Eccitazione esterna dei neuroni Usando campi elettrici e magnetici in mono e culture bidimensionali

Riepilogo

colture neuronali sono un buon modello per lo studio delle tecniche di stimolazione cerebrale emergenti tramite il loro effetto sui singoli neuroni o di una popolazione di neuroni. Qui presentati sono diversi metodi per la stimolazione di colture neuronali modellate da un campo elettrico prodotto direttamente dalla elettrodi bagno o indotto da un campo magnetico variabile nel tempo.

Abstract

Un neurone spara un potenziale d'azione quando il suo potenziale di membrana supera una certa soglia. Nell'attività tipica del cervello, questo si verifica come risultato di ingressi chimici alle sue sinapsi. Tuttavia, i neuroni possono anche essere eccitati da un campo elettrico imposto. In particolare, le recenti applicazioni cliniche attivano i neuroni creando un campo elettrico esternamente. È quindi interessante studiare come il neurone risponda al campo esterno e ciò che provoca il potenziale d'azione. Fortunatamente, un'applicazione precisa e controllata di un campo elettrico esterno è possibile per le cellule neuronali embrionali che vengono escise, dissociate e coltivate in colture. Ciò consente di esaminare queste domande in un sistema altamente riproducibile.

In questo lavoro vengono esaminate alcune delle tecniche utilizzate per l'applicazione controllata del campo elettrico esterno sulle culture neuronali. Le reti possono essere unidimensionali, cioè modellate in linear forme o lasciate crescere su tutto il piano del substrato, e quindi bidimensionale. Inoltre, l'eccitazione può essere creata mediante l'applicazione diretta del campo elettrico tramite elettrodi immersi nel liquido (elettrodi bagno) o inducendo il campo elettrico mediante la creazione remota di impulsi magnetici.

Introduzione

L'interazione tra i neuroni e campi elettrici esterni ha implicazioni fondamentali, nonché quelli pratici. Mentre è noto fin dai tempi di Volta che un campo elettrico applicato esternamente può eccitare il tessuto, i meccanismi responsabili per la produzione di un potenziale d'azione risultante in neuroni sono solo di recente iniziando da dipanare ^{1, 2, 3, 4.} Ciò include trovare le risposte alle domande per quanto riguarda il meccanismo che provoca la depolarizzazione del potenziale di membrana, il ruolo di proprietà di membrana e dei canali ionici, e anche la regione nel neurone che risponde al campo elettrico ^{2, 5.} Terapeutico neurostimolazione ^{6, 7, 8, 9,} 10 metodologie sono particolarmente dipendenti da queste informazioni, che può essere cruciale per il targeting aree colpite e per comprendere l'esito della terapia. Tale comprensione può anche aiutare a sviluppare protocolli di trattamento e nuovi approcci per la stimolazione delle diverse aree del cervello.

Misurare l'interazione all'interno del cervello in vivo aggiunge una componente importante per questa comprensione, ma è ostacolato dalla imprecisione e bassa la controllabilità delle misure all'interno del cranio. Al contrario, le misurazioni in culture possono essere facilmente eseguite in alto volume con alta precisione, eccellente rapporto segnale rumore prestazioni e un elevato grado di riproducibilità e di controllo. Utilizzando colture una grande varietà di proprietà neuronali del comportamento della rete collettiva può essere chiarita ^{11, 12, 13, 14, 15, 16.} Analogamente, questo sistema ben controllato è prevista essere altamente efficace nel chiarire il meccanismo che altri metodi di stimolazione di lavoro, ad esempio come apertura del canale durante la stimolazione ottico in neuroni optogenetically attive ^{17, 18, 19} è responsabile della creazione potenziale d'azione.

Qui l'attenzione è rivolta che descriva lo sviluppo e la comprensione di strumenti in grado di eccitare in modo efficiente il neurone tramite un campo elettrico esterno. In questo documento si descrive la preparazione di bidimensionale e unidimensionale colture ippocampali fantasia, stimolazione con diverse configurazioni e l'orientamento di un campo elettrico applicato direttamente dagli elettrodi bagno, e infine stimolazione bidimensionale e modellata culture unidimensionali di un variabili nel tempo del campo magnetico, che induce un campo elettrico^{5, 20, 21.}

Protocollo

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono la movimentazione degli animali sono stati fatti in accordo con le linee guida del Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso (IACUC) del Weizmann Institute of Science, e la legge israeliana appropriata. Il Weizmann Institute è accreditato dalla Associazione per la valutazione e l'accreditamento del Laboratorio di Animal Care International (AAALAC). Il Comitato Istituzionale Cura ed uso degli animali Weizmann approvato questo studio, condotto con neuroni dell'ippocampo.

1. Preparazione di bidimensionale (2D) e monodimensionale (1D) Culture Hippocampal

1. Preparazione di lamelle per colture 2D.
   1. Preparare mezzo di placcatura (PM) composto da: 0,9 mL minimo supporto essenziale (MEM) + 3G, 0,05 ml di siero di vitello fetale (FCS), 0,05 ml di calore siero di cavallo inattivato (HI HS) e 1 ml di supplemento B27. Nota: MEM + 3G contiene per ogni 500 ml di MEM x 1, 1 ml di gentamicina, 5 mL di stabilizzato 100x L-glutammina (vedi Tabella dei materiali / reagenti) e 5 ml di 60% D - (+) - glucosio.
   2. Preparare tampone borato composta 1,9 g borace (sodio tetraborato decaidrato) in 200 mL di acqua bidistillata (DDW) (della miscela a 60 ° C) e 1,24 g di acido borico in 200 mL DDW. Titolare soluzione finale a pH 8,5 usando 1 M HCl. Nota: La soluzione finale è di 400 mL di 0,1 M tampone borato.
   3. Immergere coprioggetto di vetro in acido nitrico 65% per 2 h. Risciacquare tre volte in acqua bidistillata seguiti da tre risciacqui con reagente analitico assoluto (ABS AR) etanolo.
   4. Passare ogni coprioggetto brevemente attraverso la fiamma di un becco Bunsen due o tre volte per 1 - 2 s, e quindi lasciare incubare durante la notte in piastre da 24 pozzetti con soluzione 1 0,01% di poli-L-lisina mL diluito 1: 5 in tampone borato ( 0.1 M, pH 8.4). Quindi sciacquare coprioggetto in DDW tre volte e lasciare con 1 mL PM per pozzetto in uno standard 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore durante la notte.
2. Preparazione di lamelle per colture 1D.
   1. Clean gcoprioggetti lass mediante immersione in una soluzione di base piranha costituito da 75 mL DDW, 25 mL di soluzione di ammoniaca al 25% e 25 ml di perossido di idrogeno al 30%. Soluzione posto con i vetrini su una piastra riscaldante a ~ 50 ° C per 30 min e poi asciugare i coprioggetti vetro con azoto.
   2. coprioggetto Coat prima con una pellicola sottile di cromo (99,999%) del 6 spessore a seguito da uno strato 30 Å di oro (99,999%), utilizzando vapore o deposizione per polverizzazione catodica.
      1. Per ottenere un tasso di sputtering dello 0,05 - 1 A / s usare una macchina di polverizzazione con 2 e-travi e un sistema di aspirazione di 260 l / s con obiettivo formati 2" e 4" . Utilizzare una fase di rotazione che può andare da 0 - 100 giri al minuto (RPM). Utilizzare una corrente continua (DC) per polverizzazione catodica potenza di 0 - 750 Watt.
      2. Utilizzare una rotazione di 30 rpm e argon 99,999% per ottenere plasma a pressione 10 mTorr nella camera.
      3. Azionare l'alimentazione delle pistole sputtering a 40 W di potenza a sputtering DC per il cromo, che porta a ~ 0,12 a / s tasso di copertura, ed a 10 W DC sputtering di potenza per l'oro, che porta a ~ 0,28 a / s.
   3. Sciogliere 0.1 g di 1-octadecanethiol in 100 mL ABS AR etanolo con ultrasuoni per 30 min. Posizionare Cr-Au coprioggetto rivestiti per 2 h in questa soluzione, poi lavare con AR etanolo ABS e asciugare con azoto.
   4. Preparare una soluzione di 100 mL di soluzione salina fosfato tamponata Dulbecco (D-PBS) e 3,5 g di un copolimero triblocco (vedere Tabella dei materiali / reagenti) da agitazione per 1 - 2 ore a 600 - 700 rpm. Mettere vetrini nella soluzione per 1 ora. coprioggetto secco con azoto.
   5. Meccanicamente incidere il modello desiderato graffiando strato bio-rifiuto ^22. Fate questo utilizzando un plotter a penna, in cui la penna viene sostituito da un ago di incisione. Graffiare il modello attraverso gli strati metallici per raggiungere il vetro sottostante. Controllare questo processo da un computer per realizzare un disegno desiderato replicato. Modelli formate da questo processo sono dimostrano D in Figura 2 e Figura 3 .
   6. Preparare uno strato bio-compatibile di 100 ml di D-PBS, di 3,5 g di co-polimero tri-blocco, di 35,7 μL / ml di fibronectina e di 29 μl / ml di laminina.
      1. Sterilizzare le copertine in luce ultravioletta per almeno 10 min. Incubare le copertine nella soluzione bio-compatibile preparata durante la notte.
         NOTA: Lo strato bio-compatibile si forma solo dove lo strato di bio-rifiuto è stato inciso nel passaggio precedente.
      2. Il giorno dopo il lavaggio copre due volte con P-DBS. Incubare coverlips in PM durante la notte. Le coperture sono ora pronte per la placcatura delle cellule.
3. Eseguire la dissezione secondo procedure standard che sono state pubblicate in modo esteso in precedenza ^{23 , 24} .
   1. In breve, estrarre ippocampo o corteccia da embrioni di ratto, tipicamente al giorno E19, o da topi, tipicamente al giorno E17 ^{23 ,}class = "xref"> 24.
   2. Separa celle prima in soluzione papaina per 20 - 30 minuti, seguita da triturazione meccanica ²⁴ con pipette di vetro le cui punte sono di fuoco lucido.
      NOTA: Se le cellule provenienti da topi geneticamente modificati, quindi il tessuto da ogni embrione deve essere mantenuta in un tubo di plastica da 1,5 ml separato durante l'intero processo.
   3. Contare le celle con trypan blu prima della semina.
      NOTA: Per gli animali geneticamente modificati il ​​conteggio dovrebbe essere fatto separatamente per ogni embrione.
   4. Per culture 2D, neuroni di topo seme a 750.000 e ratto neuroni alla 850.000 cellule per pozzetto. Per 1D, sementi a 650.000 cellule per pozzetto. Agitare piastra leggermente subito dopo la semina per garantire una copertura omogenea del coprioggetto.
4. Mantenimento delle colture neuronali.
   1. Preparare cambiamento medio (CM) composto da (per ml):. 0.9 mL MEM + 3G, 0,1 ml HI HS, 10 ml 5-fluoro-2'-deossiuridina (FUDR) con uridina 100x
   2. Preparare mezzo finale (FM) composto (per ml): 0,9 mL MEM + 3G e 0,1 ml HI HS.
   3. Sostituire PM con 1-1,5 ml CM dopo 4 giorni in vitro (DIV). A 6 DIV, sostituire il 50% del CM con CM fresca. A DIV 8, cambiare il supporto a 1,5 ml FM, seguito da una variazione del 50% di FM ogni 2 giorni. Dopo circa una settimana di attività sincrona spontanea emerge.
5. Imaging di attività spontanea o evocata in colture neuronali con coloranti fluorescenti.
   1. Preparare una soluzione di colorante fluorescente sensibile 50 ug di calcio (vedere Tabella dei materiali / reagenti) in 50 ml di DMSO (dimetilsolfossido).
   2. Preparare soluzione di registrazione extracellulare (EM) contenente (in mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl _2, 1 MgCl _2, 139 NaCl, 10 D-glucosio, saccarosio 45 (pH 7,4).
   3. Incubare colture neuronali in 2 mL EM con 8 ml di soluzione di colorante fluorescente sensibile calcio per 1 h. Proteggere dalla luce e ruotare delicatamente per garantire homogenLa diffusione del colorante alle cellule.
   4. Sostituire la soluzione con EM fresco prima dell'immagine. La rappresentazione fluorescente è illustrata nella figura 4 .
   5. Immagine in un microscopio a fluorescenza con filtri ottici per l'imaging di fluorescenza del calcio (picco di eccitazione a 488 nm, picco di emissione a 520 nm), utilizzando una fotocamera e un software in grado di quantificare l'intensità di qualsiasi regione di interesse (ROI) nel campo visivo Il microscopio.

2. Stimolazione elettrica delle culture

NOTA: L'impostazione base per la stimolazione elettrica è mostrata in Figura 1 . Una scivoletta di copertura su cui la coltura neuronale è stata coltivata per circa 14 giorni viene posta in un piatto di Petri sotto un microscopio a fluorescenza. L'attività elettrica dei neuroni viene ripresa utilizzando coloranti sensibili al calcio mentre una tensione viene applicata tramite due coppie di elettrodi da bagno posizionati al di fuori della cultura. Gli elettrodi sono guidati daGeneratore ignale la cui uscita è amplificata da un amplificatore a doppio canale. Il controllo della tensione per la stimolazione è preferito rispetto al controllo di corrente più standard ^{25 , 26} perché i vettori di campo elettrico sono determinati direttamente, consentendo così l'aggiunta e la combinazione di vettori diretti. Ciò richiede un controllo accurato dell'uniformità del campo elettrico, che può essere eseguito su tutto il campione per il caso del controllo di tensione. Quando si utilizza la tensione, occorre prestare attenzione per evitare eventuali cicli di terra e verificare l'omogeneità del campo elettrico (vedere 2.2).

1. Per la stimolazione elettrica con un campo elettrico omogeneo utilizzare un paio di cavi elettrodi paralleli.
   1. Utilizzare elettrodi in platino con uno spessore dell'ordine di 0,005 '' (127 μm). Se utilizzato con i coperchi da 13 mm, assicurarsi che la distanza tra i due elettrodi sia di circa 11 mm e posizionare l'elettrodos 1 mm sopra la cultura.
      NOTA: per rendere il portaelettrodo (Figure 5A e 6A) utilizzare politetrafluoroetilene (PTFE). Forare strette attraverso il PTFE per inserire gli elettrodi. Il dispositivo dovrebbe essere superiore alla soluzione extracellulare in modo che l'estremità superiore, in cui sono esposti gli elettrodi, non verrà mai a contatto con la soluzione. Per l'isolamento, utilizzare colla epossidica su qualsiasi parte dei conduttori di elettrodo che potrebbero essere esposti.
   2. Utilizzare una forma impulso quadrato con un duty cycle del 50%, senza alcuna componente DC per evitare elettrolisi. Variare durata dell'impulso tra 10 ms e 4 ms per causare una stimolazione efficace senza bruciare la cultura. Assicurarsi che l'ampiezza è dell'ordine di ± 22 V (vedi Figura 5). L'impulso quadrato può essere osservato su un oscilloscopio collegato in parallelo agli elettrodi.
      NOTA: Per una facile programmazione di qualsiasi forma d'onda desiderata, utilizzare un software di editing della forma d'onda commerciale (vedi elenco Materiali ). Inserisci graficamente la forma d'onda desiderata e inviarlo al generatore di forme d'onda.
2. Per eseguire il test per il campo di omogeneità usa un elettrodo sonda. Utilizzare una griglia di almeno 1 mm x 1 mm per consentire alla sonda di essere spostato nella zona tra gli elettrodi e misurare il potenziale elettrico.
   1. Misurare potenziale elettrico. Uso per calcolare il campo elettrico. Utilizzare uno degli elettrodi come elettrodo di riferimento. Misurare il campo elettrico variabile con durate di impulso tra 100 ms a 4 ms (vedere Figura 5B per un esempio di 100 ms durata dell'impulso) per verificare che il campo sia omogenea all'interno della gamma di durate stimolanti.
      NOTA: Vedere Figura 5D per un esempio di un'omogeneità di campo elettrico misurato quando la durata dell'impulso era di 1 ms.
3. Usare 2 paia di elettrodi perpendicolari bagno di produrre forme di campo elettrico più complicate, eessere in grado di orientare l'azione nella direzioni diverse (vedi Fig. 6B). Il dispositivo con 2 coppie di elettrodi sarà utilizzato, e si osserverà il segnale su ciascuna coppia di elettrodi su due oscilloscopi separati.
   1. Posizionare gli elettrodi 1 mm sopra la cultura e ad una distanza di 10 - 11 mm l'uno dall'altro. Assicurarsi che entrambe le coppie di elettrodi sono flottanti (non abbia collegamento a terra), e non hanno alcun terreno comune misurando la resistenza tra ogni gruppo di elettrodi e verificare l'assenza di cortocircuiti tra qualsiasi degli elettrodi. Verificare che tutte le apparecchiature utilizzate, che è collegato agli elettrodi (come gli oscilloscopi, gli amplificatori, i generatori di segnale, ecc) è flottante rispetto a terra verificando che tutte le apparecchiature galleggia e che nessuno dei elettrodi di riferimento sta toccando qualsiasi apparecchiatura a terra.
   2. Per modificare l'orientamento del campo, variare l'ampiezza della tensione alimentata ai due coppie di elettrodi con rispect tra loro (vedi figura 7A). Ad esempio, per 0 ° uso ± 22 V sul coppia di elettrodi che sono perpendicolari al modello e 0 V per l'altro elettrodo. Il 45 °, utilizzare ± 15,6 V su entrambe le coppie di elettrodi senza il ritardo di fase, per una somma vettoriale ampiezza 15,6 ² 15,6 ² = 22 ^2.
   3. Per applicare un campo rotante utilizzare un'unica forma d'onda di un impulso di tensione sinusoidale e una singola forma d'onda di un impulso di tensione coseno alle due coppie di elettrodi per produrre un'ampiezza fissa campo elettrico rotante (vedere Figura 6B).
      NOTA: Come può essere visto nella figura 6B, quando si utilizza un ciclo di un'onda sinusoidale con ± 22 V in un elettrodo e un ciclo di un'onda coseno con ± 22 V in altro elettrodo, la somma vettoriale è un campo elettrico rotante la durata del ciclo stessi delle onde di seno e coseno, e con un'ampiezza di ± 22 V.
4. Per misurare e calcolare ChronAXIe e reobase degli assoni nella cultura neuronale vs dendriti nella stessa cultura effettuare le seguenti operazioni.
   1. Utilizzare un colorante fluorescente sensibile calcio per l'imaging di calcio come descritto nella tabella dei materiali / reagenti e 1.5) con una cultura 1D modellata sulla sottile (170 um), lungo (10 mm) linee. colorante sensibile calcio sarà applicata alla cultura, e incubata per 45 minuti. Il colorante sarà lavato sostituendo con una soluzione di registrazione fresco.
   2. Scollegare la rete per ottenere statistiche demografiche della risposta diretta alla stimolazione elettrica, senza l'effetto della trasmissione sinaptica. Per fare ciò, applicare una combinazione di 40 pM di bicucullina, che blocca l'azione inibitoria di gamma-amminobutirrico-A (GABA _A) recettori, 10 uM di 6-ciano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX) , per bloccare l'α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazolepropionic (AMPA) e kainato e 20 pM di (2R) -ammino-5-phosphonovaleacido ric (APV), che blocca l'N-metil-D-aspartato (NMDA). I bloccanti saranno aggiunti alla soluzione di registrazione.
   3. Applicare un impulso quadrato come descritto in 2.1 e 2.3 con diverse durate di tempo tra 100 ms e 4 ms. Il segnale può essere osservato sull'oscilloscopio.
   4. Utilizzare un microscopio a fluorescenza con un programma di acquisizione delle immagini (vedi 1.5) per controllare l'intensità dei transienti di calcio in diversi ROI, ciascuna contenente poche centinaia neuroni. Acquisire le immagini utilizzando una fotocamera EMCCD sensibile (vedi elenco Materials), capaci di un tasso di acquisizione di immagini di almeno 20 fotogrammi al secondo. La variazione di intensità della luce è proporzionale alla quantità di neuroni che sono stati stimolati. Stimare la frazione di neuroni stimolati mediante la variazione relativa di intensità.
   5. Per ogni durata dell'impulso (100 ms a 4 ms), modificare l'ampiezza della tensione applicata agli elettrodi da una tensione in cui nessun cambiamento di intensità è visto (alcuni volt), a the tensione dove le variazioni di intensità a causa della tensione applicata è saturo (fino a ± 22 V).
      NOTA: La modifica intensità sarà distribuito come cumulativo gaussiano ⁵ rispetto alla tensione applicata per la stimolazione per ogni durata dell'impulso di tensione.
   6. Adattare una distribuzione gaussiana cumulativa per l'intensità contro la tensione applicata per ogni durata ed estrarre la media gaussiana da questa misura.
      NOTA: Questo medio è la tensione rappresentativo cui i neuroni risposto.
   7. Al termine di questo processo riceve per ogni durata stimolazione una tensione media a cui i neuroni risposto. Utilizzare queste coppie di durata e forza per tracciare le curve forza-Durata (vedere Figura 7).

3. Stimolazione Magnetica delle Culture

Nota: La configurazione di base per la stimolazione magnetica è mostrato in Figura 2. In alto a destra è mostratoun microscopio invertito a fluorescenza che è utilizzata per coloranti sensibili immagine calcio nei neuroni. La bobina magnetica (cerchi blu) è posizionata concentricamente circa 5 mm sopra un anello cultura neuronale, (blu contorno). Una bobina di captazione (cerchio rosso) sulla circonferenza del piatto Petri controlla la tensione indotta dal impulsi magnetici. In alto a sinistra è indicata la dinamica di misura della bobina stimolatore magnetico (MS) con un carico tensione del condensatore di 5,000 kV, integrate dalla bobina di captazione. Il campo elettrico indotto (calcolato per un raggio anello di 14 mm) è raffigurato in verde mentre il campo magnetico è rappresentato in blu. Sul fondo sono mostrate immagini della cultura neuronale. In basso a sinistra è un campo immagine luminosa di un modellato coprioggetto 24 mm. Le aree bianche sono i neuroni. Il modello fotografato costituito da culture anulari concentrici con raggi differenti. In basso a destra è uno zoom su un breve segmento degli anelli, che mostra i singoli neuroni. Per una scala, wid gli anelliesimo è di circa 200 micron.

1. Crescere i neuroni in un modello anello circolare (inciso come descritto in 1.2.5) per la stimolazione cultura 1D. Utilizzare un colorante fluorescente sensibile calcio per l'imaging del calcio (come descritto nella sezione 1.5) con una cultura 1D modellata sulla sottile (170 um), lungo (10 mm) linee.
   1. Utilizzare una bobina magnetica circolare e posizionare una piastra di Petri di circa 5 mm al di sotto e concentrici con la bobina. Utilizzare una bobina personalizzata di circa 30 mm (diametro interno, diametro esterno 46 mm) bobina con un'induttanza L = 90 mH azionata da MS artigianali o commerciali caricate con una tensione massima di 5 kV.
   2. Scaricare una alta tensione e corrente attraverso una bobina condurre mediante un interruttore ad alta corrente ad alta tensione per stimolare magneticamente colture neuronali. Lo stimolatore magnetico (MS) può essere costruito come descritto in ²¹ utilizzando grandi condensatori, dell'ordine di 100 mF, per ottenere una elevata tensione di 1 - 5 kV. In alternativa, utilizzare un commercialmentedisponibile MS (vedi Tabella dei materiali / reagenti).
      NOTA: utilizzare un filo di rame rettangolare rivestito di poliestere 0,254 millimetri di spessore e 6,35 mm per fabbricare una bobina casalingo ^21. Girare fili su telai su misura, isolati con fibre di vetro e resina epossidica cast (vedere Tabella dei materiali / reagenti). In alternativa utilizzare bobine disponibili in commercio (vedere Tabella dei materiali / reagenti).
2. Utilizzare il campo magnetico rotante per stimolare culture 2D.
3. Ora, utilizzare i campi magnetici rotanti per stimolare culture 2D. Fuoco l'TMS senza coltura nel piatto, a diverse intensità, per mostrare la correlazione lineare della lettura bobina con le intensità.
4. Successivamente, durante la registrazione di transienti di calcio con una cultura neuronale, iniziare a sparare il TMS ad aumentare di intensità durante la registrazione di entrambi i transienti di calcio e la bobina. Dapprima, raffiche di rete osservati grandi transienti di calcio, shoULD non la sincronizzazione con raccogliere picchi bobina TMS. Continuando per aumentare l'intensità, ad un certo punto, i transienti di calcio iniziano a diventare sincronizzato con le punte TMS. In alternativa, o in aggiunta, dopo aver ottenuto una risposta sincronizzato, comincerà a diminuire le intensità fino sincronizzazione abolita, per determinare la soglia TMS.
   Nota: Le condizioni devono essere mantenuti rigorosamente fissati per ciascuna delle impostazioni, utilizzando il volume esatto ogni volta, gli stessi vasi e le posizioni esatte della bobina e orientamenti.
   1. Montare la bobina trasduttrice sulla base del piatto di registrazione in modo che sia in un piano parallelo alla cultura neuronale e in una posizione fissa rispetto alla cultura.
      NOTA: Questo assicura che la dipendenza del posizionamento della bobina di captazione rispetto al magnete è fedele alla posizione della cultura e che eventuali discrepanze nel posizionamento sarà trascurabile sulle letture bobina pickup.
      1. Utilizzare due bobine che sono indipendentiposizionati perpendicolari tra loro (figura 8B) per generare un campo elettrico indotto magnetico e rotante. Collegare ogni bobina ai propri MS. Assicurarsi che gli stimolatori scaricano correnti simili in un ritardo di fase di 90 gradi (figura 10A), risultando in un campo magnetico rotante che analizza 270 gradi dello spazio reale in un campo massimo di ~ 270 V / m (Figura 10B).
      2. Posizionare la coltura neuronale all'interno di un contenitore di vetro sferico riempito con la soluzione di registrazione esterna (EM).
      3. Monitorare stimolazione (cambiamento di intensità di fluorescenza dei neuroni) con la fotocamera come descritto al punto 2.4.4.
      4. Nel caso delle bobine incrociate (Figura 8B), posizionare la bobina di captazione parallelo e ad una distanza specifica inferiore alla cultura neuronale. mantenere con attenzione questa configurazione durante gli esperimenti.
5. Calcolare analiticamente il campo elettrico per configura 1Dzione da E _max = k ₁ Br, dove E _max è l'ampiezza massima del campo elettrico indotto ed è diretto lungo la tangente degli anelli con raggio r. B è l'ampiezza dell'impulso magnetico e k ₁ è una costante di proporzionalità dimensionale che può essere misurata utilizzando la bobina pickup (Figura 8A).
6. Utilizzare un pacchetto di simulazione numerica (vedi elenco Material) per simulare numericamente il campo elettrico ^21.

Risultati

Il protocollo presentato permette una facile patterning di colture neuronali. Quando è combinato con vari metodi che abbiamo sviluppato per la stimolazione, permette di effettuare misurazioni di alcune proprietà neuroni intrinseci quali chronaxie e reobase ^5, per confrontare le proprietà di neuroni sani e malati ^27, per trovare il modo ottimale per stimolare culture come funzione di la loro struttura e molti altri nuovi approcci. A...

Discussione

Il pattern di 1D è uno strumento importante che può essere utilizzato per una varietà di applicazioni. Per esempio, abbiamo utilizzato il modello 1D per la creazione di gate logici da culture neuronali ²⁹ e più recentemente per misurare la Chronaxie e la Rheobase dei neuroni ippocampali ⁵ del ratto e il rallentamento della velocità di propagazione del segnale di attività di cottura nei neuroni ippocampali della sindrome di Down rispetto al Neuroni ippocampali di tipo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
APV	Sigma-Aldrich	A8054	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp	Gibco	17504-044	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline	Sigma-Aldrich	14343	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate)	Sigma-Aldrich	S9640	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid	Frutarom LTD	5550710	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1 M	Fluka	21098	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
CNQX	Sigma-Aldrich	C239	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL	COMSOL Inc	Multiphysics 3.5	Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1 M	Sigma-Aldrich	65146	Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2
D-PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
FCS (FBS)	Gibco	12657-029	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4AM	Life technologies	F14201	Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100x	Gibco	35050-038	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1 M	Sigma-Aldrich	H0887	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
HI HS	BI	04-124-1A	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2
KCl,  3 M	Merck	1049361000	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1	Gibco	21090-022	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1 M	Sigma-Aldrich	M1028	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4 M	Bio-Lab	19030591	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol	Sigma-Aldrich	01858	Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill	BASF Corparation	50475278	Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution	Sigma-Aldrich	P47075	Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1 M	Sigma-Aldrich	S1888	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Thiol	Sigma-Aldrich	1858	Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE	Sigma-Aldrich	U3750	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine	AJA International, Inc	ATC Orion-5Series	coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter	Hewlett Packard	HP 7475A	Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires	A-M Systems, Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5
Signal generator	BKPrecision	4079	Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier	Homemade		Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply	Matrix	MPS-3005 LK-3	Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation	Magstim, Spring Gardens, UK	Rapid 2	Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4
Epoxy	Cognis	Versamid 140	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy	Shell	EPON 815	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,	Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil	Homemade		Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW	B&K Precision		Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897	Andor		Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4