本机配合物的净化对结构研究使用串联亲和标签法

摘要

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

摘要

亲和纯化的方法已经成功地分离出原生复合蛋白质组学表征。结构的异质性和一定程度的复杂的成分异质性通常不妨碍进行这种研究的进展。与此相反，用于结构表征的复合应是既在组成和结构上均匀的，以及在比所需的蛋白质组学更高浓度的状态下进行纯化。最近，一直在电子显微镜的应用的大型大分子复合物结构的决心显著的进步。这加剧了利益的方法通过电子显微镜净化足够数量和质量结构测定天然复合物。串联亲和纯化（TAP）的方法进行了优化，提取和纯化的18亚基，从〜芽殖酵母0.8丙二醛核蛋白组件（ 酿酒酵母）

引言

许多主要的细胞过程是由大的蛋白质和蛋白质-RNA复合物¹进行。一个显著瓶颈进行这种复合物的生物物理和结构研究是获得并在适当浓度的合适的质量（ 即 ，均匀性）它们。从天然来源隔离一个复杂的具有许多优点，包括护亚单位的相关转录后和/或翻译后修饰和投保适当的复杂的装配。然而，大蜂窝络合物以低拷贝数通常存在于细胞和纯化必须高效和近生理条件下发生，以确保复杂的完整性。来自真核来源纯化络合物是特别具有挑战性的，并且可以在经济上令人望而却步。因此，是有效率和产生均匀复杂的策略或方法是高度期望的。

这种策略已经成功地从净化真核细胞的天然复合物为他们的初步定性是串联亲和纯化（TAP）的方法^2,3。该方法TAP最初设计在复杂的纯化由芽殖酵母（ 酿酒酵母）天然蛋白与之交互因子^（S）2。该方法TAP利用了两个标签，串联融合到同一个蛋白质编码基因序列的每个标签。被选择的代码，以便平衡需要紧和选择性结合的亲和树脂，以保持接近生理溶液条件的愿望。这种平衡的作用是保持与净化后的特征相互作用的因子（S）标签蛋白的稳定的相互作用（S）。的基因组引入的TAP标记被放置在末端（C-末端）的蛋白质编码基因的和由一个序列编码的钙调蛋白结合肽（CBP），随后通过蛋白A的 - 加成刚刚超过20千道尔顿到标签蛋白。 CBP短，26个氨基酸，并通过识别的〜17 kDa蛋白钙调素在钙的存在下用K _的D 10 ^-9量级M ⁴上。蛋白A标记是较大，由58残两个重复与重复之间的短连接体。每58个氨基酸重复由免疫球蛋白G（IgG）的用K _D〜10 ^-8 M ⁵识别。这两个标记之间成立的TEV蛋白酶，从烟草蚀纹病毒^6,7内肽酶的识别位点。 如图1所示，在TAP标记蛋白的方法的第1亲和性步骤经由蛋白A的标记的蛋白质是由在加入TEV蛋白酶，位点特异性之间切割的洗脱上柱裂解绑定至IgG树脂这两个标签。这是一个必要的步骤为IgG的互动和蛋白A是非常强的，只能解变性的条件下得到充分的扰动。由于缺乏公关otein一个标记，该蛋白质结合到CaM的树脂在钙的存在下，并从该树脂与另外的金属离子螯合剂EGTA（乙二醇四乙酸）（ 图1）的洗脱。

引进TAP方法，它在一个大规模研究用于生成不久后，"地图"在S.复杂的相互作用酵母 ^8。重要的是，作为这种努力的整个酵母-TAP标记开放阅读框（ORF）库的结果，以及个别的TAP标记的ORF ⁹是可从商业来源。因此，可以得到具有为任何酵母复杂的标签化蛋白质的任何酵母菌株。在TAP方法还刺激了修改或在TAP标记的变体，其中包括:其用于从其它真核以及细菌细胞^10,11配合物的纯化使用;一个"拆分标签"，其中蛋白质A和CBP被放置在不同的蛋白质¹²的设计;和TAGS改变，以便容纳研究者的需要，如复合物^的 Ca ²⁺或EGTA ¹³的灵敏度。

在这两个仪器和方法学的最新进展已经导致了结构确定在电子显微镜（EM）的应用显著的进步，已导致高，接近大分子复合¹⁴的原子分辨率的图像。通过获得EM复杂的分辨率，但是，仍然在研究中的复杂的质量而定。这项研究利用了TAP标签的方式从S.净化酵母 U1的核蛋白，18亚基（〜0.8 MDA）低拷贝数核糖核蛋白复合物，是剪接体^15,16的一部分。一些已采取步骤以纯化这种复合物，例如，它是均匀的和适当的浓度。在纯化的各阶段中遇到的潜在问题被描述，并采取克服CHALL策略恩格斯强调。通过仔细评估和净化优化步骤中，U1核蛋白纯化是适用于负染色和电子显微镜冷冻（冷冻电镜）研究数量质量和。用于结构研究天然复合物的纯化的优化TAP方法协议在本文中描述。

研究方案

注意:下面的协议被设计为一个复杂的纯化从4升细胞培养物，细胞的大约40克湿重。一旦制备，所有缓冲区应储存在4℃并且在一个月它们的制备中使用。还原剂和蛋白酶抑制剂仅加入缓冲液在使用前。

1.全细胞提取的制备串联亲和纯化

1. S.生长酵母细胞
   1. 连胜所需的TAP标记S.酵母菌株从存储器（-80°C）到酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）板。孵育3 - 5天（30°C），直到酵母细胞出现白色蓬松。
   2. 接种约2mm从板的新鲜细胞的²条纹到10ml的YPD培养基的50ml锥形聚丙烯离心管中。摇动该管以每分钟180转（rpm）过夜（30米℃）。
   3. 接种将2ml超过每升YPD媒体的夜间文化在2升锥形或锥形瓶中。摇匀，以180rpm（30°C）。监测在600nm（OD _600）的光密度的细胞生长，直至晚对数期，1.8的OD ₆₀₀为2时，典型地为20 - 24小时。
2. 收获S.酵母细胞
   1. 收获细胞，离心5,400×g离心15分钟（4℃）。
   2. 迅速倒出上清液，并保持细胞在4℃或冰上。
   3. 暂停用2ml冷却裂解缓冲液每升细胞沉淀（10毫摩尔Tris-HCL，pH8.0中; 300mM NaCl的10毫米氯化钾; 0.2毫摩尔EDTA，pH值8.0; 5mM咪唑，pH值8.0; 10％甘油; 0.1％体积/体积的NP-40）。通过涡旋和/或使用10ml的血清吸管重复移液悬浮细胞。
      注意:NP-40的重要性，因为它涉及到复杂的质量和纯化后的分析在下面讨论。
   4. 细胞悬液转移到一个空的50ml锥形聚丙烯离心管组合EPT冰上。洗每个离心瓶中用另外2毫升冷却裂解缓冲液，并加入到细胞悬浮液中的50ml管中。
   5. 通过称量管和减去空管的重量以及增加的裂解缓冲液确定细胞沉淀的湿重。
      注:升具有外径为1.8 ₆₀₀的细胞培养的约为10克
   6. 创建在50ml锥形聚丙烯离心管中的液态氮浴中。绘制悬浮的细胞加到5毫升注射器。一个地下16针连接到注射器。使其通过注射器/针头以产生细胞冷冻细胞悬浮液"液滴"。冷冻的速率应为约1分钟/毫升。
   7. 储存冷冻细胞液滴（-80℃），或进行裂解。
3. 裂解细胞和裂解液澄清
   1. 裂解用咖啡研磨机的酵母细胞。裂解细胞八至九倍25秒磨阵阵，一阵晃动的C奥菲磨床。在使用前，预冷却用液氮的咖啡研磨机。每两轮研磨，加液氮浅层的磨床，并允许它蒸发。
   2. 以维持细胞凝集用液氮冷却的刮刀搅拌。一定要小心，防止细胞，这可能会导致细胞聚集的解冻。细胞应出现如下裂解细的白色粉末。来自4 L酵母培养物（〜40克）的最大细胞沉淀可以同时被粉碎。
      注意:关于裂解的方法观察在下面讨论。
   3. 评估细胞裂解使用血球或替代细胞计数法的程度。为了提供足够的分析，采取以下样品:（1）裂解之前; （2）经过四轮裂解;和（3）下列裂解。检查这些样品，取细胞的少量用在1.5ml管中的液态氮冷却的刮刀和地点。
   4. 一旦细胞被解冻，吸管5微升细胞并用495微升水混合。如果40 - 观察细胞的60％溶解，继续在该协议下一个步骤。
      注意:对于裂解的长时间的影响观测在下面讨论。
   5. 一旦足够的裂解观察到，卖场裂解细胞（-80℃）或进行下一步。
   6. 制备两个50毫升锥形聚丙烯离心各用15毫升裂解液管，其中1毫苯甲基磺酰氟（PMSF），1mM的二硫苏糖醇（DTT），和蛋白酶抑制剂的市售的鸡尾酒。
      注意:如果发现显著蛋白水解，可考虑使用蛋白酶缺陷菌株。
   7. 使用液态氮冷冻铲冷冻裂解细胞粉舀入准备好的50ml试管。逐步增加的细胞粉/固体的裂解液，含有还原剂和蛋白酶抑制剂（S）。
   8. 旋转50ml试管轻柔地在RT以便解冻/溶解的细胞，也能防止气泡的形成。一个S中的细胞粉/固体溶解，增加额外的电池固体/粉末。
   9. 填写每两个50毫升管，直到每个人都有大约20g细胞或添加所有单元格。继续解冻/溶解，直到有在50ml试管没有观察到冷冻的细胞团块。这大约需要50分钟。
   10. 离心20分钟，悬浮细胞裂解物以25,000rpm XG（4℃）。良好的溶解的细胞可表现出黑色沉淀物的量小。
   11. 转移50ml的上清液以聚碳酸酯超离心管（用于26.3毫升管），并加入10微升200毫米PMSF每个全管。
   12. 离心以100,000 xg离心（4℃）1小时。四层应该是可见的，从底部到顶部:（1）硬颗粒清晰，含有核糖体复合物; （2）软富含脂质的沉淀; （3）含有大部分细胞的可溶性蛋白和复合物的大透明黄色色彩的层;和（4）'鳞屑"顶层组成的脂质。
   13. 执行所有特殊在冷室（4℃）ubsequent步骤。使用1毫升移液管除去尽可能多的顶部的"鳞片状"脂质层尽可能的并丢弃。用10毫升血清吸管收回大部分黄色，层次清晰的。
   14. 使用1毫升吸移管以避免扰乱底部两层恢复的最后几毫升该层。由40克湿细胞沉淀，约48毫升中间层的典型回收和8毫升脂质层的去除/丢弃。
       注:柱纯化流由脂质，其也可以降低该复合物的质量的存在极大地阻碍了，在下面讨论。

2.柱纯化步骤1:IgG的色谱

1. 树脂平衡和绑定
   1. 准备一个300微升的IgG琼脂糖浆40 G细胞颗粒。剪下1毫升枪头年底，以方便移液浆料。洗涤/平衡IgG的树脂三次，每次用5ml IgGD150 BuffeR（10毫摩尔Tris-HCL，pH8.0中; 150毫摩尔NaCl; 150毫氯化钾; 1mM的MgCl ₂的; 5mM咪唑，pH值8; 0.1％体积/体积的NP-40; 1毫摩尔DTT;每50蛋白酶抑制剂片剂毫升体积）。
      1. 旋在160的洗涤之间XG（4℃）沉淀并除去上清。
   2. 旋转的IgG树脂与中间相上清液，每40 G细胞两个迷你蛋白酶抑制剂的片剂，使用适当的旋转器，2小时（4℃）。这是在IgG的批量溶液。
   3. 通过切割色谱柱末端产生平砍准备用两个10 ml聚预习列。为了加快通过重力流柱的填料和洗涤，装入一个最大的打包的IgG树脂的200微升或约25mL每10 ml柱IgG的批量溶液。
   4. 倾IgG的批量溶液进入塔，并允许通过重力沉降。如果沉降超过30分钟的时间较长，有回收从离心机T中的中间阶段时，最有可能是脂质污染ubes。
   5. 有四个连续10毫升卷IgGD150缓冲液洗填充柱。
2. 在列TEV切割
   1. 密封柱的底部并加入1毫升IgGD150缓冲液和100微升TEV蛋白酶的（0.6毫克/毫升的库存，TEV的突变体变体S219V产生的内部）。密封该塔的顶部并混合使用热混合器中，在750rpm下摇动20分钟（18℃）。悬浮树脂和再次混合20分钟，重复一次，共1小时温育。
      注意:这是关键的，以保持温育的时间为最小。
   2. 返回列至4℃并通过重力洗脱蛋白/复合物。洗脱死体积增加200微升IgGD150缓冲。

3.柱纯化步骤2:钙调蛋白亲和层析

1. 树脂平衡和绑定
   1. 制备每40 G细胞的200μl的钙调素亲和树脂的沉淀。洗树脂三次，每次用5ml钙调蛋白结合缓冲液（10mM的Tris-HCl，pH值8.0; 150毫摩尔NaCl; 10毫氯化钾; 1mM的MgCl ₂的; 5mM咪唑，pH值8; 2毫米氯化钙_2; 0.1 ％体积/体积的NP-40; 10毫β巯基乙醇）中，在160 xg离心（4℃）离心以沉淀每次洗涤。
   2. 为了将每1ml的IgG洗脱液，加入3卷钙调素结合缓冲液。为了保持血钙水平不变，加入_氯化钙和β巯基乙醇占缺乏IgG的洗脱这些成分。终浓度应在2毫米氯化钙₂和10mMβ巯基乙醇。
   3. 样品添加到钙调素树脂和绑定使用的管旋转1小时（4℃）。
2. 包装和钙调蛋白树脂洗脱
   1. 通过切割列的端部创建一扁平开口制备每100μl的钙调素的浆液2ml的聚制备柱。每加载合作不超过100微升钙调蛋白浆液lumn尽量减少树脂样品的量来在洗脱过程中接触。
   2. 包通过重力柱并三次用5ml钙调素结合缓冲液洗涤树脂在列。
   3. 洗脱蛋白并加入200微升钙调素的洗脱缓冲液（10mM的Tris-HCl，pH值8.0的150毫摩尔NaCl; 10毫氯化钾; 1mM的MgCl ₂的; 5mM咪唑，pH值8.0; 4毫EGTA，pH 8.0的0.08％体积/ v的NP-40; 10毫β巯基乙醇）。重复加入200微升钙调素洗脱缓冲液六次。
   4. 为洗脱1〜3中，应用量给列和立即收集洗脱液。洗脱4，密封该塔的底部，并与洗脱缓冲液孵育2.5分钟，然后启封，并允许通过重力洗脱。用于洗脱5，孵育5分钟，然后启封和洗脱。用于洗脱6，孵育10分钟，然后启封和洗脱。
      注:复杂的完整性可能洗脱液之间变化/分数（见代表性的结果节）<。/ LI>
   5. 透析洗脱2至6隔夜单独使用合适的微透析法。透析针对透析缓冲液的级分中（10mM的Tris-HCl，pH值8.0; 150毫摩尔NaCl; 10毫氯化钾; 1mM的MgCl ₂的; 5mM咪唑，pH值8; 10毫β巯基乙醇）。
      注意:NP-40不会明显通过，如果在所有通过透析膜。

4.后净化分析，评估综合素质

1. 天然凝胶银染
   1. 制备4 - 16％预制天然凝胶的配合物作为每从制造商的指示进行分析。使用每个透析钙调素的洗脱/级分的合适的分子量蛋白质标准和负载15微升到凝胶。
   2. Electrophorese在150V凝胶为约3小时（4℃）。
   3. 银染色凝胶，以评估各六个洗脱液的质量。另外，使用同样敏感的商业荧光染色（多个）。在这个阶段中，配合物的浓度是最有可能低于检测为考马斯蓝染色的水平。
2. 附加凝胶分析方法
   1. 为了检测通过蛋白质印迹蛋白，解决通过SDS或变性PAGE复杂，然后探测用的TAP标记抗体作为每从制造商的说明进行钙调蛋白结合肽（CBP）的表位的凝胶。
   2. 使用特定的荧光染料（S），确认在TAP纯化复杂的存在和蛋白质和/或核酸的完整性。采取这些污物间没有检测到的频谱重叠照顾。
3. 负染电子显微镜可视化
   1. 使用连续碳网格辉光放电在-15毫安，持续30秒，复杂的应用的30分钟之内。
   2. （通常在1nM的浓度）应用3微升的TAP纯化复杂的给电网。孵育一分钟。印迹˚FROM网格的一侧，以除去过量的缓冲。
   3. 用的去离子水20微升滴洗两次。洗涤之间边印迹。
   4. 应用网格50微升负染色下降，孵育一分钟。推荐染色醋酸铀（2％）或铀酸盐（0.75％）。
      注意:盐铀和解决方案是弱放射性和含有重金属。这些应该谨慎，并附带在这些解决方案应处置以下机构推荐废物准则的接触的材料进行处理。
   5. 应用网格到一个新的50微升负染下降，无印迹。孵育一分钟，然后一边印迹，最后空气干燥和可视化。
4. 低温电子显微镜（冷冻电镜）可视化
   1. 与TAP纯化复杂执行冷冻电镜，虽然优化可能是必要的，根据制造商的协议。
      注:洗涤剂存在高浓度马Ÿ阻碍进步和下面讨论。

5.复杂的存储

1. 准备对复杂存储
   1. 浓缩复合物，如果需要的话，使用具有合适分子量截断的复杂的离心过滤器。在14000 XG 1分钟为增量旋转达到所需的浓度为止。
      注意:NP-40浓度将浓缩过程中的浓度增加，因为它不通过过滤器，也不透析膜。
   2. 闪存冻结在液氮或干冰30微升等分复杂的冷却乙醇浴，然后在-80℃保存。
2. 洗涤剂的可选的后去除净化

注意:去污剂例如NP-40，并在高于其临界胶束浓度可能妨碍或抑制对于一些应用进展的浓度存在。其去除从原后果栏以及与其它添加剂或共溶剂替换在下面讨论。如果没有NP-40是需要的，一个方法是使用用于去除一个商业应用，例如生物珠。

1. 在透析缓冲液预均衡市售洗涤剂吸收珠。混合每络合物30微升5珠（通常以10nM浓度）。
2. 来自步骤5.2.1在冰上15分钟的TAP纯化复杂孵育平衡珠。除去洗涤剂的以下几个小时之内使用复杂的。

结果

使用了改良的方法TAP从S.净化酵母 U1的核蛋白，18亚基核糖核蛋白复合体。公布的协议^2,3以下复杂的初始的TAP纯化，得到一个复合物，出现异类，迁移作为银三个频带染色天然聚丙烯酰胺凝胶（ 图2A）。在TAP方法的优化的多轮，产生了迁移，主要是一个单波段上指示更均匀组件（ 图2A）的天然凝胶的配合物。用荧光染料染色为...

讨论

该TAP方法利用两个标签来平衡需要严格和选择性的结合到亲和树脂保持接近生理溶液条件的愿望。这种平衡的作用是保持与净化后的特征相互作用的因子（S）标签蛋白的稳定的相互作用（S）。此外，个别的TAP标记的ORFs可从商业来源，这样就可以得到具有为任何酵母复杂的标签化蛋白质的任何酵母菌株。保留的复合物的完整性和资源，以测试在用于纯化的复杂使用不同标记的蛋白质亚基的可用性?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
S. cerevisiae TAP tagged strain	Open Biosystems	YSC1177	This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6
Coffee grinder	Mr. Coffee	IDS77	Used for cell lysis
Hemocytometer, Bright Line	Hausser Scientific	3120	Used to assess cell lysis
JA 9.100 centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to harvest the yeast cells
JA 20 fixed-angle centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material
Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to further clear the soluble cell extract
Thermomixer	Eppendorf	R5355	Temperature controlled shaker
Novex gel system	Thermo Fisher Scientific
IgG resin	GE Healthcare	17-0969-01	Sepharose 6 fast flow
Calmodulin resin	Agilent Technologies, Inc.	214303	Affinity resin
Protease inhibitor cocktail, mini tablets	Sigma Aldrich	589297	Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets
Protease inhibitor cocktail, large tablets	Sigma Aldrich	5892953	cOmplete ultra EDTA-free tablets
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)			Dissolved in isopropanol
2 ml Bio-spin column	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7326008	Used to pack and wash the Calmodulin resin
10 ml poly-prep column	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7311550	Used to pack and wash the IgG resin
Precast native PAGE Bis-Tris gels	Life Technologies	BN1002	Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels
NativeMark protein standard	Thermo Fisher Scientific	LC0725	Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μl for a silver stained gel and 5 μl for a SYPRO Ruby stained gel
Precast SDS PAGE Bis-Tris gels	Life Technologies	NP0321	Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels
PageRuler protein standard	Thermo Fisher Scientific	26614	Unstained protein standard used for Western blotting
SDS running buffer	Life Technologies	NP0001	1x NuPAGE MOPS SDS Buffer
TAP antibody	Thermo Fisher Scientific	CAB1001	Primary antibody against CBP tag
Secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	31341	Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated
BCIP/NBT	Thermo Fisher Scientific	34042	5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium
Dialaysis units	Thermo Fisher Scientific	88401	Slide-A-Lyzer mini dialysis units
Centrifugal filter units, 100kDa MWCO	EMD Millipore	UFC5100008	Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane
Detergent absorbing beads	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1523920	Bio-bead SM-2 absorbants
SYBR Green II	Thermo Fisher Scientific	S-7564	Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S-12000	Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm
Copper grids	Electron Microscopy Sciences	G400-CP