Bir Tandem Affinity Etiket Yöntemiyle Yapısal Çalışmaları Yerli Komplekslerinin saflaştırılması

Özet

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

Özet

Affinity arıtma yaklaşımları proteomik karakterizasyonu için yerli kompleksleri izole başarılı olmuştur. Yapısal heterojenite ve bir kompleksin kompozisyon heterojen bir derecesi genellikle bu tür çalışmalar yürüten ilerleme engel olmaz. Bunun aksine, yapısal karakterizasyon için amaçlanan bir kompleksi hem de içerik olarak ve yapısal olarak homojen olarak proteomik için gerekli olandan daha yüksek bir konsantrasyonda bir halde arındırılmalıdır. Son zamanlarda, büyük makromoleküler kompleksler yapı tayini için elektron mikroskobu uygulamasında önemli ilerlemeler olmuştur. Bu elektron mikroskobu ile yapısal tespiti için yeterli nicelik ve nitelikte yerli kompleksleri arındırmak için yaklaşımlar ilgi artırmıştır. Tandem Affinity Arıtma (TAP) yöntemi 18-altbirim ayıklamak ve arındırmak için optimize edilmiştir, ~ tomurcuklanan maya 0.8 MDa ribonükleoprotein montaj (Saccharomyces cerevisiae)

Giriş

Birçok önemli hücresel süreçler büyük protein ve protein-RNA kompleksleri ¹ tarafından gerçekleştirilmektedir. Bu tür komplekslerin biyo-fiziksel ve yapısal çalışmaları yapmak için önemli bir engel, uygun bir kalite (yani, homojen) ve uygun bir konsantrasyonda onları elde edilir. doğal bir kaynağından, bir kompleks izole alt birimlerin ilgili transkripsiyon sonrası ve / veya translasyonel modifikasyonlar tutma ve uygun karmaşık bir düzenlemesini sigortalanması dahil olmak üzere birçok avantajı vardır. Ancak, büyük hücre kompleksleri düşük kopya sayısında sık sık, bir hücrede mevcut olan ve arıtma için yüksek verimli olması ve karmaşık bütünlüğü korunmasını sağlamak için, yaklaşık olarak fizyolojik koşullar altında gerçekleştirilmelidir. bir ökaryotik kaynaktan bir kompleks Arındırıcı özellikle zor ve mali engelleyici olabilir. Bu nedenle, verimli ve homojen bir kompleks elde stratejileri veya yöntemleri çok arzu edilir.

olmuştur bir stratejionların ilk karakterizasyonu için ökaryotik hücrelerden yerli kompleksleri arındırıcı başarılı Tandem Affinity Arıtma (TAP) yöntemi ^2,3 olduğunu. TAP yöntemde, faktör (ler) ² etkileşim ile kompleks olarak çiçek mayası (S. cerevisiae) bir yerli proteini saflaştırmak için geliştirilmiştir. TAP yöntem iki etiket, aynı protein kodlayıcı gen sekansına tandem kaynaşık her etiket kullanılmaktadır. Sıkı ve seçici fizyolojik çözelti Koşullar korumak için bir arzu bir afinite reçineye bağlanmak için bir ihtiyaç dengelemek üzere etiketler seçilmiştir. Bu denge sonrası arıtma karakterizasyonu için faktör (ler) etkileşime ile etiketli protein istikrarlı etkileşimi (ler) korumak için hizmet vermektedir. etiketli biraz üzerinde 20 kDa'lık bir ek - genomik dahil TAP etiketi sonunda yerleştirildi ve protein kodlama geninin (-terminal, C) Protein A ve ardından peptit (CBP) bağlanması bir kalmodülin kodlayan bir sekans oluşuyordu protein. CBP 2, kısa6 amino asit ve tanıdığı ~ 17 kDa proteini Kalmoduline 10 ^-9 sırasına M ⁴ bir _KD ile kalsiyum mevcudiyetinde (CAM). Protein bir etiket tekrarlar arasında kısa bir bağlayıcı ile 58 kalıntıları arasında, iki tekrarlardan meydana gelen daha büyüktür. Her 58 amino asit tekrar K _D ~ 10 ^-8 M ⁵ ile immünoglobulin G (IgG) tarafından kabul edilmektedir. Bu iki etiketin arasında TEV proteaz, Tütün Etch Virüsü ^6,7 arasında bir endopeptidaz için bir tanıma sitesi dahil edilmiştir. TAP protein etiketli yöntemin birinci afinite aşamasında Şekil 1 'de gösterildiği gibi, etiketli protein TEV proteaz, özellikle de site arasındaki yaran ilave üzerinde kolon bölünmesine elüe edilir Protein A ile bir IgG reçineye bağlı iki etiketleri. Bu IgG etkileşimi olarak gerekli bir adımdır ve Protein Çok güçlü ve sadece yeterli denatüre çözüm koşullarında tedirgin olabilir. Bir Pr eksikBir etiket otein protein kalsiyumun varlığında cam reçinesine bağlanır ve metal iyonu kenetleyici, EGTA (etilen glikol tetraasetik asit) (Şekil 1) ek olarak, bu reçineden yıkandı.

TAP yönteminin tanıtılması, bu üretmek için büyük çaplı bir çalışmada kullanılan kısa bir süre sonra bir S. karmaşık etkileşimlerin 'harita' cerevisiae ^8. Daha da önemlisi, bir bu çabanın tüm maya-TAP Etiketli Açık Okuma Çerçevesi (ORF) kütüphane sonucu yanı sıra bireysel TAP olarak ⁹ ticari bir kaynaktan temin edilebilir ORF etiketledi. Bu nedenle, tek bir herhangi bir maya kompleksi için etiketli bir protein ile bir maya suşu elde edebilir. TAP yöntemi de dahil olmak üzere, tadilatları ya da TAP etiketinin varyasyonları, teşvik: diğer ökaryotik hem de bakteri hücreleri ^10,11 komplekslerin saflaştırılması için kullanımı; Protein A ve CBP farklı proteinler ¹² üzerine yerleştirildiği bir "bölünmüş" etiketine, tasarımı; ve taBöyle Ca ²⁺ veya EGTA ¹³ kompleksin duyarlılık olarak, araştırmacının ihtiyacı karşılamak amacıyla gs değişti.

Her iki enstrümantasyon ve metodoloji son gelişmeler makromoleküler kompleksleri ¹⁴ atom çözünürlüklü görüntülerden yakın, yüksek yol açmıştır yapı tayini için elektron mikroskobu (EM) uygulamasında önemli ilerlemelere yol açmıştır. EM bir kompleks elde çözünürlük, ancak, çalışma kapsamında kompleksinin kalitesi üzerine şarta kalır. Bu çalışma S'den arındırmak için TAP etiketi yaklaşımını kullanmaktadır cerevisiae U1 snRNP, spliceosom ^15,16 bir parçası olan bir 18-alt-birimi (-0.8 MDA), düşük kopya sayısı ribonükleoprotein kompleksi. bir dizi adım bu homojen ve yeterli bir konsantrasyon olacak şekilde bu karmaşık saflaştırmak için alınmıştır. arıtma için çeşitli aşamalarında karşılaşılan potansiyel problemler açıklanmıştır ve stratejiler Chall aşmak için alınanEnges vurguladı. dikkatle değerlendirilmesi ve saflaştırma adımları optimize ederek, U1 snRNP saflaştırılmış bir kalite ve olumsuz leke için uygun ve elektron mikroskopisi cryo (cryo-EM) çalışmaları bir miktarda yer almaktadır. Yapısal çalışmalar için yerel komplekslerinin saflaştırılması için optimize edilmiş bir TAP yöntemi protokolü, burada tarif edilmektedir.

Protokol

Not: Aşağıdaki protokol hücre kültürünün 4 L, hücrelerin yaklaşık 40 g ıslak ağırlık bir kompleks saflaştırılması için geliştirilmiştir. Hazırlandıktan sonra, bütün tamponlar, 4 ° C'de saklanır ve bunların hazırlanması ve bir ay içinde kullanılmalıdır. İndirgeme maddesi ve proteaz inhibitörleri, sadece kullanımdan hemen önce tampon eklenir.

Tandem afinite temizliği için tam hücre özütünün hazırlanması 1.

1. S. Büyüme cerevisiae hücreleri
   1. Streak istenen TAP S. etiketli cerevisiae cinsi depolama (-80 ° C) bir maya pepton dekstroz üzerine (YPD) plaka. maya hücreleri ve beyaz kabarık görünene kadar, 5 gün boyunca (30 ° C) - 3 inkübe edin.
   2. 50 mL.lik bir konik propilen santrifüj tüpü içinde 10 mi YPD ortamı içine plaka taze hücre yaklaşık olarak 2 mm bir ² çizgi inoküle. dakikada 180 devir (rpm) bir gecede (° C 30m) tüp sallayın.
   3. over 2 ml aşılamak2 L'lik Erlenmeyer veya konik bir şişe içinde YPD ortamı litre başına gece kültürü. 180 rpm'de (30 ° C) çalkalanır. - 24 saat, eski kütük fazı kadar 2 1.8 OD _600, tipik olarak 20 ile 600 nm (OD ₆₀₀₎ bir optik yoğunlukta hücre büyümesini izlemek.
2. Hasat S. cerevisiae hücreleri
   1. santrifüj ile hasat hücreler 15 dakika boyunca (4 ° C) 5,400 xg'de.
   2. Hızla süpernatant süzün ve 4 ° C'de veya buz üzerinde hücreleri tutun.
   3. Liziz Tamponu soğutulmuş 2 ml hücre peleti, her litre Askıya (10 mM Tris-HCI, pH 8.0; 300 mM NaCI, 10 mM KCI, 0.2 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM imidazol, pH 8.0;% 10 gliserol;% 0.1 h / h NP-40). dönen ve / veya tekrar pipet 10 ml serolojik pipet kullanarak hücreleri Askıya.
      Not: NP-40 önemini kompleks kalite ve post-arıtma analizi aşağıda ele alınmıştır ile ilgilidir.
   4. Boş 50 ml konik polipropilen santrifüj tüpü k içine hücre süspansiyonu aktarınBuz üzerinde EPT'nin. soğutulmuş lizis tamponu ek olarak 2 ml, her bir santrifüj yıkama şişesi ve 50 ml bir tüp içinde hücre süspansiyonu ekleyin.
   5. tüp tartı ve boş tüpün ağırlığını çıkararak yanı sıra ilave Lizis Tampon ile hücre pelet ıslak ağırlığını belirlemek.
      Not: OD 1.8 ₆₀₀ olan hücre kültüründen bir litrelik yaklaşık 10 gramdır.
   6. 50 mL.lik bir konik propilen santrifüj tüpü içinde bir sıvı azot banyosu oluşturur. 5 ml'lik bir şırınga içine süspansiye edilmiş hücreler çizin. şırıngaya 16 G iğne bağlayın. Hücre oluşturmak için şırınga / iğne ile geçirilerek hücre süspansiyonu dondurma "damlacıkları". dondurma oranı, yaklaşık 1 dakika / ml olmalıdır.
   7. Donmuş hücre damlacıkları saklayın (-80 ° C) veya lizis geçin.
3. Hücrelerin eritilmesi ve lizat Açıklama
   1. Lyse bir kahve değirmeni kullanarak maya hücreleri. c çalkalanırken 25 sn, patlamaları taşlama ile lyse hücreleri sekiz dokuz kereoffee değirmeni. Kullanımdan önce, sıvı azot ile birlikte kahve değirmeni önceden soğuk. öğütme Her iki tur, öğütücü sıvı azot sığ bir katman ekleyin ve buharlaşması için izin verir.
   2. topaklanma hücreleri tutmak için gerekli bir sıvı azot soğutulmuş spatula ile karıştırın. Hücre topaklanma neden olabilir hücrelerin çözülme önlemek için dikkatli olun. Hücreler, aşağıdaki ince beyaz bir toz olarak görünmelidir. Maya kültürü (~ 40 g) 4 L bir maksimum hücre peleti aynı anda zemin olabilir.
      Not: liziz yöntemi ile ilgili gözlemler aşağıda tartışılmaktadır.
   3. Bir hemasitometre veya alternatif hücre sayım yöntemi kullanılarak hücre parçalama derecesini değerlendirin. Yeterli bir analiz sağlamak için, aşağıdaki örnekleri almak: (1) lizis önce; (2) lizis dört tur sonra; ve (3) lisizini takiben. Bu örnekleri kontrol etmek için, 1.5 ml bir tüp içinde bir sıvı azot soğutulmuş spatula ve yer ile hücrelerin küçük bir miktar alır.
   4. hücre hücreler çözündürüldü sonra pipet 5 ulve 495 ul su ile karıştırın. 40 - eğer hücrelerin% 60 erimesi görülmektedir, protokolde bir sonraki adıma geçin.
      Not: lizis uzun süre etkisi ile ilgili gözlemler aşağıda ele alınmıştır.
   5. Bir kez yeterli lizis görülmektedir, mağaza parçalanmış hücreleri (-80 ° C) veya bir sonraki adıma geçin.
   6. 1 mM fenilmetansülfonil florit (PMSF), 1 mM ditiotreitol (DTT) ve proteaz inhibitörleri ticari olarak temin edilebilen bir kokteyl içeren 15 mi liziz tamponu ile her biri iki 50 ml konik propilen santrifüj tüpü hazırlayın.
      Not: önemli proteoliz görülürse, bir proteaz eksik suşu kullanımını düşünün.
   7. hazırlanan 50 ml tüpler içinde dondurulmuş Parçalanan hücre tozu kepçe için bir sıvı azot soğutulmuş ıspatula ile yapılır. indirgeyici ve proteaz inhibitörü (lar) hem de içeren, Lizis Tamponu kademeli olarak katı hücre tozu / ekleyin.
   8. Çözülme olarak / şekillendirme kabarcıklarını engellemek için de hücrelerin erimesi, ama çok nazikçe oda sıcaklığında 50 ml tüpler döndürün. birHücre toz / katı erir, ek hücreye katı / tozu ekleyin s.
   9. Her biri yaklaşık 20 hücre g veya ilave tüm hücreleri sahip olana kadar iki kez 50 ml tüpler her doldurun. 50 ml tüpler gözlenen donmuş hücre kümeleri vardır kadar çözülme / çözülmesini devam edin. Bu yaklaşık 50 dakika sürer.
   10. 25,000 xg (4 ° C) 'de 20 dakika süre ile süspansiyon haline hücre lizat santrifüj. İyi lize hücreler, siyah bir çökelti az miktarda sergileyebilir.
   11. ultra santrifüj tüpleri (kullanılan 26.3 mi tüpler) polikarbonat ve her tam bir tüpe 10 ul 200 mM PMSF ilave süpernatant 50 ml aktarın.
   12. 100,000 x g'de (4 ° C) 1 saat süre ile santrifüj. Dört katmanları üst alttan, görünür olmalıdır: (1) sert açık pelet, ribozomal kompleksleri içeren; (2) Yumuşak lipid bakımından zengin pelet; (3) hücre çözünür proteinler ve komplekslerinin en ihtiva eden bir büyük, açık san bir hafif boyanmış tabakası; ve (4) bir 'pullu' üst tabaka lipidlerin oluşturduğu.
   13. Tüm s gerçekleştirinSoğuk oda (4 ° C) ubsequent adım. 1 ml pipet kullanarak mümkün olduğunca üst 'pullu' lipit tabakasının kadar çıkarın ve atın. sarı, berrak tabakanın en kurtarmak için 10 ml serolojik pipet kullanın.
   14. Alt iki tabaka rahatsız etmemek için 1 ml bir pipet kullanarak bu katmanın son birkaç ml kurtarma. 40 g ıslak hücre topağından, orta tabakanın, yaklaşık 48 mi, tipik olarak geri kazanılır ve lipid tabakasının 8 mi atılır / çıkarıldı.
       Not: Sütun arıtma akışı büyük ölçüde aşağıda ele, aynı zamanda karmaşık kalitesini düşürebilir lipidlerin, varlığı ile engellenmektedir.

2. Sütun Arıtma adım 1: IgG Kromatografi

1. Reçine Dengeleme ve Bağlama
   1. Hücre topağı 40 g için 300 ul IgG Sepharose bulamaç hazırlanır. bulamaç pipetleme kolaylaştırmak için 1 ml pipet ucu sonu kesin. Yıkama / 5 mi IgGD150 Buffe IgG, reçineyi üç defa, her seferinde dengeR (10 mM Tris-HCI, pH 8.0; 150 mM NaCI; 150 mM KCI, 1 mM _MgCI2, 5 mM imidazol, pH 8;% 0.1 h / h NP-40, 1 mM DTT, 50 her bir proteaz inhibitörü tablet ml hacim).
      1. Spin yıkar arasında 160 xg (4 ° C) pelet ve süpernatant kaldırmak için.
   2. 2 saat (4 ° C), uygun bir rotator kullanılarak orta safha süpernatan ve hücrelerin 40 gramı başına iki mini proteaz inhibitör tabletleri ile IgG reçine döndürün. Bu, IgG toplu bir çözümdür.
   3. Düz kesilmiş üretilmesi için kolonun son kesim tarafından kullanılmak üzere iki adet 10 ml poli-preparatif sütun hazırlayın. yerçekimi akışı ile sütunun paketleme ve yıkama hızlandırmak için, ~ 10 mi kolon başına IgG parti çözeltisine 25 mL, 200 paketlenmiş IgG reçine ul veya daha düşük bir maksimum yük.
   4. sütuna IgG toplu çözüm dökün ve yerçekimi ile tortu izin verin. sedimantasyon 30 dakika daha uzun sürerse santrifüj t orta faz kurtarırken, büyük olasılıkla lipit kontaminasyonu olduUBE.
   5. IgGD150 Tamponu dört ardışık 10 ml'lik hacim ile kaplanmış kolon yıkayın.
2. Sütun TEV bölünmesine
   1. Sütunun alt conta ve IgGD150 1 ml tampon TEV proteaz, 100 ul (0.6 mg / ml stok, TEV mutant varyantı S219V içi üretilen). Sütunun üst kapatılır ve 20 dakika boyunca (18 ° C) 750 rpm'de çalkalanarak, termal bir mikser kullanılarak karıştırılır. Yeniden süspanse Reçine 1 saat inkübasyon olmak üzere toplam tekrar 20 dakika boyunca bir kez daha fazla karıştırıp.
      Not: en az fırınlama süresi kalması açısından çok önemlidir.
   2. 4 ° C'ye sütun dönün ve yerçekimi ile protein / kompleksi Zehir. IgGD150 Tamponu ilave 200 ul ölü hacim Zehir.

3. Kolonu Saflaştırması Adım 2: Kalmoduline Afinite Kromatografisi

1. Reçine Dengeleme ve Bağlama
   1. Hücrenin 40 g başına kalmodülin-afınite reçine 200 ul hazırlanmasıpelet. 150 mM NaCI, 10 mM KCI, 5 mi Kalmoduline Tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, bağlama ile, reçineyi üç defa, her seferinde yıkayın 1 mM _MgCl2, 5 mM imidazol, pH 8; 2 mM _CaCl2 0.1 hac / hac% NP-40, 10 mM β-merkaptoetanol), 160 xg (4 ° C) santrifüje her bir yıkama için pelet.
   2. her biri 1 mi IgG eluatına, Bağlama Tamponu kalmodulin 3 cilt. Sürekli kalsiyum seviyesini korumak için, _CaCl2 ve β-merkaptoetanol IgG elüsyon bu bileşenlerin olmaması için hesap ekleyin. Nihai konsantrasyon 2 mM _CaCl2 ve 10 mM β-merkaptoetanol olmalıdır.
   3. Kalmodulin reçineye örnek ekleyin ve bir tüp rotator ile 1 saat (4 ° C) bağlanır.
2. Paketleme ve Calmodulin Reçine yıkanan
   1. Düz açılış oluşturmak için sütunun sonuna keserek 100 ul Calmodulin bulamaç başına 2 ml poli-hazırlık sütun hazırlayın. co başına en fazla 100 ul Calmodulin bulamaç yükleyinörnek reçine miktarını en aza indirmek için lumn elüsyon sırasında temas.
   2. yerçekimi tarafından sütunu Paketi ve 5 ml Calmodulin Bağlama Tamponu ile sütunda üç kez reçine yıkayın.
   3. 150 mM NaCI, 10 mM KCI, 1 mM _MgCI2, 5 mM imidazol, pH 8.0, 4 mM EGTA, pH 8,0;% 0.08 h 200 ul Kalmoduline, Seyreltme Tampon maddesi (10 mM Tris-HCI, pH 8.0 ilavesi ile proteinini ayrıştırmak / hac NP-40, 10 mM β-merkaptoetanol). Calmodulin Elüsyon Buffer 200 ul altı kez eklenmesini tekrarlayın.
   4. elüsyon 1 ila 3 için, sütun hacmi uygulamak ve hemen eluat toplar. elüsyon 4, sütunun alt conta ve 2.5 dakika boyunca yıkama tamponu ile inkübasyon ve daha sonra açmak ve yerçekimi ile elüte sağlar. elüsyon için 5, 5 dakika boyunca inkübe edilir ve akabinde açmak ve elüte. elüsyon 6 için, 10 dakika süre ile inkübe edilir ve daha sonra açmak ve elüte.
      Not: karmaşık bütünlüğü elüsyon arasında değişebilir / kesirler (temsilcisi sonuçları bölümüne bakınız) <./ Li>
   5. elüsyon 2 ayrı gecede uygun bir mikro diyaliz yöntemi kullanarak 6 dialyze. Diyaliz tamponu karşı fraksiyonların Dialyze (10 mM Tris-HCI, pH 8.0; 150 mM NaCI, 10 mM KCI, 1 mM _MgCI2, 5 mM imidazol, pH 8, 10 mM β-merkaptoetanol).
      Not: NP-40 diyaliz zarı ile, hiç değilse, kayda değer geçmez.

4. Post-Arıtma Analizleri Kompleks kalitesini değerlendirmek için

1. Yerli Jel ve Gümüş Boyama
   1. üreticinin talimatlarına göre kompleksin analizi için% 16 prekast yerli jel - 4 hazırlayın. jel üzerine diyaliz Kalmoduline elüsyon / parçalardan her biri, uygun bir molekül ağırlığına sahip protein standardı ve yük 15 ul kullanın.
   2. Yaklaşık 3 saat (4 ° C), 150 V de jel Electrophorese.
   3. Gümüş, altı elüsyon her kalitesini değerlendirmek için jel leke. Alternatif olarak, eşit hassas ticari kullanımıfloresan leke (ler). Bu aşamada, kompleksin konsantrasyonu Mavi Coomassie lekelemesi için saptama seviyesinin altında en olasıdır.
2. Ek Jel Analiz Yöntemleri
   1. Western blot protein tespit etmek için SDS veya yerel PAGE ile kompleks çözmek ve daha sonra üreticinin talimatlarına uygun olarak TAP etiketi antikor kullanarak Calmodulin Binding Peptide (CBP) epitop için jel prob.
   2. Belirli bir floresan boya (lar) kullanılarak, TAP saflaştınldı karmaşık varlığı ve protein ve / veya nükleik asit bütünlüğünü onaylamak. Hiçbir spektral örtüşme bu lekeler arasında tespit edildiği dikkat ediniz.
3. Negatif Leke Elektron Mikroskobu Görselleştirme
   1. Karmaşık uygulama 30 dakika içinde, parlayan taburcu 30 saniye boyunca -15 mA sürekli karbon ızgaraları kullanın.
   2. ızgaraya (tipik olarak 1 nM'lik bir konsantrasyonda) TAP saflaştınldı kompleks 3 ul uygulanır. Bir dakika boyunca inkübe. Leke fFazla tampon kaldırmak için ızgaranın yan rom.
   3. iyonu giderilmiş su, 20 ul damlalar ile iki kez yıkanır. yıkar arasında yan leke.
   4. 50 ul negatif leke damlasına kadar ızgara uygulayın ve bir dakika inkübe edilir. uranil asetat (% 2) ya da uranil format (% 0.75) ile boyama önerilir.
      Dikkat: Uranil tuzları ve çözümleri zayıf radyoaktif ve ağır metal içermez. Bu bakım ve kurumsal önerilen atık yönergeleri izleyerek atılmalıdır bu çözümler ile temas tüm malzeme ile ele alınmalıdır.
   5. blot olmadan taze bir 50 ul negatif leke damlasına kadar ızgara uygulayın. Bir dakika sonra yan blot inkübe ve nihayet kuru hava ve görselleştirmek.
4. Cryo Elektron Mikroskobu (cryo-EM) Görselleştirme
   1. optimizasyon gerekli olabilir ama üreticinin protokolüne göre, TAP saflaştınldı kompleksi ile kriyo-EM gerçekleştirin.
      Not: deterjan Durum yüksek konsantrasyonlarda ma aty ilerlemeyi engelleyen ve aşağıda ele alınmıştır.

5. Karmaşık depolama

1. Depolama Kompleks hazırlanıyor
   1. Gerekirse kompleks için uygun bir molekül ağırlığı kesmesi olan bir santrifüj filtre kullanılarak, karmaşık konsantre edilir. İstenilen konsantrasyon ulaşana kadar 1 dk artışlarla 14,000 xg'de Spin.
      Not: Filtre, ne de diyaliz zarından geçmez olarak NP-40 konsantrasyonu, konsantre sırasında konsantrasyon artacak.
   2. Sıvı nitrojen ya da kuru buz içinde 30 ul alikotları kompleksi etanol banyosu soğutulur dondurma ve daha sonra -80 ° C'de saklayın.
2. Deterjan İsteğe Sonrası Arıtma Kaldırma

Not: NP-40 gibi engelleyebilir veya bazı uygulamalar için ilerleme inhibe kritik misel konsantrasyonu yukarıda bir konsantrasyonda bir deterjanın varlığında. proto onun kaldırılması sonuçlarıDiğer Katkı maddeleri veya ortak-çözücü ile sütun hem de yerine aşağıda ele alınmaktadır. Resim NP-40 isteniyorsa, bir seçenek, örneğin Bio-boncuk, kaldırılması için, ticari bir uygulama kullanmaktır.

1. Diyaliz tampon maddesi içinde önceden dengelenir ticari olarak temin edilebilen bir deterjan emici boncuklar. (Genellikle 10 nM konsantrasyonda) kompleksinin 30 ul başına beş boncuk karıştırın.
2. Buz üzerinde 15 dakika musluk saflaştınldı kompleksi ile Aşama 5.2.1 arasında dengelenmiş boncuk inkübe edin. deterjan çıkarılmasını takiben bir kaç saat içinde karmaşık kullanın.

Sonuçlar

Değiştirilmiş bir TAP yöntemi S'den saflaştırmak için kullanıldı U1 snRNP, 18 alt birim ribonükleoprotein kompleksi cerevisiae'de. Yayınlanmış bir protokol ^2,3 takiben kompleksin bir başlangıç ​​TAP saflaştırma gümüş üç grup ana poliakrilamid jel (Şekil 2A) boyanmış şekilde göç heterojen çıktı bir kompleks elde edilmiştir. TAP yönteminin optimizasyonu birden fazla tur, daha homojen bir montaj

Tartışmalar

TAP yöntemi sıkı ve seçici fizyolojik çözelti Koşullar korumak için bir arzu bir afinite reçineye bağlanmak için bir dengelemeye iki etiket kullanılmaktadır. Bu denge sonrası arıtma karakterizasyonu için faktör (ler) etkileşime ile etiketli protein istikrarlı etkileşimi (ler) korumak için hizmet vermektedir. Buna ek olarak, bireysel TAP biri herhangi bir maya kompleksi için etiketli protein ile herhangi bir maya suşu elde edebilirsiniz, böylece Orfs, ticari bir kaynaktan temin edilebilen etiketle...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
S. cerevisiae TAP tagged strain	Open Biosystems	YSC1177	This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6
Coffee grinder	Mr. Coffee	IDS77	Used for cell lysis
Hemocytometer, Bright Line	Hausser Scientific	3120	Used to assess cell lysis
JA 9.100 centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to harvest the yeast cells
JA 20 fixed-angle centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material
Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to further clear the soluble cell extract
Thermomixer	Eppendorf	R5355	Temperature controlled shaker
Novex gel system	Thermo Fisher Scientific
IgG resin	GE Healthcare	17-0969-01	Sepharose 6 fast flow
Calmodulin resin	Agilent Technologies, Inc.	214303	Affinity resin
Protease inhibitor cocktail, mini tablets	Sigma Aldrich	589297	Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets
Protease inhibitor cocktail, large tablets	Sigma Aldrich	5892953	cOmplete ultra EDTA-free tablets
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)			Dissolved in isopropanol
2 ml Bio-spin column	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7326008	Used to pack and wash the Calmodulin resin
10 ml poly-prep column	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7311550	Used to pack and wash the IgG resin
Precast native PAGE Bis-Tris gels	Life Technologies	BN1002	Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels
NativeMark protein standard	Thermo Fisher Scientific	LC0725	Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μl for a silver stained gel and 5 μl for a SYPRO Ruby stained gel
Precast SDS PAGE Bis-Tris gels	Life Technologies	NP0321	Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels
PageRuler protein standard	Thermo Fisher Scientific	26614	Unstained protein standard used for Western blotting
SDS running buffer	Life Technologies	NP0001	1x NuPAGE MOPS SDS Buffer
TAP antibody	Thermo Fisher Scientific	CAB1001	Primary antibody against CBP tag
Secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	31341	Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated
BCIP/NBT	Thermo Fisher Scientific	34042	5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium
Dialaysis units	Thermo Fisher Scientific	88401	Slide-A-Lyzer mini dialysis units
Centrifugal filter units, 100kDa MWCO	EMD Millipore	UFC5100008	Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane
Detergent absorbing beads	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1523920	Bio-bead SM-2 absorbants
SYBR Green II	Thermo Fisher Scientific	S-7564	Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S-12000	Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm
Copper grids	Electron Microscopy Sciences	G400-CP