JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Нейронные культуры являются хорошей моделью для изучения новых методов стимуляции мозга через их влияние на отдельных нейронах или популяцию нейронов. Здесь представлены различные методы для стимуляции узорчатых нейрональных культур под действием электрического поля, создаваемого непосредственно электродами ванны или индуцированного магнитным полем изменяющейся во времени.

Аннотация

Нейрон будет срабатывать потенциал действия, когда его мембранный потенциал превышает определенный порог. В типичной активности головного мозга, это происходит в результате химических материалов для его синапсов. Однако нейроны также могут быть возбуждены с помощью наложенного электрического поля. В частности, недавние клинические приложения активируют нейроны, создавая электрическое поле снаружи. В связи с этим представляет интерес исследовать, как нейрон реагирует на внешнее поле и то, что вызывает потенциал действия. К счастью, точное и контролируемое применение внешнего электрического поля возможно для эмбриональных нервных клеток, которые вырезают, диссоциированных и выращенных в культурах. Это позволяет исследовать эти вопросы в высокой воспроизводимости системы.

В данной работе некоторые из методов, используемых для контролируемого применения внешнего электрического поля на нейрональных культурах рассматриваются. Сети могут быть одномерными, то есть с рисунком в Lineaг форма или позволяла расти на всей плоскости подложки, и, таким образом двумерный. Кроме того, возбуждение может быть создано путем непосредственного применения электрического поля с помощью электродов, погруженных в жидкости (ванна электродах) или путем индукции электрического поля с помощью пульта дистанционного создания магнитных импульсов.

Введение

Взаимодействие между нейронами и внешними электрическими полями имеют фундаментальные последствия, а также практические. Хотя известно со времен Вольты , что внешне приложенное электрическое поле может возбуждать ткани, механизмы , ответственные за производство потенциала результирующего действия в нейронах только недавно начали быть разгаданы 1, 2, 3, 4. Это включает в себя поиск ответов на вопросы о механизме , который вызывает деполяризацию мембранного потенциала, роль свойств мембраны и ионные каналы, и даже область в нейроне , который реагирует на электрическое поле 2, 5. Терапевтическая нейростимуляция 6, 7, 8, 9, 10 методологий особенно зависят от этой информации, которая может иметь решающее значение для ориентации в пострадавших районах и для понимания результатов терапии. Такое понимание может также помочь в разработке протоколов лечения и новые подходы к стимуляции различных областей головного мозга.

Измерение взаимодействия в головном мозге в естественных условиях добавляет важный компонент к этому пониманию, но затрудняются неточностью и низкой управляемостью измерений внутри черепа. В противоположность этому, измерения в культурах легко могут быть выполнены в большом объеме с высокой точностью, отличный сигнал-шум и высокой степенью воспроизводимости и контроля. Использование культур большое разнообразие нейрональных свойств коллективного поведения сети может быть выяснено 11, 12, 13, 14, 15, 16. Кроме того , это хорошо управляемая система , как ожидается , высокая эффективность в выяснении механизма , с помощью которой работают другие методы стимуляции, например , как открытие канала при оптической стимуляции в optogenetically активных нейронов 17, 18, 19 отвечает за создание потенциала действия.

Здесь акцент делается на описание развития и понимания инструментов, которые могут эффективно возбуждают нейрон с помощью внешнего электрического поля. В данной работе описано получение двумерных и одномерных узорчатых гиппокампа культур, стимуляция с использованием различных конфигураций и ориентацию, непосредственно приложенного электрического поля с помощью ванны электродов и, наконец, стимуляция двумерно и узорной одномерные культур с помощью изменяющихся во времени магнитное поле, которое индуцирует электрическое поле5 , 20 , 21 .

протокол

Этика заявление: Процедуры, связанные с обращением животных были проведены в соответствии с руководящими принципами Animal Care и использованием комитета Institutional (IACUC) из Института Вейцмана, и соответствующего израильского законодательство. Институт Вейцмана аккредитована Ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторных животных Care International (AAALAC). Institutional Animal Care и использование Комитет Вейцмана одобрил это исследование, проведенное с нейронами гиппокампа.

1. Получение Двумерная (2D) и одномерной (1D) гиппокампа культур

  1. Приготовление покровные для 2D культур.
    1. Подготовьте гальванические среды (ПМ), состоящая из: 0,9 мл минимальных основных сред (MEM) + 3G, 0,05 мл фетальной сыворотки теленка (FCS), 0,05 мл инактивированной нагревания лошадиной сыворотки (HS HI) и 1 мкл B27 дополнения. Примечание: АЕТ + 3G содержит для каждых 500 мл MEM х 1, 1 мл гентамицина, 5 мл стабилизированной L-глутамина 100х (см Таблица материалов / Реагенты) и 5 ​​мл 60% D - (+) - глюкозы.
    2. Готовят боратный буфер, состоящий из 1,9 г буры (декагидрата тетрабората натрия) в 200 мл двойной дистиллированной воды (DDW) (смесь при 60 ° C) и 1,24 г борной кислоты в 200 мл DDW. Окончательный раствор титруют до рН 8,5, используя 1 М HCl. Примечание. Конечным раствором является 400 мл 0,1 М боратного буфера.
    3. Погрузите покровные стекла в 65% -ную азотную кислоту на 2 часа. Промыть три раза в DDW, затем три раза промыть этанолом с абсолютным аналитическим реагентом (ABS AR).
    4. Кратковременно пропускайте каждое покровное стекло через пламя горелки Бунзена два или три раза в течение 1-2 с и затем оставляйте для инкубации в течение ночи в 24-луночных планшетах с 1 мл 0,01% -ного раствора поли-L-лизина, разбавленного 1: 5 в боратном буфере ( 0,1 М, рН 8,4). Затем промывают покровные стекла в DDW три раза и оставляют с 1 мл РМ на лунку в стандартном 37 ° С, 5% CO 2 -инкубаторе в течение ночи.
  2. Подготовка покровных для 1D культур.
    1. Очистить gLass покровные путем погружения в базовой пираньи растворе, состоящем из 75 мл DDW, 25 мл 25% раствора аммиака и 25 мл 30% -ной перекиси водорода. Место раствор с покровные стекла на нагревательной пластине при ~ 50 ° C в течение 30 мин, а затем высушить покровные стекла с азотом.
    2. Coat покровные первый с тонкой хромовой пленкой (99,999%) толщиной 6 Å, за которым следует 30 слоем золота (99,999%), с использованием либо из паровой фазы или осаждение. Распылением
      1. Для того, чтобы достичь скорости распыления 0,05 - 1 A / S использовать для распыления машину с 2 электронных пучков и вакуумной системы 260 л / с с мишенью размерами 2" и 4" . Используйте этап вращения, который может пойти от 0 - 100 выстрелов в минуту (RPM). Используйте постоянный ток (DC) распыления мощности 0 - 750 Вт.
      2. Используйте вращение 30 оборотов в минуту и ​​аргона 99,999%, чтобы получить плазму при давлении 10 мТорр в камере.
      3. Работает электропитание распыления пушки при 40 Вт распыла мощности постоянного тока для хрома, что приводит к ~ 0,12 уровень охвата A / S, и при 10 Вт DC мощность распыления для золота, что приводит к ~ 0,28 Å / с.
    3. Растворить 0,1 г 1-octadecanethiol в 100 мл этанола AR АБС с помощью ультразвука в течение 30 мин. Поместите Cr-Au покровные с покрытием в течение 2 ч в этом растворе, а затем промывают этанолом AR ABS и сухим азотом.
    4. Готовят раствор 100 фосфатным буферным солевым раствором Дульбекко мл , (D-PBS) и 3,5 г три-блок - сополимера (см Таблицу материалов / Реагенты) при перемешивании в течение 1 - 2 ч при 600 - 700 оборотов в минуту. Поместите покровные в растворе в течение 1 ч. Сухие покровные с азотом.
    5. Механически протравить желаемый рисунок, царапая био-режекции слой 22. Делайте это с помощью пера плоттера, где перо заменяется травильной иглой. Царапины шаблона через металлические слои, чтобы достичь базового стекла. Управление этим процессом с помощью компьютера, чтобы достигнуть желаемого рисунка реплицируется. Образцы, образованные этим способом, демонстрируют д на фиг.2 и фиг.3.
    6. Подготовьте био-совместимый слой 100 мл D-PBS, 3,5 г три-блок-сополимерной, 35,7 мкл / мл фибронектина и 29 мкл / мл ламинин.
      1. Стерилизовать покровные в ультрафиолетовом свете, по крайней мере, 10 мин. Инкубируйте покровные в подготовленном биологически совместимом растворе в течение ночи.
        Примечание: Био-совместимый слой будет формировать только там, где био-отторжение слой был стравливается в предыдущем шаге.
      2. На следующий день мыть покровные два раза с P-DBS. Выдержите покровные в личку на ночь. Покровные теперь готовы к клеточной обшивке.
  3. Выполнение рассечения в соответствии со стандартными процедурами , которые были опубликованы ранее широко 23, 24.
    1. Вкратце, экстракт гиппокампа или коры головного мозга из эмбрионов крыс, как правило , в день E19, или от мышей, как правило , в день E17 23,класс = "внешние ссылки"> 24.
    2. Диссоциируют клетки сначала в растворе папаина в течение 20 - 30 мин, с последующей механическим растиранием 24 со стеклянными пипетками , чьи советы огнь отполированы.
      Примечание: Если клетки происходят из генетически модифицированного мышея после чего ткань из каждого эмбриона должна быть сохранена в отдельных 1,5 мл пластиковой пробирки в течение всего процесса.
    3. Граф клеток с трипановым синим перед посевом.
      Примечание: Для получения генетически модифицированных животных подсчета должно быть сделано отдельно для каждого эмбриона.
    4. Для 2D культур нейронов мыши семян на 750000 и крысах нейронов на 850000 клеток на лунку. Для 1D, семян на 650000 клеток на лунку. Встряхнуть тарелку немного сразу после посева, чтобы обеспечить однородное покрытие покровного.
  4. Поддержание нейрональных культур.
    1. Подготовьте изменение среды (см), состоящие из (на мл):. 0,9 мл АЮТ + 3G, 0,1 мл HI HS, 10 мкла 5-фтор-2'-дезоксиуридина (ФУДРО) с уридином 100м
    2. Подготовьте окончательный носитель (FM), состоящую из (на мл): 0,9 мл МЕМ + 3G и 0,1 мл HI HS.
    3. Заменить ПМ с 1-1,5 мл СМ после 4 дней в пробирке (DIV). В 6 DIV, заменить 50% СМ со свежим CM. При DIV 8, изменить среду в 1,5 мл FM, с последующим изменением FM каждые 2 дня 50%. Примерно через неделю спонтанная синхронная активность возникает.
  5. Визуализация спонтанной или вызванной активности в нейрональных культурах с флуоресцентными красителями.
    1. Готовят раствор 50 мкг кальция чувствительного флуоресцентного красителя (см таблицу Материалы / Реагенты) в 50 мкл ДМСО (диметилсульфоксид).
    2. Подготовьте внеклеточный раствор записи (EM) , содержащий (в мМ) 10 HEPES, 4 KCl, CaCl 2 , 2, 1 MgCl2, 139 NaCl, 10 Д-глюкоза, сахароза 45 (рН 7,4).
    3. Инкубируйте нейронов культуры в 2 мл ЭМ с 8 мкл раствора красителя кальция чувствительного флуоресцентного в течение 1 ч. Защита от света и осторожно поворачивайте, чтобы обеспечить homogenОЕ распространение красителя в клетки.
    4. Заменить раствор свежего EM перед визуализацией. Флуоресцентные изображения продемонстрировано на рисунке 4.
    5. Изображение в флуоресцентного микроскопа с оптическими фильтрами для флуоресценции кальция визуализации (пик возбуждения при длине волны 488 нм, пик эмиссии при 520 нм), используя камеру и программное обеспечение, способное количественной оценки интенсивности любой области, представляющей интерес (ROI) в пределах поля зрения микроскоп.

2. Электрическая стимуляция культур

Примечание: Базовая установка для электрической стимуляции показана на рисунке 1. Крышка скольжение, на котором нейронная культура выращивалась в течение 14 дней помещают в чашке Петри под флуоресцентным микроскопом. Электрическая активность нейронов визуализируют с помощью чувствительных красителей кальция в то время как напряжение подается через две пары электродов ванны, которые расположены за пределами культуры. Электроды приводятся в движение, какГенератор ignal, выход которого усилен двухканальным усилителем. Регулирование напряжения для стимуляции является предпочтительным по сравнению с более стандартным регулятором тока 25 , 26 , поскольку векторы электрического поля определяются непосредственно, что обеспечивает прямое векторное сложение и комбинацию. Это требует тщательной проверки однородности электрического поля, которое может быть выполнено по всему образцу для контроля напряжения. При использовании контроля напряжения следует соблюдать осторожность, чтобы избежать каких-либо замыканий на землю, и необходимо проверить однородность электрического поля (см. 2.2 ниже).

  1. Для электростимуляции с однородным электрическим полем используйте пару параллельных электродных проволок.
    1. Используйте электроды из платины толщиной порядка 0,005 '' (127 μm). При использовании с покровными стеклами 13 мм убедитесь, что расстояние между двумя электродами составляет около 11 мм и установите электродс 1 мм над культурой.
      Примечание: Для того, чтобы держатель электрода (Фигуры 5А и 6А) использовать политетрафторэтилен (PTFE). Дрель узких отверстий через PTFE, чтобы вставить электроды. Устройство должно быть выше, чем внеклеточный раствор так, чтобы верхний конец, где электроды подвергаются, никогда не вступают в контакт с раствором. Для изоляции, используют эпоксидный клей на любой части электродных выводов, которые могут быть подвержены.
    2. Используйте квадратную форму импульса при рабочем цикле 50%, без постоянной составляющей, чтобы избежать электролиза. Vary длительности импульса от 10 мкс до 4 мс, чтобы вызвать эффективную стимуляцию без сжигания культуры. Убедитесь , что амплитуда находится в пределах ± 22 V (см рисунок 5). Прямоугольный импульс можно наблюдать на осциллографе, соединенных параллельно с электродами.
      Примечание: Для облегчения программирования любого желаемой формы сигнала, использовать коммерческое программное обеспечение для редактирования формы сигнала (см список материалов ). Введите графически желаемую форму и отправить его в генератор сигнала.
  2. Для проверки однородности поля используют зонд электрода. Использование сетки, по меньшей мере, 1 мм х 1 мм, чтобы зонд быть перемещен в области между электродами и измерить электрический потенциал.
    1. Измерение электрического потенциала. использование figure-protocol-10994 рассчитать электрическое поле. Используйте один из электродов в качестве опорного электрода. Измерьте электрическое поле с различной длительностью импульсов от 100 мкс до 4 мс (смотри рисунок 5В для примера 100 мкс длительности импульса) , чтобы убедиться в том , что поле однородно в диапазоне стимулирующих длительностей.
      Примечание: Смотрите Рисунок 5D для примера измеренной однородности электрического поля , когда длительность импульса 1 мс.
  3. Используйте 2 перпендикулярные пары электродов ванны для получения более сложных форм электрического поля, иИметь возможность сориентировать поле в разных направлениях (см. Рисунок 6B ). Будет использоваться устройство с 2 парами электродов, и сигнал на каждой паре электродов будет наблюдаться на двух отдельных осциллографах.
    1. Расположите электроды на 1 мм выше культуры и на расстоянии 10-11 мм друг от друга. Убедитесь, что обе пары электродов плавают (не имеют заземления), и не имеют общего заземления, измеряя сопротивление между любыми наборами электродов и проверяя отсутствие коротких замыканий между любыми электродами. Убедитесь, что все используемое оборудование, которое подключено к электродам (например, осциллографы, усилители, генераторы сигналов и т. Д.), Плавает относительно земли, проверяя, что все оборудование находится в плавании и что ни один из эталонных электродов не соприкасается Любое заземленное оборудование.
    2. Чтобы изменить ориентацию поля, измените амплитуду напряжения, подаваемого на две пары электродов, с помощью resPECT друг с другом (см рисунок 7A). Так, например, при 0 ° Использование ± 22 В на пары электродов, которые расположены перпендикулярно к шаблону и 0 В для другого электрода. При 45 °, использовать ± 15,6 В на обеих парах электродов, без фазовой задержки, для амплитуды векторной сумме 15,6 2 15,6 2 = 22 2.
    3. Чтобы применить вращающееся поле использовать одну единственную форму волны синусоидальной импульса напряжения и одну единственную форму сигнала импульса напряжения косинуса к двум парам электродов для получения фиксированной амплитуды вращающегося электрического поля (рис 6В).
      Примечание: Как можно увидеть на фиг.6В, при использовании одного цикла синусоидальной волны с ± 22 V в одном электроде и один цикл волны косинуса с ± 22 V в другом электроде, векторная сумма представляет собой вращающееся электрическое поле с длительность цикла же, как и волны синуса и косинуса, и с амплитудой ± 22 В.
  4. Для измерения и вычисления Chronaxie и реобаза аксонов в культуре нейронов по сравнению дендритов в той же культуре выполнить следующие шаги.
    1. Используйте кальций чувствительный флуоресцентный краситель для визуализации кальция , как описано в Таблице Материалы / Реагенты и в 1.5) с культурой 1D рисунком на тонких (170 мкм), длинный (10 мм) линии. Кальций чувствительный краситель будет применяться к культуре, и инкубировали в течение 45 минут. Краситель будет промывают путем замены со свежим раствором записи.
    2. Отключить сеть, чтобы достичь демографических статистических данных прямого ответа на электрическую стимуляцию, без эффекта синаптической передачи. Для этого применяют комбинацию 40 мкМ бикукуллина, который блокирует ингибирующее действие гамма-аминомасляная кислота-A (ГАМК А) рецепторов, 10 мкМ 6-циано-7-нитрохиноксалин-2,3-дион (CNQX) , чтобы блокировать α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионова (АМРА) и каинатные рецепторы и 20 мкМ (2R) -амино-5-phosphonovaleRIC кислоты (APV), который блокирует N-метил-D-аспартат (NMDA) рецепторов. Блокаторы будут добавлены к раствору записи.
    3. Применить прямоугольный импульс, как описано в разделе 2.1 и 2.3 с переменным времени длительностью от 100 мкс до 4 мс. Сигнала можно наблюдать на осциллографе.
    4. С помощью флуоресцентного микроскопа с программой захвата изображений (см 1.5), чтобы контролировать интенсивность переходного кальция на несколько трансформировании, каждый из которых содержит несколько сот нейронов. Получение изображений с помощью чувствительного EMCCD камеры (смотрите список материалов), способные к скорости сбора данных изображения, по меньшей мере, 20 кадров в секунду. Изменение интенсивности света пропорционально количество нейронов, которые стимулировали. Оценить долю нейронов, стимулированных с помощью относительного изменения интенсивности.
    5. Для каждой длительности импульса (100 мкс до 4 мс), изменение амплитуды напряжения, подаваемого на электроды, начиная при напряжении, где никаких изменений в интенсивности не видно (несколько вольт), чтобы йе напряжения, где изменения в интенсивности за счет приложенного напряжения имеет насыщенный (до ± 22 В).
      Примечание: Изменение интенсивности будет распределено в виде кумулятивной гауссовые 5 относительно приложенного напряжения для стимуляции для каждой временной длительности импульса напряжения.
    6. Установить кумулятивное гауссово распределение для интенсивности против приложенного напряжения для каждой длительности и извлечь Gaussian среднего из этой подгонки.
      Примечание: Это среднее значение является представителем напряжения, к которому нейроны ответили.
    7. В конце этого процесса получает для каждой длительности стимуляции среднего напряжения, к которому ответили нейроны. Используйте эти пары длительностей и сильные стороны, чтобы построить кривые Strength-Duration (рисунок 7).

3. Магнитная стимуляция культур

Примечание: Базовая установка для магнитной стимуляции показана на рисунке 2. В правом верхнем углу отображаетсяинвертированный флуоресцентный микроскоп, который используется для чувствительных изображений кальция красителей в нейронах. Магнитная катушка (синие кружки) расположен около 5 мм концентрично над кольцом нейрональной культуры, (синий контур). Катушка срабатывания (красный круг) по окружности чашки Петри контролирует напряжение, вызванное магнитным импульсом. В левом верхнем углу показано измеренные динамику магнитного стимулятора (МС) катушки с нагрузкой конденсатора напряжения 5000 кВ, а интегрированный от катушки съема. Индуцированное электрическое поле (вычислено для радиуса кольца 14 мм) изображена зеленым цветом, а магнитное поле изображено синим цветом. На дне показаны изображения нейрональной культуры. В нижнем левом углу является светлое поле изображение узорной 24-мм покровным. Белые области являются нейронами. Сфотографировали узор состоит из концентрических кольцевых культур с различными радиусами. В правом нижнем углу является увеличение на коротком отрезке колец, показывая отдельные нейроны. Для шкалы, WID колецго составляет около 200 мкм.

  1. Grow нейронов по круговой схеме кольца (травлению, как описано в 1.2.5) для стимуляции 1D культуры. Используйте кальций чувствительный флуоресцентный краситель для визуализации кальция (как описано в разделе 1.5) с 1D культурой штриховки на тонких (170 мкм), длинными (10 мм) линиями.
    1. Используйте круглую магнитную катушку и поместить в чашку Петри приблизительно на 5 мм ниже, а концентрические с катушкой. Используйте пользовательскую катушку приблизительно на 30 мм (внутренний диаметр, 46 мм наружный диаметр) катушки с индуктивностью L = 90 мГн , приводимый в действие самодельных или коммерческих MS загруженных с максимальным напряжением 5 кВ.
    2. Разряд высокого напряжения и тока через проводящую катушку с помощью переключателя высокого тока высокого напряжения, чтобы стимулировать магнитно-нейрональные культуры. Магнитный стимулятор (МС) может быть построен , как описано в 21 с использованием больших конденсаторов, порядка 100 мФа, чтобы получить высокое напряжение 1 - 5 кВ. В качестве альтернативы используют коммерческидоступен МС (см Таблица материалов / реагентов).
      Примечание: Используйте 0,254 мм толщины и широкой 6,35 мм полиэфирного покрытия прямоугольных медную проволоку для изготовления домашней катушки 21. Включите провода на выполненных на заказ рам, с изоляцией из стекловолокна и эпоксидной смолы в гипсе (см таблицу материалов / реагентов). В качестве альтернативы используют коммерчески доступные катушки (см Таблицу материалов / реагентов).
  2. Использование вращающихся магнитных полей для стимуляции 2D культур.
  3. Теперь, используя вращающиеся магнитные поля, чтобы стимулировать 2D культур. Пожар в TMS, без культуры в чашке, при различной интенсивности, чтобы показать линейную корреляцию чтения катушки с интенсивностью.
  4. Далее, во время записи переходного кальция с нейрональной культурой, начинает обжиг ТМСА при увеличении интенсивности во время записи оба переходного кальция и катушки. Во-первых, сетевые всплески наблюдаются как больших переходных кальция, шопакетирования не синхронизируются с подцепить катушки TMS шипы. Продолжая увеличивать интенсивность, в какой-то момент, переходные процессы кальция начинают становиться синхронизировано с шипами TMS. В качестве альтернативы, или в дополнение, после достижения синхронизированный ответа, начинает уменьшаться интенсивности до тех пор, синхронизация не отменяется, чтобы определить порог TMS.
    Примечание: Условия должны быть сохранено строго фиксированными для каждого из установок, используя точный объем каждый раз, одни и те же сосуды и точные позиции катушки и ориентацию.
    1. Установите катушку съема на основании тарелки записи так, что она находится в плоскости, параллельной нейрональной культуре, и в фиксированном положении по отношению к культуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это гарантирует, что зависимость от расположения съема катушки относительно магнита верна позиции культуры, и что любые расхождения в позиционировании будут незначительными по показаниям срабатывания катушки.
      1. Используйте две независимые катушки, которые являютсярасположены перпендикулярно друг к другу (фиг.8В) , чтобы генерировать вращающееся магнитное и индуцированное электрическое поле. Подключите каждую катушку к своему собственному MS. Убедитесь , что стимуляторы разряд подобных токов на фазовую задержке 90 градусов (рис 10А), в результате чего вращающегося магнитного поля , которое сканирует 270 градусов в реальном пространстве при максимальном поле ~ 270 В / м (рис 10B).
      2. Поместите нейронную культуру внутри сферической стеклянной емкости, заполненной наружным регистрирующим раствором (ЭМ).
      3. Монитор стимуляции (изменение в интенсивности флуоресценции нейронов) с помощью камеры, как описано в шаге 2.4.4.
      4. В случае поперечных катушек (рис 8B), расположить параллельно пикап катушки и на определенном расстоянии ниже нейрональной культуры. Тщательно сохранить эту конфигурацию на протяжении экспериментов.
  5. Вычислить аналитически электрическое поле для 1D configuraции по E макс = K 1 Br, где Е макс является максимальная амплитуда индуцированного электрического поля и направлен по касательной колец с радиусом г. В является амплитуда магнитного импульса и к 1 является размерная константа пропорциональности , которая может быть измерена с использованием катушки съема (рис 8а).
  6. Использование численного моделирования пакета (список материалов) для численного моделирования электрического поля 21.

Результаты

Протокол представлен позволяет легко кучность нейрональных культур. В сочетании с несколькими методами , которые мы разработали для стимуляции, она позволяет производить измерения некоторых внутренних свойств нейронов , такие как хроноксия и реобазами ...

Обсуждение

1D является важным инструментом, который может быть использован для различных приложений. Например, мы использовали паттерн 1D для создания логических вентилей из нейронных культур 29 и более недавно для измерения Chronaxie и Rheobase нейронов гиппокампа крысы 5 и замед?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы благодарят Офер Фейнерман, Фред Вольф, Менахем Сегал, Андреас Неф и Эйтан Ревени за очень полезные обсуждения. Авторы благодарят Илан Брескин и Хорди Сориано~d для разработки ранних версий технологии. Авторы благодарят Цви Тлустого и Жан-Пьер Экмана за помощью теоретических концепций. Это исследование было поддержано Минервом Фондом, Министерство науки и техники, Израиль, и грантом Израиля научного фонда 1320/09 и грант Bi-National Science Foundation 2008331.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
APVSigma-AldrichA8054Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 suppGibco17504-044Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicucullineSigma-Aldrich14343Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate)Sigma-AldrichS9640Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acidFrutarom LTD5550710Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1 MFluka 21098Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
CNQXSigma-AldrichC239Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
COMSOLCOMSOL IncMultiphysics 3.5Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1 MSigma-Aldrich65146Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2
D-PBSSigma-AldrichD8537Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
FCS (FBS)Gibco12657-029Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
FibronectinSigma-AldrichF1141Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4AMLife technologiesF14201Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5
FUDRSigma-AldrichF0503Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
GentamycinSigma-AldrichG1272Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100xGibco35050-038Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1 MSigma-AldrichH0887Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
HI HSBI04-124-1APlating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2
KCl,  3 MMerck1049361000Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin Sigma-AldrichL2020Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1Gibco21090-022Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1 MSigma-AldrichM1028Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4 MBio-Lab19030591Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
OctadecanethiolSigma-Aldrich01858Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF PrillBASF Corparation 50475278Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution Sigma-Aldrich P47075Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1 MSigma-AldrichS1888Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Thiol Sigma-Aldrich1858Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINESigma-AldrichU3750Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machineAJA International, IncATC Orion-5Series coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter Hewlett Packard HP 7475AEtching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires A-M Systems, Carlsborg WA767000Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5
Signal generatorBKPrecision4079Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
AmplifierHomemadeVoltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supplyMatrix MPS-3005 LK-3 Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulationMagstim, Spring Gardens, UKRapid 2Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4
EpoxyCognisVersamid 140Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
EpoxyShellEPON 815 Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,  Carlsborg WA 767000Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coilHomemadeMagnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SWB&K Precision Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897AndorSensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4

Ссылки

  1. Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
  2. Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
  3. Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
  4. Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
  5. Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577 (2015).
  6. Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
  7. Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
  8. Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, S44-S53 (2009).
  9. Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
  10. Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
  11. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
  12. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
  13. Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
  14. Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
  15. Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
  16. Soriano, J., Rodriguez Martinez, ., Tlusty, M., T, E., Moses, Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
  17. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  18. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  19. Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287 (2013).
  20. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
  21. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
  22. Feinerman, O., Moses, E. A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
  23. Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
  24. Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
  25. Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
  26. Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
  27. Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
  28. Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794 (2014).
  29. Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
  30. Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
  31. Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
  32. Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
  33. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
  34. Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680 (2015).
  35. Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

123

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены