تنقية مجمعات الأصلية للدراسة الهيكلية باستخدام طريقة العلامة جنبا الى جنب الانجذاب

Summary

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

Abstract

وقد نهج تنقية تقارب ناجح في عزل المجمعات المحلية لتوصيف البروتين. عدم التجانس الهيكلي ودرجة من التجانس التركيبي مجمع عادة لا تعيق التقدم في إجراء مثل هذه الدراسات. في المقابل، مجمع مخصص للتوصيف الهيكلية يجب تنقيته في الدولة التي هي على حد سواء بشكل إنشائي ومتجانسة من الناحية الهيكلية وكذلك بتركيز أعلى من اللازم لالبروتينات. في الآونة الأخيرة، كانت هناك تقدما كبيرا في تطبيق المجهر الإلكتروني لتحديد هيكل المجمعات الجزيئات الكبيرة. زاد هذا الاهتمام في نهج مجمعات تنقي الأم ذات نوعية كافية وكمية من أجل تقرير الهيكلي بواسطة المجهر الإلكتروني. وقد تم تحسين (وات) طريقة جنبا الى جنب الانجذاب تنقية لاستخراج وتنقية وسيلة فرعية 18، ~ 0.8 نجمة داود الحمراء بروتين نووي ريبوزي التجمع من مهدها الخميرة (خميرة الخباز)

Introduction

يتم تنفيذ العديد من العمليات الخلوية الرئيسية من قبل البروتين كبير والبروتين RNA مجمعات ^1. واختناق كبير لإجراء دراسات الفيزيائية الحيوية والهيكلية لهذه المجمعات هو الحصول عليها من نوعية مناسبة (أي تجانس) وبتركيز مناسب. عزل مجمع من مصدر الأصلي يحتوي على العديد من المزايا، بما في ذلك الاحتفاظ التعديلات بعد النسخي و / أو متعدية ذات الصلة من مفارز وتأمين التجمع معقدة السليم. ومع ذلك، المجمعات الخلوية كبيرة غالبا ما تكون موجودة في خلية في عدد نسخة منخفضة وتنقية يجب أن تكون فعالة للغاية وتحدث في ظل الظروف الفسيولوجية القريب لضمان الحفاظ على سلامة المعقدة. تنقية مجمع من مصدر وحيد الخلية هو تحديا من نوع خاص، ويمكن أن تكون باهظة من الناحية المالية. وهكذا، الاستراتيجيات أو الأساليب التي تتسم بالكفاءة وتسفر عن مجمع متجانسة والمطلوب للغاية.

استراتيجية التي كانتنجحت في تنقية المجمعات الأم من الخلايا حقيقية النواة لتوصيف الأولي هو جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات) طريقة ^2،3. وقد ابتكر طريقة TAP في البداية لتنقية البروتين الأصلي من الخميرة في مهدها (البيرة س) في مجمع مع التفاعل عامل (ق) ^2. الطريقة التونسية تستخدم علامات اثنين، كل بطاقة تنصهر فيها جنبا إلى جنب لنفس تسلسل الجينات المكودة للبروتين. وقد تم اختيار العلامات وذلك لتحقيق التوازن بين الحاجة إلى ضيق وانتقائية ملزمة لراتنج تقارب مع الرغبة في الحفاظ على قرب شروط حل الفسيولوجية. ويقدم التوازن للحفاظ على التفاعل مستقر (ق) من البروتين ذات الكلمات الدلالية مع التفاعل عامل (ق) لتوصيف ما بعد تنقية. وضعت علامة TAP أدرجت genomically في نهاية (C-النهائي) من الجين تشفير البروتين وتتكون من سلسلة الترميز لكالمودولين ملزم الببتيد (CBP) تليها البروتين أ - إضافة أكثر من مجرد 20 كيلو دالتون إلى الموسومة بروتين. الجمارك وحماية الحدود قصير، 26 والأحماض الأمينية، ومعترف بها من قبل ~ 17 كيلو دالتون بروتين كالمودولين (CAM) في وجود الكالسيوم مع K _D بناء على أمر من 10 ^-9 م ^4. العلامة البروتين وأكبر، تتكون من اثنين من يكرر من 58 بقايا مع رابط قصير بين يكرر. ومن المسلم به كل تكرار حمض 58 الأمينية التي كتبها المناعي G (مفتش) مع K _D ~ 10 ^-8 م ^5. بين هذه العلامات اثنين تأسست موقع تقديرا لTEV البروتيني، وببتيداز داخلية من فيروس التبغ إحفر ^6،7. كما هو موضح في الشكل رقم 1، في خطوة تقارب الأولى من طريقة برنامج المشورة التقنية الموسومة بروتين لا بد أن راتنج مفتش عبر البروتين ألف ومزال البروتين تصفها على عمود الانقسام على إضافة TEV البروتيني، الموقع تحديدا الشق بين العلامات اثنين. هذا هو خطوة ضرورية كما تفاعل مفتش والبروتين وقوي جدا ويمكن إلا أن يكون منزعجا بشكل كاف في ظل تغيير طبيعة الظروف الحل. تفتقر إلى العلاقات العامةotein علامة، لا بد من البروتين لراتنج كاميرا في وجود الكالسيوم ومزال من هذا الراتنج مع إضافة EGTA أيونات المعادن خالب (جلايكول الإثيلين حمض tetraacetic) (الشكل 1).

بعد فترة وجيزة، تم استخدام إدخال طريقة وات في دراسة على نطاق واسع لتوليد "الخريطة" من ​​التفاعلات المعقدة في س. الخباز ^8. الأهم من ذلك، نتيجة لهذا الجهد مكتبة بأكمله الخميرة TAP معلم المفتوحة القراءة الإطار (ORF)، وكذلك TAP الفردية الموسومة ORFS متاحة ⁹ من مصدر تجاري. وهكذا، يمكن للمرء الحصول على أي سلالة الخميرة مع بروتين الموسومة لأي مجمع الخميرة. كما حفزت طريقة TAP تعديلات أو تغيرات العلامة التونسية، بما في ذلك: استخدامه لتنقية المجمعات من حقيقية النواة الأخرى، وكذلك الخلايا البكتيرية ^10،11. وتصميم "علامة تقسيم"، حيث أن البروتين ألف والجمارك وحماية الحدود يتم وضعها على البروتينات المختلفة ^12؛ وتاتغيرت ع، وذلك لاستيعاب الحاجة للمحقق، مثل الحساسية من المجمع إلى الكالسيوم ²⁺ أو EGTA ^13.

وقد أدت التطورات الحديثة في كل من الأجهزة ومنهجية تقدما كبيرا في تطبيق المجهر الإلكتروني (EM) لتحديد هيكل، التي أدت إلى الأعلى، بالقرب الصور ذات الدقة الذرية المجمعات الجزيئات ^14. القرار الذي يمكن الحصول عليه من مجمع كتبها EM، ومع ذلك، لا يزال يتوقف على نوعية المجمع قيد الدراسة. وقد استخدمت هذه الدراسة المنهج العلامة التونسية لتنقية من س. الخباز وU1 snRNP، من 18 فرعية (~ 0.8 MDA) انخفاض عدد النسخ مجمع بروتين نووي ريبوزي التي هي جزء من التضفير ^15،16. وقد تم اتخاذ عدد من الخطوات لتنقية هذا المجمع بحيث متجانسة وذات تركيز كاف. ووصف المشاكل المحتملة التي تواجهها في مختلف مراحل تنقية واستراتيجيات إجراءات للتصدي challأبرزت enges. من خلال تقييم بعناية والاستفادة المثلى من الخطوات في تنقية، تنقية U1 snRNP هو من نوعية وكمية في مناسبة لوصمة عار السلبية والإلكترون المجهري البرد (البرد EM) الدراسات. يوصف بروتوكول طريقة TAP الأمثل لتنقية المجمعات الأم للدراسات الهيكلية هنا.

Protocol

ملاحظة: لقد ابتكر البروتوكول التالي لتنقية مجمع من 4 لتر من زراعة الخلايا، تقريبا الوزن 40 غ الرطب من الخلايا. مرة واحدة على استعداد، يجب أن يتم تخزين جميع المخازن في 4 درجات مئوية وتستخدم في غضون شهر من إعدادها. تضاف الحد من وكيل ومثبطات الأنزيم البروتيني فقط إلى مخازن فقط قبل استخدامها.

1. إعداد استخراج خلية كاملة عن جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

1. نمو س. خلايا خميرة
   1. خط الموسومة برنامج المشورة التقنية المطلوبة س. سلالة الخباز من التخزين (-80 درجة مئوية) في الصعود إلى سكر العنب الخميرة ببتون (YPD) لوحة. احتضان لمدة 3-5 أيام (30 درجة مئوية)، حتى تظهر خلايا الخميرة البيضاء ورقيق.
   2. تطعيم خط من حوالي 2 مم ² من خلايا جديدة من لوحة إلى 10 مل سائل الإعلام YPD في 50 مل أنبوب الطرد المركزي البولي بروبلين مخروطي الشكل. هز أنبوب في 180 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) بين عشية وضحاها (30M درجة مئوية).
   3. تطعيم 2 مل من فوقثقافة يلة لكل لتر من وسائل الإعلام YPD في 2 L مخروطي أو دورق مخروطي. هزة في 180 دورة في الدقيقة (30 درجة مئوية). مراقبة نمو الخلايا في كثافة ضوئية من 600 نانومتر (OD ₆₀₀₎ حتى مرحلة سجل في وقت متأخر، OD ₆₀₀ من 1،8-2، عادة 20-24 ساعة.
2. حصاد س. خلايا خميرة
   1. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 5400 x ج لمدة 15 دقيقة (4 درجة مئوية).
   2. صب بسرعة طاف والحفاظ على الخلايا عند 4 درجات مئوية أو على الجليد.
   3. تعليق كل ليتر من بيليه الخلية مع 2 مل المبردة الاحتياطي تحلل (10 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 300 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل؛ 0.2 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.0 و 5 ملي ايميدازول، ودرجة الحموضة 8.0 و 10٪ الجلسرين؛ 0.1٪ ضد NP-40 / ت). تعليق الخلايا عن طريق دوامات و / أو تكرار pipetting ليستخدم 10 مل الماصة المصلية.
      ملاحظة: أهمية NP-40 لأنها تتعلق يناقش جودة المعقدة وتحليل بعد تنقية أدناه.
   4. نقل تعليق خلية في فارغة 50 مل البولي بروبلين المخروطية أنبوب الطرد المركزي كEPT على الجليد. يغسل كل زجاجة الطرد المركزي مع 2 مل إضافية من الاحتياطي تحلل المبردة وإضافة إلى تعليق خلية في أنبوب 50 مل.
   5. تحديد الوزن الرطب للبيليه خلية وزنها عن طريق الأنبوب، وطرح وزن أنبوب فارغ فضلا عن الواق تحلل المضافة.
      ملاحظة: ليتر من زراعة الخلايا وجود OD ₆₀₀ من 1.8 حوالي 10 غرام.
   6. إنشاء حمام النيتروجين السائل في أنبوب 50 مل الطرد المركزي مخروطي البولي بروبلين. رسم الخلايا علقت في حقنة 5 مل. توصيل 16 G الإبرة إلى حقنة. تجميد تعليق خلية بتمريرها من خلال حقنة / إبرة لتوليد الخلايا "قطرات". وينبغي أن يكون معدل التجميد حوالي 1 دقيقة / مل.
   7. تخزين قطرات الخلايا المجمدة (-80 درجة مئوية) أو التوجه إلى تحلل.
3. الناشر خلايا والمحللة توضيح
   1. ليز خلايا الخميرة باستخدام طاحونة القهوة. خلايا ليز ثماني إلى تسع مرات مع 25 ثانية طحن رشقات نارية، في حين تهز جطاحونة offee. قبل استخدامها، قبل البرد طاحونة القهوة مع النيتروجين السائل. كل جولتين من طحن، إضافة طبقة ضحلة من النيتروجين السائل لطاحونة وتسمح له لتتبخر.
   2. اثارة مع النيتروجين ملعقة المبردة السائلة حسب الحاجة للحفاظ على الخلايا من تراكمها. أخذ الحيطة والحذر لمنع ذوبان الخلايا، مما يؤدي إلى تراكمها الخلية. يجب أن تظهر الخلايا على شكل مسحوق أبيض ناعم التالية تحلل. والحد الأقصى بيليه خلية من 4 لتر من الخميرة (~ 40 ز) يمكن أن يكون الأرض في وقت واحد.
      وتناقش ملاحظات بشأن طريقة تحلل أدناه: ملاحظة.
   3. تقييم درجة تحلل الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو بديل طريقة عد الخلايا. لتوفير تحليل كاف، أخذ العينات التالية: (1) قبل أن تحلل. (2) بعد أربع جولات من تحلل. و (3) بعد تحلل. للتحقق هذه العينات، تأخذ كمية صغيرة من الخلايا التي تحتوي على النيتروجين ملعقة المبردة السائلة ومكان في أنبوب 1.5 مل.
   4. وحالما يتم إذابة الخلايا، ماصة 5 ميكرولتر من الخلاياوتخلط مع 495 ميكرولتر المياه. إذا 40 - لوحظ 60٪ تحلل الخلايا، انتقل إلى الخطوة التالية في البروتوكول.
      وتناقش ملاحظات بشأن تأثير فترات طويلة من تحلل أدناه: ملاحظة.
   5. مرة واحدة لوحظ تحلل الكافي، مخزن هي lysed الخلايا (-80 درجة مئوية) أو الشروع في الخطوة التالية.
   6. إعداد اثنين من 50 مل البولي بروبلين المخروطية أنابيب الطرد المركزي كل منها 15 مل الاحتياطي تحلل، بما في ذلك 1 ملي phenylmethanesulfonyl فلوريد (PMSF)، 1 ملم dithiothreitol (DTT)، ومزيج المتاحة تجاريا من مثبطات الأنزيم البروتيني.
      ملاحظة: إذا لوحظ التحلل البروتيني كبير، والنظر في استخدام سلالة نقص الأنزيم البروتيني.
   7. استخدام النيتروجين السائل ملعقة المبردة لحلج القطن في مسحوق الخلايا هي lysed المجمدة في المعدة 50 مل أنابيب. إضافة مسحوق خلية / الصلبة تدريجيا إلى تحلل العازلة، التي تحتوي على حد سواء اختزال ومثبط البروتياز (ق).
   8. تدوير 50 ​​مل أنابيب بلطف على RT وذلك لذوبان الجليد / حل الخلايا، ولكن أيضا لمنع الفقاعات من تشكيل. اق مسحوق خلية / يذوب الصلبة، إضافة خلية إضافية الصلبة / مسحوق.
   9. شغل كل واحد منهما 50 مل الأنابيب حتى لديها كل ما يقرب من 20 غراما من الخلايا أو جميع الخلايا المضافة. مواصلة ذوبان الجليد / تذويب حتى لا توجد كتل الخلايا المجمدة التي لوحظت في 50 مل أنابيب. وهذا ينبغي أن يستغرق حوالي 50 دقيقة.
   10. الطرد المركزي الخلايا المحللة مع وقف التنفيذ لمدة 20 دقيقة في 25000 x ج (4 درجة مئوية). الخلايا هي lysed جيدا قد يحمل كمية صغيرة من راسب أسود.
   11. نقل 50 مل من طاف لالبولي الأنابيب فائقة الطرد المركزي (26.3 مل أنابيب المستخدمة) وإضافة 10 ميكرولتر 200 ملي PMSF إلى كل أنبوب الكامل.
   12. الطرد المركزي لمدة 1 ساعة على 100000 x ج (4 درجة مئوية). وينبغي أن تكون أربع طبقات واضحة، من أسفل إلى أعلى: (1) بيليه واضح من الصعب، وتحتوي على مجمعات الريباسي. (2) لينة بيليه غنية بالدهون. (3) واضحة طبقة صفراء مشوبة كبيرة تحتوي على أكثر من البروتينات والمجمعات القابلة للذوبان الخلية. و (4) في "وضيع" الطبقة العليا تتكون من الدهون.
   13. أداء جميع الصورةالخطوات التي تبعت في غرفة باردة (4 درجة مئوية). إزالة أكبر قدر من أعلى "وضيع" طبقة الدهون ممكن باستخدام 1 مل الماصة وتجاهل. استخدام 10 الماصة المصلية مل لاسترداد أكثر من الصفراء، طبقة واضحة.
   14. استرداد مل القليلة الماضية من هذه الطبقة باستخدام ماصة 1 مل لتجنب إزعاج أسفل طبقتين. من 40 ز خلية الرطب بيليه، ما يقرب من 48 مل من الطبقة المتوسطة عادة ما تعافى و 8 مل من طبقة الدهون إزالة / التخلص منها.
       ملاحظة: إن ما يعرقل تدفق تنقية العمود إلى حد كبير من وجود الدهون، والتي أيضا قد يقلل من جودة للمجمع، وناقش أدناه.

2. العمود تنقية الخطوة 1: مفتش اللوني

1. الراتنج موازنة والتجليد
   1. إعداد 300 ميكرولتر مفتش سيفاروز الطين لمدة 40 غرام من بيليه الخلية. قطع نهاية 1 مل طرف الماصة لتسهيل pipetting لالطين. غسل / تتوازن الراتنج مفتش ثلاث مرات، في كل مرة مع 5 مل IgGD150 العازلهص (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، 150 ملي بوكل، 1 ملم MgCl ₂ و 5 ملي ايميدازول، ودرجة الحموضة 8؛ 0.1٪ ت / ت NP-40؛ 1 ملم DTT، قرص مثبط البروتياز في 50 حجم مل).
      1. تدور لبيليه في 160 x ج (4 درجة مئوية) بين يغسل وإزالة طاف.
   2. تدوير الراتنج مفتش مع طاف المرحلة المتوسطة واثنين مصغرة أقراص مثبط البروتياز في 40 غرام من الخلايا، وذلك باستخدام المدورة المناسب، لمدة 2 ساعة (4 درجة مئوية). هذا هو الحل دفعة مفتش.
   3. إعداد كل منهما 10 مل الأعمدة بولي الإعدادية للاستخدام عن طريق خفض نهاية العمود لإنتاج قطع مسطح. إلى الإسراع في التعبئة وغسل العمود عن طريق تدفق الجاذبية، تحميل بحد أقصى 200 ميكرولتر من الراتنج مفتش معبأة أو ~ 25 مل من محلول دفعة مفتش لكل 10 مل العمود.
   4. من أجل حل دفعة مفتش في العمود والسماح لالرواسب بفعل الجاذبية. إذا الترسيب وقتا أطول من 30 دقيقة، وهناك على الأرجح كان تلوث الدهون عندما يتعافى المرحلة المتوسطة من ر الطرد المركزيubes.
   5. غسل العمود معبأة مع أربعة متتالية 10 مل حجم IgGD150 العازلة.
2. على الشق TEV العمود
   1. ختم الجزء السفلي من العمود وإضافة 1 مل من IgGD150 العازلة و 100 ميكرولتر من TEV البروتيني (0.6 ملغ / مل الأسهم، متحولة البديل S219V من TEV المنتجة في المنزل). ختم الجزء العلوي من العمود وتخلط لمدة 20 دقيقة (18 درجة مئوية) باستخدام خلاط الحراري، والهز في 750 دورة في الدقيقة. الراتنج و resuspend وتخلط مرة أخرى لمدة 20 دقيقة، كرر مرة أخرى ليصبح المجموع 1 ساعة الحضانة.
      ملاحظة: ومن الأهمية بمكان الحفاظ على الوقت من الحضانة إلى أدنى حد ممكن.
   2. العودة العمود إلى 4 درجات مئوية، وأزل البروتين / مجمع عن طريق الجاذبية. أزل القتلى حجم مع 200 ميكرولتر إضافية من IgGD150 العازلة.

3. العمود تنقية الخطوة 2: كالمودولين الانجذاب اللوني

1. الراتنج موازنة والتجليد
   1. إعداد 200 ميكرولتر من راتنج تقارب كالمودولين لكل 40 غراما من خليةبيليه. غسل الراتنج ثلاث مرات، في كل مرة مع 5 مل كالمودولين ملزم العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل، 1 ملم MgCl _2، ايميدازول 5 ملم، ودرجة الحموضة 8؛ 2 مم CaCl _2؛ 0.1 ٪ ت / ت NP-40؛ 10 ملم β-المركابتويثانول)، الطرد المركزي في 160 x ج (4 درجة مئوية) لتكوير عن كل غسل.
   2. لكل 1 مل مفتش شطافة، إضافة 3 مجلدات من كالمودولين الاحتياطي ملزم. للحفاظ على مستوى الكالسيوم ثابت، إضافة CaCl ₂ و β-المركابتويثانول لحساب لعدم وجود هذه المكونات في شطف مفتش. وينبغي أن تكون تركيزات النهائي 2 مم CaCl ₂ و 10 ملي β-المركابتويثانول.
   3. إضافة العينة إلى الراتنج كالمودولين وربط لمدة 1 ساعة (4 درجة مئوية) باستخدام محور دوار أنبوب.
2. التعبئة ويبلغ حجمه من كالمودولين الراتنج
   1. إعداد 2 مل العمود بولي الإعدادية في 100 ميكرولتر الطين كالمودولين بقطع نهاية العمود إلى إنشاء افتتاح شقة. تحميل ما لا يزيد عن 100 ميكرولتر كالمودولين الطين في التعاونlumn لتقليل كمية من الراتنج العينة يأتي في اتصال مع أثناء شطف.
   2. حزمة العمود عن طريق الجاذبية، ويغسل الراتنج في العمود ثلاث مرات مع 5 مل كالمودولين الاحتياطي ملزم.
   3. أزل البروتين مع إضافة 200 ميكرولتر كالمودولين شطف العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل، 1 ملم MgCl ₂ و 5 ملي ايميدازول، ودرجة الحموضة 8.0، 4 ملي EGTA، ودرجة الحموضة 8.0، 0.08٪ ضد / ت NP-40؛ 10 ملم β-المركابتويثانول). كرر ست مرات إضافة 200 ميكرولتر من كالمودولين شطف العازلة.
   4. لelutions 1-3، وتطبيق وحدة التخزين إلى عمود وجمع شطافة فورا. لشطف 4، وختم الجزء السفلي من العمود واحتضان مع شطف العازلة لمدة 2.5 دقيقة ثم فضها والسماح لأزل عن طريق الجاذبية. لشطف 5، واحتضان لمدة 5 دقائق ثم فضها وأزل. لشطف 6، واحتضان لمدة 10 دقيقة ثم فضها وأزل.
      ملاحظة: سلامة المجمع قد تختلف بين elutions / كسور (انظر القسم النتائج تمثيلي) <./ لى>
   5. Dialyze elutions 2-6 فردي بين عشية وضحاها باستخدام طريقة الغسيل الكلوي الجزئي المناسب. Dialyze الكسور ضد غسيل الكلى العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل، 1 ملم MgCl _2، ايميدازول 5 ملم، ودرجة الحموضة 8 و 10 ملي β-المركابتويثانول).
      ملاحظة: NP-40 لا يمر بشكل ملحوظ، على كل حال، من خلال الغشاء غسيل الكلى.

4. تحليلات ما بعد تنقية لتقييم الجودة مجمع

1. جل الأصلية والفضة تلطيخ
   1. إعداد 4-16٪ الجاهزة هلام الأصلي لتحليل مجمع وفقا لتعليمات من الشركة المصنعة. استخدام الجزيئي معيار الوزن البروتين المناسب وتحميل 15 ميكرولتر من كل من مدال كالمودولين شطف / كسور على هلام.
   2. Electrophorese هلام في 150 V لحوالي 3 ساعات (4 درجة مئوية).
   3. الفضة وصمة عار في هلام لتقييم جودة كل من elutions ستة. بدلا من ذلك، استخدم التجارية حساسة على قدم المساواةوصمة عار فلوري (الصورة). في هذه المرحلة، وتركيز المجمع هو الأكثر احتمالا أقل من مستوى الكشف عن Coomassie تلطيخ الأزرق.
2. جل إضافية طرق التحليل
   1. للكشف عن البروتين قبل الغرب النشاف، حل تعقيدا SDS أو PAGE الأم ومن ثم تحقيق في جل للحاتمة كالمودولين ملزم الببتيد (CBP) باستخدام الأجسام المضادة العلامة التونسية وفقا لتعليمات من الشركة المصنعة.
   2. باستخدام وصمة الفلورسنت معينة (ق)، وتأكد من وجود وسلامة من البروتين و / أو الحامض النووي في TAP تنقية معقدة. الحرص على أن يتم الكشف عن أي تداخل الطيفي بين هذه البقع.
3. سلبي التصور وصمة عار المجهر الإلكتروني
   1. استخدام شبكات الكربون مستمرة يتوهج تفريغها في -15 مللي أمبير لمدة 30 ثانية، في غضون 30 دقيقة من تطبيق المعقدة.
   2. تطبيق 3 ميكرولتر من TAP تنقية مجمع (عادة بتركيز 1 نانومتر) إلى الشبكة. احتضان لمدة دقيقة واحدة. وصمة عار وROM جانب الشبكة لإزالة عازلة الزائد.
   3. يغسل مرتين مع 20 قطرات ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. وصمة عار الجانب بين يغسل.
   4. تطبيق الشبكة ل50 ميكرولتر سلبي قطرة وصمة عار واحتضان لدقيقة. ويوصى تلطيخ مع خلات اليورانيل (2٪) أو فورمات اليورانيل (0.75٪).
      تحذير: أملاح اليورانيل والحلول المشعة ضعيفة وتحتوي على المعادن الثقيلة. يجب التعامل مع هذه الرعاية وجميع المواد التي تأتي في اتصال مع ضرورة التخلص من النفايات باتباع المبادئ التوجيهية الموصى بها المؤسسية هذه الحلول.
   5. تطبيق شبكة لالطازجة 50 ميكرولتر انخفاض صمة عار السلبية، دون النشاف. احتضان لدقيقة، ثم وصمة عار الجانب، وأخيرا الهواء الجاف وتصور.
4. البرد المجهر الإلكتروني (البرد EM) التصور
   1. أداء كرو-EM مع TAP تنقية معقدة، على الرغم الأمثل قد يكون من الضروري، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      ملاحظة: وجود المنظفات في ارتفاع تركيزات أماهذ تعيق التقدم، وتتم مناقشته أدناه.

5. تخزين مجمع

1. إعداد مجمع لتخزين
   1. التركيز على مجمع، إذا لزم الأمر، وذلك باستخدام فلتر الطرد المركزي وجود الوزن الجزيئي قطع المناسب للمجمع. تدور في 14000 x ج لمدة 1 دقيقة الزيادات حتى يتم التوصل إلى التركيز المطلوب.
      ملاحظة: سيتم تركيز NP-40 زيادة في التركيز خلال التركيز، لأنها لا تمر عبر فلتر ولا غسيل الكلى غشاء.
   2. تجميد فلاش المجمع في 30 مكل في النيتروجين السائل أو الثلج الجاف تبريد حمام الإيثانول ثم تخزين في -80 درجة مئوية.
2. اختياري إزالة ما بعد تنقية منظفات

ملاحظة: وجود المنظفات مثل NP-40 وبتركيز أعلى من أن تركيزه مذيلة حرجة قد تعوق أو تمنع التقدم لبعض التطبيقات. عواقب زواله من بروتووتناقش العقيد وكذلك استبدال مع إضافات أخرى أو شارك في المذيبات أدناه. إذا كان المطلوب لا NP-40، وهو خيار هو استخدام التطبيق التجاري لإزالة، على سبيل المثال بيو الخرز.

1. قبل تتوازن المتاحة تجاريا المنظفات استيعاب حبات في غسيل الكلى العازلة. مزيج خمس حبات في 30 ميكرولتر من مجمع (عادة في 10 تركيز نانومتر).
2. احتضان حبات معايرتها من الخطوة 5.2.1 مع TAP مجمع تنقيته لمدة 15 دقيقة على الجليد. استخدام المجمع في غضون ساعات قليلة بعد إزالة المنظفات.

النتائج

وقد استخدمت طريقة TAP تعديل لتنقية من س. الخباز وU1 snRNP، وهو بروتين نووي ريبوزي مجمع 18 فرعية. لتنقية TAP الأولية للمجمع بعد ^2،3 بروتوكول نشر أسفرت مجمع الذي ظهر غير متجانسة، يهاجرون إلى ثلاثة فرق على الفضة الملون هلام بولي أكريلاميد الأصلي ...

Discussion

الطريقة التونسية تستخدم علامات اللذين تحقيق التوازن بين الحاجة إلى ضيق وانتقائية ملزمة لراتنج تقارب مع الرغبة في الحفاظ على قرب شروط حل الفسيولوجية. ويقدم التوازن للحفاظ على التفاعل مستقر (ق) من البروتين ذات الكلمات الدلالية مع التفاعل عامل (ق) لتوصيف ما بعد تنقية. و?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S. cerevisiae TAP tagged strain	Open Biosystems	YSC1177	This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6
Coffee grinder	Mr. Coffee	IDS77	Used for cell lysis
Hemocytometer, Bright Line	Hausser Scientific	3120	Used to assess cell lysis
JA 9.100 centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to harvest the yeast cells
JA 20 fixed-angle centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material
Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to further clear the soluble cell extract
Thermomixer	Eppendorf	R5355	Temperature controlled shaker
Novex gel system	Thermo Fisher Scientific
IgG resin	GE Healthcare	17-0969-01	Sepharose 6 fast flow
Calmodulin resin	Agilent Technologies, Inc.	214303	Affinity resin
Protease inhibitor cocktail, mini tablets	Sigma Aldrich	589297	Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets
Protease inhibitor cocktail, large tablets	Sigma Aldrich	5892953	cOmplete ultra EDTA-free tablets
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)			Dissolved in isopropanol
2 ml Bio-spin column	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7326008	Used to pack and wash the Calmodulin resin
10 ml poly-prep column	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7311550	Used to pack and wash the IgG resin
Precast native PAGE Bis-Tris gels	Life Technologies	BN1002	Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels
NativeMark protein standard	Thermo Fisher Scientific	LC0725	Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μl for a silver stained gel and 5 μl for a SYPRO Ruby stained gel
Precast SDS PAGE Bis-Tris gels	Life Technologies	NP0321	Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels
PageRuler protein standard	Thermo Fisher Scientific	26614	Unstained protein standard used for Western blotting
SDS running buffer	Life Technologies	NP0001	1x NuPAGE MOPS SDS Buffer
TAP antibody	Thermo Fisher Scientific	CAB1001	Primary antibody against CBP tag
Secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	31341	Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated
BCIP/NBT	Thermo Fisher Scientific	34042	5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium
Dialaysis units	Thermo Fisher Scientific	88401	Slide-A-Lyzer mini dialysis units
Centrifugal filter units, 100kDa MWCO	EMD Millipore	UFC5100008	Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane
Detergent absorbing beads	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1523920	Bio-bead SM-2 absorbants
SYBR Green II	Thermo Fisher Scientific	S-7564	Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S-12000	Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm
Copper grids	Electron Microscopy Sciences	G400-CP