unter Verwendung von entweder Dampf oder Sputter-Abscheidung.
      1. Um eine Sputter-Rate von 0,05 zu erreichen - 1 Å / s eine Sputter-Maschine mit 2 E-Strahlen verwenden, und ein Vakuumsystem von 260 l / s mit den Zielgrößen 2" und 4" . Verwenden Sie eine Rotationsstufe, die von 0 gehen kann - 100 Umdrehungen pro Minute (RPM). Verwenden Sie einen Gleichstrom (DC) Sputter-Leistung von 0-750 Watt.
      2. Verwenden, um eine Rotation von 30 Umdrehungen pro Minute und Argon von 99,999% Plasma bei 10 mTorr Druck in der Kammer zu erhalten.
      3. Betreiben Sie die Stromversorgung der Sputter-Kanonen bei 40 W DC-Sputter-Leistung für das Chrom, was zu ~ 0,12 Å / s Deckungsrate und bei 10 W DC Sputter-Leistung für das Gold, was zu ~ 0,28 Å / s.
   3. Man löst 0,1 g 1-Octadecanthiol in 100 ml Ethanol ABS AR für 30 min unter Verwendung von Ultraschall. Platzieren Cr-Au-beschichtete Deckgläser für 2 h bei dieser Lösung, dann waschen mit Ethanol ABS AR und mit Stickstoff trocken.
   4. Es wird eine Lösung von 100 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) und 3,5 g einem Tri-Block - Co-Polymer (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien) durch Rühren für 1 bis 2 h bei 600 bis 700 Umdrehungen pro Minute. Legen Sie Deckgläser in der Lösung für 1 h. Dry Deck mit Stickstoff.
   5. Mechanisch ätzt das gewünschte Muster durch die bio-Abstoßungsschicht ²² zu verkratzen. Tun Sie dies mit einem Stift Plotter, wo der Stift durch eine Ätz-Nadel ersetzt wird. Zerkratzen das Muster durch den Metallschichten die darunter liegende Glas zu erreichen. Steuert diesen Prozess durch einen Computer ein replizierte gewünschten Muster zu erzielen. Muster, die durch dieses Verfahren gebildet sind, zeigen, d in Abbildung 2 und Abbildung 3.
   6. Vorbereiten einer biokompatiblen Schicht aus 100 ml D-PBS, 3,5 g Tri-Block-Copolymer, 35,7 & mgr; l / ml Fibronektin und 29 & mgr; l / mL Laminin.
      1. Sterilisieren Deckgläser in ultraviolettem Licht für mindestens 10 min. Inkubieren Deckgläser in der hergestellten biokompatible Lösung über Nacht.
         HINWEIS: Die biokompatible Schicht wird nur bilden, wenn die Bio-Abstoßungsschicht im vorherigen Schritt weggeätzt wurde.
      2. Am nächsten Tag waschen Deckgläser zweimal mit P-DBS. über Nacht inkubieren Deckgläser in PM. Die Deckgläser sind nun bereit für Zellplattierung.
3. Führen Sie Dissektion nach Standardverfahren , die ausführlich zuvor ^{23, 24} veröffentlicht wurden.
   1. Kurz gesagt, Extrakt Hippocampus oder Cortex von Rattenembryonen, in der Regel am Tag E19, oder von Mäusen, in der Regel am Tag E17 ^23,Class = "xref"> 24.
   2. Dissoziieren Sie die Zellen zuerst in der Papain-Lösung für 20 - 30 min, gefolgt von der mechanischen Verreibung ²⁴ mit Glaspipetten, deren Spitzen feuerpoliert sind.
      HINWEIS: Wenn die Zellen aus genetisch veränderten Mäusen kommen, dann sollte das Gewebe von jedem Embryo in einem separaten 1,5 ml Plastikschlauch während des gesamten Prozesses gehalten werden.
   3. Zähle Zellen mit Trypanblau vor dem Aussaat.
      HINWEIS: Bei genetisch veränderten Tieren sollte die Zählung für jeden Embryo separat erfolgen.
   4. Für 2D-Kulturen, Seed-Maus-Neuronen bei 750.000 und Ratten-Neuronen bei 850.000 Zellen pro Brunnen. Für 1D, Saatgut bei 650.000 Zellen pro Brunnen. Schütteln Sie die Platte leicht nach dem Aussaat, um eine homogene Abdeckung des Deckglases zu gewährleisten.
4. Pflege der neuronalen Kulturen.
   1. Vorbereitung des Wechselmediums (CM) aus (pro ml): 0,9 ml MEM + 3G, 0,1 ml HI HS, 10 μl 5-Fluor-2'-desoxyuridin (FUDR) mit Uridin 100x/ Li>
   2. Bereiten Endmedium (FM), bestehend aus (pro ml): 0,9 ml MEM + 3G und 0,1 ml HALLO HS.
   3. Ersetzen PM mit 1-1.5 ml CM nach 4 Tagen in vitro (DIV). Bei 6 DIV, ersetzen 50% des CM mit frischem CM. Bei DIV 8 Ändern des Mediums auf 1,5 ml FM, gefolgt von einer 50% igen Änderung der FM alle 2 Tage. Nach etwa einer Woche spontan synchrone Aktivität entsteht.
5. Imaging spontaner oder evozierten Aktivität in neuronalen Kulturen mit Fluoreszenzfarbstoffen.
   1. Bereiten eine Lösung von 50 & mgr; g calciumempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien) in 50 & mgr; l DMSO (Dimethylsulfoxid).
   2. Bereiten extrazelluläre Aufzeichnungslösung (EM) , die (in mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl _2, 1 MgCl _2, 139 NaCl, 10 D-Glucose, 45 Sucrose (pH 7,4).
   3. neuronal Kultur in 2 ml EM Inkubieren mit 8 & mgr; l der calciumempfindlichen Fluoreszenzfarbstofflösung für 1 h. Vor Licht und sanft drehen homogen, um sicherzustellen,ous Ausbreitung des Farbstoffs an die Zellen.
   4. Ersetzen Lösung mit frischer EM vor der Bildgebung. Die Fluoreszenz - Bildgebung ist in 4 gezeigt.
   5. Bild in einem Fluoreszenzmikroskop mit einem optischen Filter für Calcium Fluoreszenzbildgebung (Anregungspeak bei 488 nm, Emissionspeak bei 520 nm) unter Verwendung einer Kamera und Software, die die Quantifizierung der Intensität jeder Region von Interesse (ROI) im Gesichtsfeld des das Mikroskop.

2. Elektrische Stimulation der Kulturen

HINWEIS: Der Grundaufbau für Elektrostimulation ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein Deckglas, auf dem das neuronale Kultur wurde für etwa 14 Tage lang wachsen gelassen worden ist, in einer Petrischale unter einem Fluoreszenzmikroskop gelegt. Elektrische Aktivität der Neuronen abgebildet wird unter Verwendung von Calcium-sensitiven Farbstoffen während eine Spannung über zwei Paare von Badelektroden aufgebracht wird, die außerhalb der Kultur positioniert sind. Die Elektroden werden angetrieben, indem sie alsignal Generator, dessen Ausgang durch einen Zweikanalverstärker verstärkt. Spannungsregelung für die Stimulation wird über die weiteren Standard - Stromsteuer bevorzugt ^{25, 26} , da die elektrischen Feldvektoren direkt bestimmt werden, so dass einfache Vektoraddition und Kombination ermöglicht. Dies erfordert eine sorgfältige Prüfung der Gleichförmigkeit des elektrischen Feldes, das über die gesamte Probe für den Fall einer Spannungssteuerung durchgeführt werden kann. Wann sollte mit Spannungssteuer Pflege keine Masseschleifen und die Homogenität des elektrischen Feldes zu vermeiden genommen werden sollte überprüft werden (siehe unten 2.2).

1. Für elektrische Stimulation mit einem homogenen elektrischen Feld ein Paar paralleler Elektrodendrähte verwenden.
   1. Verwenden Elektroden aus Platin mit einer Dicke in der Größenordnung von 0,005 ‚‘ (127 & mgr; m). In Verbindung mit den 13 mm Deckgläsern verwendet, sicherzustellen, dass der Abstand zwischen den beiden Elektroden etwa 11 mm, und die Elektrodenpositions 1 mm über der Kultur.
      ANMERKUNG: Um den Elektrodenhalter (5A und 6A) verwenden , Polytetrafluorethylen (PTFE). Bohrt schmale Löcher durch das PTFE der Elektroden einzusetzen. Das Gerät sollte höher sein als die extrazelluläre Lösung sein, so dass das obere Ende, wo die Elektroden ausgesetzt sind, wird nie mit der Lösung in Kontakt kommen. Zur Isolierung verwenden Epoxidkleber auf jedem Teil der Elektrodenleitungen, die freigelegt werden könnten.
   2. Verwenden Sie ein Rechteckimpulsform mit einem Tastverhältnis von 50%, ohne Gleichstromkomponente der Elektrolyse zu vermeiden. Variieren Pulsdauer zwischen 10 & mgr; s und 4 ms effektive Stimulation zu verursachen, ohne die Kultur zu verbrennen. Stellen Sie sicher , dass die Amplitude in der Größenordnung von ± 22 V ist (siehe Abbildung 5). Der Rechteckimpuls kann an die Elektroden parallel geschaltet sind auf einem Oszilloskop beobachtet werden.
      HINWEIS: Für eine einfache Programmierung beliebiger Wellenform, eine kommerzielle Wellenform - Bearbeitungs - Software (siehe Materialliste ). Geben Sie graphisch die gewünschte Wellenform und den Wellenformgenerator senden.
2. Um Feldhomogenitätstest eine Sondenelektrode verwendet werden. Verwenden mindestens 1 mm x 1 mm ein Raster der Sonde zu ermöglichen, in dem Bereich zwischen den Elektroden zu messen und elektrisches Potential bewegt werden.
   1. Messen Sie elektrisches Potential. Benutzen das elektrische Feld zu berechnen. Verwenden einer der Elektroden als Referenzelektrode. Messung des elektrischen Feldes mit unterschiedlichen Pulsdauern zwischen 100 & mgr; s bis 4 ms (siehe 5B für ein Beispiel von 100 & mgr; s Impulsdauer) , um zu überprüfen , dass das Feld im Bereich von stimulierenden Dauern homogen ist.
      HINWEIS: Siehe Abbildung 5D für ein Beispiel einer gemessenen elektrische Feldhomogenität , wenn die Impulsdauer 1 ms ist.
3. Verwendung 2 senkrechte Paare von Badelektroden komplizierteren elektrischen Feldformen zu erzeugen, undin der Lage , das Feld in verschiedenen Richtungen (siehe Fig. 6B) zu orientieren. Das Gerät ist mit 2 Paaren von Elektroden verwendet werden, und das Signal auf jedem Paar der Elektroden auf zwei getrennten Oszilloskope beobachtet werden.
   1. Position, um die Elektroden 1 mm über der Kultur und in einer Entfernung von 10 - 11 mm voneinander. Stellen Sie sicher, dass die beiden Elektrodenpaare sind schwimmende (keine Erdverbindung haben), und haben keine gemeinsame Masse durch den Widerstand zwischen jedem Satz von Elektroden gemessen und in Abwesenheit von Kurzschlüssen zwischen irgendeiner der Elektroden zu überprüfen. Stellen Sie sicher , dass alle Geräte verwendet, die an die Elektroden (wie die Oszilloskope, die Verstärker, die Signalgeneratoren, etc.) verbunden ist , ist in Bezug auf Masse floating durch Überprüfung , dass alle Geräte schwimmt , und dass keine der Referenzelektroden berührt jedes geerdetes Gerät.
   2. Um Feldorientierung zu ändern, variiert die Amplitude der an die beiden Elektrodenpaare mit res Spannung gespeistpect zueinander (siehe 7A). Zum Beispiel für den Einsatz 0 ° ± 22 V an dem Elektrodenpaar, die senkrecht zu dem Muster und 0 V für die andere Elektrode. 45 °, ± 15,6 V auf beiden Elektrodenpaare ohne Phasenverzögerung verwenden, für einen Amplitudenvektorsumme von 15,6 ² 15,6 ² 22 = ^2.
   3. Ein Drehfeld eine einzige Wellenform einer Sinusspannungsimpuls und eine einzige Wellenform eines Cosinus Spannungsimpulses an die zwei Paare von Elektroden verwenden , um eine feste Amplitude rotierende elektrisches Feld zu erzeugen (siehe 6B) anzuwenden.
      HINWEIS: Wie in 6B gesehen werden, wenn sie mit ± 22 V in einer Elektrode und einen Zyklus einer Cosinuswelle mit ± 22 V in der anderen Elektrode einen Zyklus einer Sinuswelle verwendet wird , die Vektorsumme ist ein rotierendes elektrisches Feld mit die Zyklusdauer gleich wie die Sinus- und Kosinus-Wellen und mit einer Amplitude von ± 22 V.
4. Zur Messung und Berechnung ChronAXIe Rheobase und von Axonen in der neuronalen Kultur vs. Dendriten in der gleichen Kultur die folgenden Schritte durch.
   1. Verwenden eines calciumempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff für Calcium - Bildgebung , wie in der Tabelle der Materialien / Reagenzien und in 1.5) mit einem Muster versehen 1D Kultur auf dünnen (170 & mgr; m) beschrieben, lang (10 mm) Linien. Calcium-empfindlichen Farbstoff wird auf die Kultur angewendet werden, und für 45 Minuten inkubiert. Der Farbstoff wird durch das Ersetzen mit einer neuen Aufzeichnungslösung gewaschen werden.
   2. Das Netzwerkbevölkerungsstatistik der direkten Reaktion auf eine elektrische Stimulation zu erzielen, ohne die Wirkung der synaptischen Übertragung. Zu tun , so gelten, die eine Kombination von 40 & mgr; M Bicucullin, die blockieren die hemmende Wirkung von Gamma-Aminobuttersäure-A (GABA _A) -Rezeptoren, 10 uM 6-Cyano-7-nitrochinoxalin-2,3-dion (CNQX) die α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) und Kainat-Rezeptoren und 20 & mgr; M von (2R) -Amino-5-phosphonovale zu blockierenric Säure (APV), die die Blöcke N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) -Rezeptoren. Die Blocker wird auf die Aufzeichnungslösung zugesetzt werden.
   3. Anwenden eine Rechteckimpuls, wie in 2.1 und 2.3 mit unterschiedlichen Zeitdauern zwischen 100 & mgr; s und 4 ms beschrieben. Das Signal kann auf dem Oszilloskop beobachtet werden.
   4. Verwenden, um ein Fluoreszenzmikroskop mit einem Bildakquisitionsprogramm (siehe 1.5), die Intensität der Calciumtransienten an mehreren ROIs zu überwachen, die jeweils ein paar hundert Neuronen enthalten. Acquire Bilder, die eine sensitive EMCCD Kamera (siehe Materialien Liste) verwendet wird, fähig ist, eine Bilderfassungsrate von mindestens 20 Bildern pro Sekunde. Die Änderung der Lichtintensität ist auf die Menge der Neuronen proportional, die stimuliert wurden. Schätzen, den Anteil der stimulierten Neuronen die relative Intensitätsänderung verwendet wird.
   5. Für jede Impulsdauer (100 & mgr; s bis 4 ms), um die Amplitude der Spannung an die Elektroden angelegt, verändert bei einer Spannung ausgehend, wo keine Änderung in der Intensität gesehen wird (einige Volt), the Spannung, wo die Änderungen in der Intensität aufgrund der angelegten Spannung gesättigt sind (bis 22 V bis zu ±).
      HINWEIS: Die Intensitätsänderung als kumulatives Gaussian ⁵ in Bezug auf die angelegte Spannung für die Stimulation für jede Zeitdauer des Spannungsimpulses verteilt wird.
   6. Fit eine kumulative Gaußschen Verteilung für die Intensität gegenüber der angelegten Spannung für jede Dauer und extrahiert die Gaußsche Mittelwert aus dieser Passform.
      HINWEIS: Dieser Mittelwert ist die repräsentative Spannung, auf die die Neuronen reagiert.
   7. Am Ende dieses Prozesses für jede Stimulationsdauer Spannung eines Mittelwert erhalten, auf die die Neuronen reagiert. Verwenden diese Paare von Dauer und Stärke der Stärke-Dauer - Kurven zu zeichnen (siehe Abbildung 7).

3. Magnetische Stimulation der Kulturen

Hinweis: Die Grundeinrichtung für magnetische Stimulation wird in Figur 2 gezeigt. Oben rechts wird gezeigtein invertiertes Fluoreszenzmikroskop, das Bild mit calciumsensitiven Farbstoffen in den Neuronen verwendet wird. Die Magnetspule (blaue Kreise) ist etwa 5 mm konzentrisch über einer neuronalen Ring Kultur, (blue outline) positioniert ist. Eine Aufnehmerspule (roter Kreis) auf dem Umfang der Petrischale überwacht die Spannung, die durch den magnetischen Impuls induziert. Links oben ist die gemessene Dynamik der magnetische Stimulator (MS) Spule mit einer Kondensatorspannung Last von 5.000 kV gezeigt, wie aus der Aufnehmerspule integriert. Das induzierte elektrische Feld (für einen Ringradius von 14 mm berechnet) wird in grün dargestellt, während das Magnetfeld in blau dargestellt. Auf der Unterseite sind die Bilder der neuronalen Kultur gezeigt. Unten links ist ein Hellfeldbild eines strukturierten 24 mm Deckglas. Die weißen Flächen sind die Neuronen. Die fotografierten Muster bestehen aus konzentrischen Ring Kulturen mit unterschiedlichen Radien. An der rechten unteren Ecke ist ein Zoom auf ein kurzes Segment der Ringe, die zeigen einzelne Neuronen. Für eine Skala, wid die Ringeth ist etwa 200 um.

1. Wächst die Neuronen in einer kreisförmigen Ringstruktur (geätzt, wie in 1.2.5 beschrieben) für 1D-Kultur Stimulation. Verwenden einen calciumempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff für Calcium-Bildgebung mit einer 1D-Kultur (wie in Abschnitt 1.5 beschrieben) strukturiert auf dünnem (170 & mgr; m), lang (10 mm) Linien.
   1. Verwenden, um eine kreisförmige Magnetspule und positioniert, um eine Petrischale mit ca. 5 mm unter und konzentrisch zu der Spule. Verwenden , um eine kundenspezifische Spule von ca. 30 mm (Innendurchmesser, 46 mm Außendurchmesser) Spule mit einer Induktivität von L = 90 mH , angetrieben durch einen hausgemachten oder kommerziell MS geladen mit einer maximalen Spannung von 5 kV.
   2. Entladung eine hohe Spannung und Strom durch eine leitende Spule eine Hochstromhochspannungsschalter magnetisch neuronalen Kulturen zu stimulieren. Magnetischer Stimulator (MS) in ²¹ unter Verwendung große Kondensatoren, in der Größenordnung von 100 mF, wie beschrieben , aufgebaut werden , um eine hohe Spannung von 1 zu erhalten - 5 kV. Alternativ verwenden Sie einen im Handelverfügbar MS (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien).
      HINWEIS: Verwenden einer 0,254 mm dick und 6,35 mm breit polyesterbeschichteten rechteckigen Kupferdraht ²¹ mit einer hausgemachten Spule herzustellen. Schalten Drähte auf Maß Rahmen, isoliert mit Glasfasern und gossenen Epoxy (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien). Alternativ verwenden Sie handelsübliche Spulen (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien).
2. Verwenden Sie rotierende magnetische Felder in 2D Kulturen anregen.
3. Verwenden Sie nun die rotierenden Magnetfelder 2D-Kulturen zu stimulieren. Feuer die TMS ohne Kultur in der Schale, mit unterschiedlicher Intensität, mit den Intensitäten der lineare Korrelation der Spule Lese zu zeigen.
4. Als nächstes, während sie mit einer neuronalen Kultur Kalzium Transienten Aufzeichnung starten Sie die TMS Brennen bei Intensitäten erhöht wird, während beide Transienten Calcium Aufnahme und die Spule. Zunächst Netzwerk platzt so groß Kalzium Transienten beobachtet, shoIch kann nicht mit Pick-up-Spule TMS-Spikes synchronisieren. Fortsetzung der Intensität zu erhöhen, irgendwann beginnen die Kalzium-Transienten mit den TMS-Spikes synchronisiert werden. Alternativ oder zusätzlich, nach dem Erreichen einer synchronisierten Antwort, beginnen Sie, die Intensitäten zu verringern, bis die Synchronisation abgeschafft wird, um die TMS-Schwelle zu bestimmen.
   HINWEIS: Die Bedingungen sollten für jede der Setups streng fixiert werden, wobei die genaue Lautstärke jedes Mal, die gleichen Schiffe und exakte Spulenpositionen und Ausrichtungen verwendet werden.
   1. Montieren Sie die Aufnahmespule auf der Unterseite des Aufzeichnungsbeckens, so dass sie in einer Ebene parallel zur neuronalen Kultur und in einer festen Position in Bezug auf die Kultur ist.
      HINWEIS: Dies stellt sicher, dass die Abhängigkeit der Positionierung der Aufnahmespule in Bezug auf den Magneten der Position der Kultur treu ist und dass jegliche Abweichungen bei der Positionierung bei den Aufnahmespulen-Messungen vernachlässigbar sind.
      1. Verwenden Sie zwei unabhängige Spulen, die sindpositioniert senkrecht zueinander sind (8B) eine sich drehende magnetische und induzierte elektrische Feld zu erzeugen. Schließen Sie jede Spule ihren eigenen MS. Sicherstellen , dass die Stimulatoren Ähnliche Ströme bei einer Phasenverzögerung von 90 Grad (10A) auszustoßen, in einem rotierendes Magnetfeld führt , die bei einem maximalen Feld von ~ 270 V / m (10B) um 270 Grad von dem realen Raum abtastet.
      2. Platzieren Sie die neuronale Kultur innerhalb eines sphärischen Glasbehälters mit der externen Aufzeichnungslösung gefüllt (EM).
      3. Überwachen Stimulation (Änderung der Fluoreszenzintensität der Neuronen) mit der Kamera, wie in Schritt 2.4.4 beschrieben.
      4. Im Fall der Kreuzspulen (8B), Anordnung der Aufnahmespule parallel und in einem bestimmten Abstand unterhalb der neuronalen Kultur. diese Konfiguration während der gesamten Experimente sorgfältig pflegen.
5. Berechnen analytisch das elektrische Feld für 1D- Configuration von E _max = k ₁ Br, wobei E _max die maximale Amplitude des induzierten elektrischen Feldes und wird entlang der Tangente der Ringe mit dem Radius r gerichtet. B ist die Amplitude des magnetischen Impulses und k ₁ ist ein dimensions Proportionalitätskonstante , die mit der Aufnahmespule (8A) gemessen werden kann.
6. Verwenden Sie ein numerisches Simulationspaket (Materialliste) , um numerisch das elektrische Feld ²¹ zu simulieren.

Ergebnisse

Das dargestellte Protokoll ermöglicht eine einfache Strukturierung von neuronalen Kulturen. Wenn es mit mehreren Methoden kombiniert wird, die wir für die Stimulation entwickelt haben, ermöglicht es, Messungen von einigen intrinsischen Neuroneigenschaften wie Chronaxie und Rheobase ⁵ durchzuführen, um die Eigenschaften von gesunden und kranken Neuronen zu vergleichen, um optimale Wege zu finden, um Kulturen als Funktion von zu stimulieren Ihre Struktur u...

Diskussion

1D Musterung ist ein wichtiges Werkzeug, das für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden kann. Zum Beispiel haben wir 1D Musterung für die Erstellung von Logikgattern aus neuronalen Kulturen ²⁹ und in jüngerer Zeit zu messen , die Chronaxie und die Rheobase von Ratten - Hippocampus - Neuronen ^5, und die Verlangsamung der Signalausbreitungsgeschwindigkeit des Brennen Aktivität in Down - Syndrom - Hippocampus - Neuronen im Vergleich zu dem verwendeten Wildtyp (WT...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
APV	Sigma-Aldrich	A8054	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp	Gibco	17504-044	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline	Sigma-Aldrich	14343	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate)	Sigma-Aldrich	S9640	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid	Frutarom LTD	5550710	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1 M	Fluka	21098	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
CNQX	Sigma-Aldrich	C239	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL	COMSOL Inc	Multiphysics 3.5	Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1 M	Sigma-Aldrich	65146	Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2
D-PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
FCS (FBS)	Gibco	12657-029	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4AM	Life technologies	F14201	Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100x	Gibco	35050-038	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1 M	Sigma-Aldrich	H0887	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
HI HS	BI	04-124-1A	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2
KCl,  3 M	Merck	1049361000	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1	Gibco	21090-022	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1 M	Sigma-Aldrich	M1028	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4 M	Bio-Lab	19030591	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol	Sigma-Aldrich	01858	Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill	BASF Corparation	50475278	Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution	Sigma-Aldrich	P47075	Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1 M	Sigma-Aldrich	S1888	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Thiol	Sigma-Aldrich	1858	Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE	Sigma-Aldrich	U3750	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine	AJA International, Inc	ATC Orion-5Series	coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter	Hewlett Packard	HP 7475A	Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires	A-M Systems, Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5
Signal generator	BKPrecision	4079	Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier	Homemade		Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply	Matrix	MPS-3005 LK-3	Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation	Magstim, Spring Gardens, UK	Rapid 2	Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4
Epoxy	Cognis	Versamid 140	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy	Shell	EPON 815	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,	Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil	Homemade		Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW	B&K Precision		Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897	Andor		Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4