JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

Abstract

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 °C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 °C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.

Introduction

منزل الأذن معهد-الجهاز كورتي 1 تستمد (HEI-OC1) خلايا من الجهاز السمعي من 1،2 الماوس المعدلة وراثيا. حضانة أي خلية من هذا الفأر وراثيا في 33 ° C / 10٪ CO 2 (شروط متساهلة) يستحث تعبير عن الجينات تخليد الذي يقوم بتشغيل دي التمايز وتسارع انتشار. تحريك الخلايا إلى 39 ° C / 5٪ CO 2 (ظروف غير متساهلة) تؤدي إلى انخفاض انتشار، والتمايز، وعلى الأقل في حالة من مؤسسات التعليم العالي-OC1، موت الخلايا 2،3.

تم استنساخ خلايا التعليم العالي-OC1 وتميزت في المختبر لدينا منذ أكثر من عشر سنوات، وأشارت الدراسات الأولية أنها تعبير عن علامات معينة من خلايا الشعر قوقعة، مثل prestin، الميوسين 7A، Atoh1، عامل التغذية العصبية، calbindin وكالمودولين، ولكن أيضا علامات من دعم خلايا مثل connexin 26 و نمو الخلايا الليفية مستقبلات عامل (جمعية جيل المستقبل-R) 2. لذلك، اقترح أن مؤسسات التعليم العالي-OC1 يمكن أن تمثل commoن السلف للخلايا الحسية ودعم من جهاز كورتي 2. قدمت دراسات موازية أدلة قوية على أن التوراتية المخدرات السامة مثل سيسبلاتين، جنتاميسين والستربتومايسين التي يسببها كاسباس 3 التنشيط في هذه الخلايا، في حين لم المخدرات تعتبر غير سامة للأذن، مثل البنسلين، وليس 2،3. لذلك، اقترح هذا الخط الخلية كنظام في المختبر للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية تشارك في تسميم أذني وللفحص من احتمال التسمم الأذني أو خصائص otoprotective العقاقير الدوائية الجديدة. وتشير التقديرات إلى أن الخلايا مؤسسات التعليم العالي-OC1 استخدمت في أكثر من مائة وخمسين دراسة نشرت في السنوات العشر الماضية.

في حين تبحث في التأثير المحتمل الموالية لأفكارك من الأدوية المختلفة كان الهدف الرئيسي لمعظم الدراسات التي تنطوي على هذا الخط الخلية، عمليات الخلية الهامة الأخرى مثل الالتهام الذاتي والشيخوخة قد بدأت لتوها إلى التحقيق في زنازين مؤسسات التعليم العالي-OC1 4-7. أنانا دراسة حديثة من مختبرنا 8، استخدمنا خلايا التعليم العالي-OC1 لجمع مجموعة شاملة من البيانات عن موت الخلايا والبقاء والانتشار، الشيخوخة والالتهام الذاتي الناجم عن العقاقير الدوائية المختلفة التي يكثر استخدامها في العيادة. نحن أيضا مقارنة بعض استجابات الخلايا مؤسسات التعليم العالي-OC1 مع تلك من كلوة-293 (خلايا الكلى الجنينية البشرية) وهيلا (خلايا الظهارية البشرية) يتلقون العلاج متطابقة. وأشارت النتائج التي توصلنا إليها خلايا التعليم العالي-OC1 تستجيب إلى كل دواء بطريقة مميزة، مع dose- مميزة والحساسية تعتمد على الوقت واحدة على الأقل من آليات قيد الدراسة. أكدنا أيضا في هذه الدراسة أن التفسير الصحيح للنتائج التجريبية سوف يتطلب إجراء دراسات موازية مع تقنية أكثر من 8.

وفي دراسة مختلفة ونحن التحقيق في استخدام الخلايا مؤسسات التعليم العالي-OC1 لتقييم الاستجابة الوظيفية لprestin، البروتين السيارات من خلايا الشعر الخارجي قوقعة (OHCs) 9 . أبلغنا التدفق الخلوي ودراسات المسح المجهري ليزر متحد البؤر على نمط من التعبير prestin، وكذلك السعة غير الخطية (NLC) والدراسات لقط خلية التصحيح كلها في الخلايا مؤسسات التعليم العالي-OC1 مثقف في متساهلة (P-HEI-OC1) وغير متساهلة (NP-HEI-OC1) الظروف. وأشارت النتائج التي توصلنا إليها كل من إجمالي التعبير prestin وغشاء البلازما زيادة توطين بطريقة تعتمد على الوقت في الخلايا NP-HEI-OC1. ومن المثير للاهتمام، وجدنا أيضا أن الزيادة في توطين prestin في الغشاء البلازمي للخلايا NP-HEI-OC1 المترابطة مع انخفاض في نا + K + أتباز، التي translocated من غشاء البلازما إلى السيتوبلازم دون تغييرات كبيرة في إجمالي التعبير الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، أثبتنا أن الخلايا P-HEI-OC1 لها مؤتمر العمل النيجيري القوي المرتبطة prestin الوظائف الحركية، والتي انخفضت عندما زادت كثافة جزيئات prestin الحاضرة في غشاء البلازما. وإجمالا، فإن هذه النتائج تدعم بقوة فائدة مؤسسات التعليم العالي-OC1 خلايا للتحقيق البروتينات السمعية.

في هذه المقالة الفيديو وصفنا كيفية الثقافة خلايا التعليم العالي-OC1، لماذا أنها مريحة لاستخدام خلايا تنمو في الظروف متساهلة (P-HEI-OC1) للدراسات السمية الخلوية، وكيفية تقييم آلية / ثانية للخلايا المخدرات التي يسببها وكيف إجراء دراسات الكهربية (على سبيل المثال، والتصحيح، المشبك، والسعة غير الخطية (NLC)) للتحقيق في الخصائص الفنية للprestin، المحرك الجزيئي للOHCs القوقعة.

Protocol

1. خلية ثقافة

ملاحظة: جميع البروتوكولات الخلية زراعة يجب أن يؤديها باستخدام تقنيات زراعة الخلايا السليمة (للاشارة رؤية 3 الفصول الأولى من بيولوجيا الخلية: دليل المختبر، المجلد الأول 10). خلايا التعليم العالي-OC1 لا تتطلب أي طلاء إضافي أو العلاج من الأطباق ثقافة الخلية لتمسك السليم والنمو. هام جدا: لا تستخدم الأطباق الزجاجية لأغراض زراعة الخلايا. والنمط الظاهري والاستجابة البيولوجية للخلايا للعقاقير الدوائية تغيير (G & F Kalinec Kalinec، غير منشورة). ينصح أطباق زراعة الخلايا البلاستيكية التقليدية (انظر جدول المواد / المعدات). إيلاء اهتمام خاص لتقنيات العقيم لتجنب التلوث، ولكن أبدا استخدام المضادات الحيوية (مثل الأمبيسلين أو الستربتومايسين) مع خلايا التعليم العالي-OC1. إذا لزم الأمر، استخدم أمفوتيريسين B. بينما استخدمت هيلا وكلوة-293 الخلايا عن السيطرة في الدراسات السابقة مع مؤسسات التعليم العالي-OC1 8، يمكن أي خط خلية أخرىيكون مقبولا لهذا الغرض.

  1. إحياء الخلايا المجمدة مؤسسات التعليم العالي-OC1
    ملاحظة: يمكن أيضا أن هذا البروتوكول استخدامها مع خطوط الخلايا الأخرى من نفس الماوس المعدلة وراثيا وضعت في المختبر لدينا، مثل OC-K3، من جهاز كورتي 11،12، وSV-K1، من السطر الوعائي 13،14.
    1. إزالة قارورة من الخلايا مؤسسات التعليم العالي-OC1 cryopreserved من السائل N 2، ووضعه في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. يغرق فقط في النصف السفلي من القارورة، والسماح لها بالعودة الى طبيعتها حتى لا يبقى سوى كمية صغيرة من الجليد في القارورة. مسح خارج القارورة مع 70٪ من الكحول.
    2. ماصة الخلايا من القارورة وتسليم كامل حجم (~ 1.5 × 10 5 خلية / مل) ببطء، قطرة قطرة، إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل تحتوي على 10 مل من متوسط ​​النمو قبل تحسنت، مثل Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر ( DMEM)، على أن تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS).
    3. إزالة DMSO بواسطة الطرد المركزي في أنبوب 300-500 x ج لمدة 5 دقائق، ونبذ رانه طاف وإعادة تعليق الخلايا في 9 مل من متوسط ​​النمو الطازجة (DMEM + 10٪ FBS). تفصيل كتل أو ألواح من الخلايا عن طريق تدفق والجزر من الخلايا مع وقف التنفيذ، من ماصة إلى المتوسطة، والعكس بالعكس، ثلاث إلى أربع مرات مع غيض من ماصة لمس الجزء السفلي من الأنبوب.
    4. وضع الحجم الكلي للخلايا معلقة في وسط النمو في غير المعالجة أطباق زراعة الخلايا ملم قطرها 100، البلاستيكية.
    5. احتضان الخلايا عند 33 درجة مئوية مع 10٪ CO 2 (شروط متساهلة).
  2. ثقافة فرعية من الخلايا مؤسسات التعليم العالي-OC1
    ملاحظة: قبل التقاء (~ 80٪) أن يوجه الخلايا في تعليق ودون مثقف من أجل منع ثقافة الموت. ويمكن أيضا أن هذا البروتوكول أن تستخدم مع خطوط أخرى الخلية وضعت في مختبرنا من نفس الماوس المعدلة وراثيا، مثل OC-K3، من جهاز كورتي 11،12، وSV-K1، من السطر الوعائي 13،14.
    1. إزالة المتوسطة من العمر وغسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني.
    2. تغطية أحادي الطبقة الخلية بمحلول مكون من 0.25٪ التربسين، وذلك باستخدام 1 مل لكل 25 سم 2 من مساحة السطح. للانتقال إلى الخطوة التالية أكثر من 40٪ من الخلايا يجب أن تكون منفصلة. دراسة الخلايا باستخدام مجهر مقلوب، وإذا لزم الأمر، "صفعة أو اضغط على" الأطباق ثقافة بلطف للافراج عن أي خلايا تعلق المتبقية.
      ملاحظة: العناية كما trypsinization لفترات طويلة يمكن أن يسبب موت الخلايا. لا يكفي وسوف الخلايا نقل كافية للدراسات المخطط لها.
    3. resuspend الخلايا، وبعد إجراءات المنصوص عليها في 1.1.3، ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
    4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق على 300-500 x ج، تجاهل المتوسطة، وجمع الخلايا مع متوسط ​​نمو الطازجة والبذور لهم في، على الأقل، أربعة 100 مم القطر أطباق زراعة الخلايا. فإن عدد الخلايا في الطبق تعتمد على كمية من الخلايا استردادها. احتضان الخلايا عند 33 درجة مئوية مع 10٪ CO 2 (P-HEI-OC1) وتقسيم مرة أخرى عدة مرات كما اللازمة لالتجارب المخطط لها أو لتوليد الأسهم الجديدة.
    5. لإعداد الأوراق المالية، واستبدال 100 أطباق ملم القطر من 250-550 مل قوارير ثقافة الخلية؛ للتجارب، أطباق أصغر أو لوحات متعددة آبار قد تكون أكثر ملاءمة.
    6. للتمايز، واحتضان خلايا التعليم العالي-OC1 في الظروف متساهلة حتى تصل إلى ~ 80٪ التقاء. ثم نقل الأطباق إلى 39 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 (NP-HEI-OC1) لمدة 2 إلى 3 أسابيع.
      ملاحظة: سوف الخلايا تتوقف تدريجيا المتكاثرة والموت. تغيير المتوسطة كل يوم لإزالة الخلايا الميتة. اعتمادا على العدد الأصلي للخلايا، وعادة بعد ~ 4 أسابيع أي خلايا أكثر ستكون متاحة للتجارب. يبدأ التمايز حالما يتم وضع الخلايا في ظروف NP، ولكن ليس كل خلية تفرق بنفس الوتيرة. الأهم من ذلك، prestin التعبير وتوطين غشاء الزيادات خلال عملية التمايز (انظر ممثل النتائج الشكل 4)، وتوفير نوعيةوإشارة الكمي لمستوى التمايز.

2. الدراسات السمسة المخدرات

ملاحظة: ينصح خلايا التعليم العالي-OC1 نمت في ظروف متساهلة (P-HEI-OC1) لهذه الدراسات (انظر ممثل النتائج الشكل 1).

  1. بقاء الخلية (MTT الفحص)
    1. جمع الخلايا P-HEI-OC1 باتباع الإجراء الموضح في 1.2، ونعدهم مع أي عداد الخلايا التلقائي أو عدادة الكريات. ضبط تركيز إلى 2.0 × 10 5 خلية / مل.
    2. البذور الخلايا على 96-جيدا واضحة لوحات مسطحة القاع (100 ميكرولتر لكل بئر)، واحتضان بين عشية وضحاها لمرفق إلى الركيزة، ثم تعاملهم مع الأدوية المثيرة للاهتمام. لا تنسى أن تشمل الفراغات والخلايا المعاملة غير (مراقبة)!
    3. بعد العلاج من تعاطي المخدرات (عادة 24 أو 48 ساعة على 33 درجة مئوية)، إجراء فحص MTT بعد بروتوكول الشركة المصنعة. بشكل عاموبروتوكولات لهذا الفحص لديها الخطوات التالية:
      1. إضافة 10 ميكرولتر من الإنتقالي العسكري الكاشف إلى كل بئر.
      2. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعة حتى الصباغ الأرجواني مرئيا، ثم قم بإضافة 100 ميكرولتر من الإنتقالي العسكري منظفات الكاشف إلى كل بئر. لا يهز لوحة.
      3. تغطية لوحة وترك الأمر في الظلام لمدة 2-4 ساعة عند 37 درجة مئوية.
      4. استخدام قارئ لوحة صفيحة لقياس الامتصاصية في 570 نانومتر في كل بئر، بما في ذلك الفراغات (متوسطة النمو وحده). تطبيع البيانات باستخدام متوسط ​​OD التحكم في الخلايا إلى 100٪ من قدرتها على البقاء.
  2. كاسباس 3/7 تفعيل الفحص
    ملاحظة: ينصح خلايا التعليم العالي-OC1 نمت في ظروف متساهلة (P-HEI-OC1) لهذه الدراسات.
    1. جمع الخلايا مؤسسات التعليم العالي-OC1 باتباع الإجراء الموضح في 1.2، ونعدهم مع أي عداد الخلايا التلقائي أو عدادة الكريات. ضبط تركيز إلى 2.0 × 10 5 خلية / مل.
    2. البذور الخلايا على ذوي الخوذات البيضاءالفنار الجدران لوحات 96-جيدا (100 ميكرولتر لكل بئر)، واحتضان بين عشية وضحاها لمرفق إلى الركيزة، ثم تعاملهم مع الأدوية المثيرة للاهتمام. لا تنسى أن تشمل الفراغات والخلايا المعاملة غير (مراقبة)!
    3. بعد العلاج من تعاطي المخدرات (عادة 24 أو 48 ساعة على 33 درجة مئوية)، إجراء فحص كاسباس بعد بروتوكول الشركة المصنعة فيما يخصه. بشكل عام، وبروتوكولات لهذا الفحص لديها الخطوات التالية:
      1. تحضير الكواشف، مزجها جيدا، والسماح لهم لكي تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة.
      2. إزالة الخلايا من الحاضنة والسماح لوحات لتتوازن إلى درجة حرارة الغرفة.
      3. إضافة المبلغ المشار إليه من كاشف إلى كل بئر، والحرص على تجنب انتقال التلوث من خلال عدم لمس الآبار التي تحتوي على عينات مختلفة مع نفس نصائح ماصة.
      4. تغطية لوحة وتخلط لمدة 30 ثانية باستخدام شاكر لوحة في 300-500 دورة في الدقيقة.
      5. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة، على الأقل، 30 دقيقة. Determinالبريد فترة الحضانة الأمثل تجريبيا. إذا يتقلب في درجة حرارة الغرفة استخدام حاضنة ثابتة درجات الحرارة، لأن التقلبات في درجات الحرارة سيؤثر التلألؤ القراءة.
      6. قياس التألق في كل بئر، وتطبيع القيم باستخدام متوسط ​​التلألؤ التحكم في الخلايا إلى 100٪ من تفعيل كاسباس.
  3. انقسام الخلايا (انتشار)
    1. جمع الخلايا مؤسسات التعليم العالي-OC1 باتباع الإجراء الموضح في 1.2، ونعدهم مع أي عداد الخلايا التلقائي أو عدادة الكريات. ضبط تركيز إلى 2.0 × 10 5 خلية / مل.
    2. البذور الخلايا على 96-جيدا واضحة لوحات مسطحة القاع (100 ميكرولتر لكل بئر)، واحتضان بين عشية وضحاها في الظروف متساهلة لمرفق إلى الركيزة، ثم تعاملهم مع الأدوية المثيرة للاهتمام. لا تنسى أن تشمل الفراغات والخلايا المعاملة غير (مراقبة)!
    3. ساعة واحدة بعد العلاج، إضافة إلى كل بئر 1 ميكرولتر من BrdU 100X استعداد (5-برومو-2'-deoxyuriتناول الطعام) حل، والعودة لوحات لالحاضنة عند 33 درجة مئوية.
    4. بعد 12 و 24 و 48 ساعة، وإزالة المتوسطة القائمة من لوحات المقابلة وغسل كل بئر مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
    5. إجراء فحص تكاثر الخلايا التالية بروتوكول الشركة المصنعة. بشكل عام، وبروتوكولات لهذا الفحص لديها الخطوات التالية:
      1. تحضير الكواشف، بما في ذلك تحديد / الحل تغيير طبيعة، غسل العازلة والابتدائي الأضداد حل كشف والثانوي الحل الكشف عن الأجسام المضادة، والحل BrdU كما هو مبين في بروتوكول الشركة المصنعة.
      2. إضافة محلول التثبيت / تغيير طبيعة كل بئر، في المبالغ المشار إليها في بروتوكول الشركة المصنعة، والحفاظ على لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
      3. إزالة تثبيت / الحل تغيير طبيعة وإضافة الأجسام المضادة الأولية في تركيز مبين في بروتوكول الشركة المصنعة. الحفاظ على لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
      4. إزالة الحل مع النمل الأساسيibody، وغسل لوحة 3 مرات مع العازلة يغسل، ثم قم بإضافة الأجسام المضادة الثانوية في تركيز مبين في بروتوكول الشركة المصنعة. الحفاظ على لوحة مع الأجسام المضادة الثانوية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
      5. إزالة الحل مع الأجسام المضادة الثانوية، وغسل لوحة 3 مرات مع غسل العازلة، وإضافة الركيزة. بعد 10 دقيقة حضانة في درجة حرارة الغرفة، إضافة محلول إيقاف. كن حذرا: السيطرة على تغير في اللون. إذا أصبح الحل مظلمة جدا، والتوقف عن رد الفعل قبل الوقت اللازم لتطوير معيار لمدة 10 دقيقة.
      6. قراءة الامتصاصية في 450 نانومتر في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول إيقاف.
  4. السمية الخلوية
    ملاحظة: ينصح خلايا التعليم العالي-OC1 نمت في ظروف متساهلة (P-HEI-OC1) لهذه الدراسات.
    1. احتضان عند الشروط المتساهلة، عادة لمدة 24-48 ساعة، وخلايا التعليم العالي-OC1 في مستنبت الخلية وحدها (السيطرة) أو المتوسطة بالإضافة إلى العقاقير المثيرة للاهتمام.
    2. في نهاية العلاج، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، وفصل باستخدام 1 مل لكل 25 سم 2 من مساحة حل تفارق الخلية غير الأنزيمية لمدة 3 دقائق.
    3. بعد فصل، وجمع وبيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف، وصمة عار على الخلايا لمدة 15 دقيقة في الظلام مع كاشف المدرجة في فحص السمية الخلوية.
    4. تحديد عدد الخلايا مؤسسات التعليم العالي-OC1 الحية عن طريق التدفق الخلوي كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة لقياس التدفق الخلوي.
  5. الشيخوخة
    1. احتضان عند الشروط المتساهلة، عادة لمدة 24-48 ساعة، وخلايا التعليم العالي-OC1 في مستنبت الخلية وحدها (السيطرة) أو المتوسطة بالإضافة إلى العقاقير المثيرة للاهتمام.
    2. تحديد عدد الخلايا الإيجابية المصاحبة للشيخوخة بيتا غالاكتوزيداز باستخدام التدفق الخلوي مع بروتوكول صفها Debacq-Chainiaux وآخرون 15 أو غيرها من طريقة معروفة لتقديم نتائج يمكن الاعتماد عليها. بروتوكول موجز عن التدفق الخلوي هو ما يلي:
        <لى> في نهاية العلاجات التجريبية، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني واحتضان ثم لهم مع 100 نيوتن متر Bafilomycin A1 في مستنبت الخلايا لمدة 1 ساعة على شروط متساهلة.
      1. إضافة C12FDG بتركيز نهائي من ~ 33 ميكرومتر، ومواصلة احتضان الخلايا لمدة 1-2 ساعة.
      2. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، حصادها باستخدام 1 مل لكل 25 سم 2 من مساحة حل تفارق الخلية غير الأنزيمية لمدة 3 دقائق، وبيليه لهم من قبل الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق.
      3. resuspend الخلايا في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني وتحديد عدد الخلايا إيجابية مؤسسات التعليم العالي-OC1 التدفق الخلوي كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة لقياس التدفق الخلوي.
  6. الالتهام الذاتي
    1. جمع الخلايا مؤسسات التعليم العالي-OC1 السيطرة وتجويع (حرمت من المصل لمدة 48 ساعة) باتباع الإجراء الموضح في 1.2، ومعالجتها لطخة غربية التالية البروتوكولات القياسية. بشكل عام، وبروتوكولات لطخة غربية لديها الحادي التاليةالعائد على السهم:
      1. البذور خلايا التعليم العالي-OC1 في 6 لوحات جيدا عند تركيز 1.0 × 10 5 خلية / مل. بعد 24 و / أو 48 ساعة، وغسل الخلايا مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني.
      2. ليز مع 200 ميكرولتر من العازلة TNESV (1٪ NP40، 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، و 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2mm و EDTA، 1 ملم نا 3 VO 4) مع الكوكتيل مثبط البروتياز و1 ملم PMSF لمدة 5 دقائق على الجليد.
      3. جمع الخلايا (عن طريق كشط الجزء السفلي من كل جانب)، ونقل إلى أنابيب microcentrifuge وأجهزة الطرد المركزي في 16800 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
      4. جمع supernatants وقياس تركيز البروتين باستخدام BCA الفحص.
      5. إضافة العازلة تحميل 5X و 1 ملي DTT لكل عينة ويغلي لمدة 5 دقائق لتفسد البروتينات.
      6. تشغيل العينات باستخدام SDS-PAGE على هلام 4-12٪، ونقل إلى الأغشية PVDF.
      7. منع الأغشية مع 5٪ غير دهن الحليب المجفف في TBS-T مع 0.1٪ توين 20 لمدة 60 دقيقة في RT.
      8. احتضان الأغشية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع نملة الأساسيibodies.
      9. في اليوم التالي، وغسل الأغشية على نطاق واسع مع TBS-T، واحتضان مع الأجسام المضادة مفتش الثانوي مترافق إلى البيروكسيديز الفجل (HRP) (1: 1500) لمدة 1 ساعة.
      10. كشف مناعية مع نظام الكشف تعزيز التوهج (ECL). تطبيع مستويات التعبير البروتين باستخدام GAPDH (1: 2000 في TBS-T مع 10٪ غير دهن الحليب المجفف) وفقا لمعايير.
    2. في البقع الغربية التحقيق في التعبير عن، على الأقل، واثنين من علامات مختلفة من الالتهام الذاتي مثل Beclin-1 وLC3B (عادة في 1: 1000 تخفيف في TBS-T مع 2.5٪ BSA). لا ننسى أن ننظر لمراقبة التعبير البروتين مثل GAPDH أو الأكتين.
    3. تقييم التعبير عن بروتين من الفائدة عن طريق قياس كثافة استخدام الماسح الضوئي وصمة عار الرقمي أو برامج الكمبيوتر مثل المجال العام المعاهد الوطنية للصحة صورة أو يماغيج (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).

3. التجارب الكهربية مع خلايا التعليم العالي-OC1

  1. خلايا الحصاد
    ملاحظة: استخدام خلايا تنمو في أطباق ثقافة قطرها 100 ملم في 50٪ -80٪ ​​confluency. التربسين، Accutase، حل الخالية من الإنزيم، أو ص hosphate- ب uffered الصورة ألين + ه thylene د iamine ر ETRA حمض CETIC (PBS-EDTA) يمكن استخدامها لرفع الخلايا دون آثار كبيرة على عدد ونوعية gigaseals . في بعض الحالات، لكن العلاج التربسين يجعل الخلايا أكثر هشاشة. في هذه الحالات، تسمح للخلايا لاستعادة لحوالي 30 دقيقة قبل بدء التجارب.
    1. غسل الخلايا مرتين مع 10 مل PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+.
    2. إضافة 2 مل من محلول detacher خالية من الانزيم، مثل غير الأنزيمية الحل تفارق الخلية، واحتضان الأطباق لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
    3. استخدام مجهر مقلوب للتحقق من مفرزة من الخلايا. إذا لزم الأمر، نقل سلل الطبق الثقافة لفصل المزيد من الخلايا، ولكن القيام بذلك بلطف.
      ملاحظة: لا يهز الطبق.
    4. إضافة 10 مل من DMEM + 10٪ FBS وماصة للخلايا بلطف صعودا وهبوطا خمس مرات مع ماصة 10 مل.
    5. نظرة على الخلايا تحت المجهر. إذا تم عزل> 80٪ من الخلايا بالفعل (واحد)، وليس هناك حاجة pipetting لآخر. إذا كانت الخلايا لا تزال في مجموعات، وتكرار pipetting بلطف حتى أكثر من 80٪ الخلايا واحدة.
    6. ضع ~ 10 مل من الخلايا علقت في أنبوب مخروطي 15 مل، الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 100 x ج، وتجاهل طاف.
    7. استخدام ~ 200 ميكرولتر من حل تسجيل خارجي (يبوفيتش L-15 متوسطة تعديلها ل305-310 ملي أوزمول مع الماء المقطر) إلى resuspend الخلايا. عنصر تحكم البصرية من الخلايا يجب أن تظهر العديد من خلايا مستديرة واحدة مع حواف الغشاء على نحو سلس.
  2. التصحيح، المشبك والمقاييس مؤتمر العمل النيجيري
    1. أداء التصحيح، المشبك وقياسات تعتمد على الجهد غير الخطية السعة (NLC) باستخداممكبرات الصوت dequate والبرمجيات، فضلا عن تقنيات الكهربية القياسية. كما استخدام الداخلي (intrapipette) حل 150 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 0.1 ملي EGTA، 2 ملم ATP-المغنيسيوم، 0.1 ملي GTP-نا، و 10 ملي HEPES. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 مع تريس.
    2. تحت المجهر، حدد واحد، خلية سليمة، مع جولة وحواف الغشاء على نحو سلس. إرفاق غيض من ماصة الزجاج إلى سطح الخلية وتحقق مقاومة الغشاء. هذا يجب أن يكون حوالي 3-6 megaOhms الموافق قطرها الداخلي (ID) من طرف ماصة لل~ 2 ميكرون.
    3. اضغط بلطف غيض micropipette ضد غشاء الخلية البلازما وبعد ذلك تطبيق الشفط. سيتم شفط جزء من غشاء الخلية في ماصة، وتوليد المقاومة الكهربائية في ترتيب 10-100 gigaOhms (gigaseal).
    4. إنشاء حالة خلية كاملة من خلال تعطيل غشاء البلازما مع نبضات الشفط.
    5. استخدام الخلايا التي لا تعبر عن prestin، مثل كلوة-293، كوسيلة لمراقبة 9.
      ملاحظة: يجب أن تتم تصفيته الردود الحالية في 5 كيلو هرتز، وتصويبات لآثار سلسلة المقاومة المتبقية. لا يمكن أن يؤديها كل جمع البيانات ومعظم التحليلات باستخدام برنامج تدرج عادة مع مكبرات الصوت قفل في. وظيفة السعة يمكن تركيبها على أول مشتق من وظيفة بولتزمان الدولتين تتعلق تهمة غير الخطية إلى غشاء الجهد 16.

النتائج

في بضع من المنشورات الحديثة أبلغنا مجموعة شاملة من الدراسات التي تهدف إلى تقييم استجابة الخلايا مؤسسات التعليم العالي-OC1 لعدة عقاقير الدوائية التي يشيع استخدامها وكذلك التحقيق في وظيفة prestin 8،9. في هذه الدراسات التي قطعناها على أنفسنا استخدام ...

Discussion

في هذا التقرير وصفنا كيفية الثقافة خلايا التعليم العالي-OC1 واستخدامها لتقييم آليات للخلايا المخدرات التي يسببها والتحقيق في الخصائص الفنية للprestin، المحرك الجزيئي للقوقعة OHCs. الإجراءات الفنية، ومع ذلك، فإن العام بما فيه الكفاية لتتكيف بسهولة مع مختلف الدراسات.

Disclosures

The authors declare no existing or potential conflict of interest.

Acknowledgements

This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
HEI-OC1 cellsALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS 
Class II Biological Safety cabinetThe Baker CompanySterilgard IIIAND COMPANIES INDICATED IN THE
Refrigerated centrifugeEppendorf5810RPREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY
Inverted microscopeZeissAxiovert 25EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR
WaterbathStovallHWB115PRODUCT COULD BE USED.
Cell counterNexcelomCellometer Auto T4
Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2Forma Scientific3110
Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with ventsGreinier Bio-One664-160
Cell culture dishes , PS,  60 mm x 15 mm with vents Greiner Bio-One628160
Cellstar tissue culture flasks  250 mlGreiner Bio-One658-175
Cellstar tissue cultur  flasks 550 mlGreiner Bio-One660-175
 6 well cell culture plate, with lid-CellstarGreiner Bio-One657-160
Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lidBecton Dickinson353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottomGreiner Bio-One655098
50 ml Polypropylene conical tube with cap CellstarsBecton Dickinson 352070
15 ml Polypropylene conical tubes with cap-CellstarsGreiner Bio-One188-271
PBS pH 7.4 (1x) Life Technologies10010-023
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Life Technologies11965-084
Fetal bovine serum (FBS) HycloneSH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol redGibco/Invitrogen21083-027
Trypsin, 0.25% Life Technologies25200-056
TACS MTT Cell Proliferation Assay KitTrevigen4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Assay  kitPromega  G8091 
BrdU Cell Proliferation Assay Kit Cell Signaling6813
Non-enzymatic cell dissociation solution Sigma-AldrichC5789
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay KitPromega  G8741 
FACSAriaIII instrument BD Biosciences FACSAriaIIIWith 488 nm excitation (blue laser)
Digital Blot ScannerLI-CORC-DiGit
Electrophoresis and Blotting UnitHoeferSE300 miniVE
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 SoftwareMolecular DevicesSpectraMax 5
Patch-clamp amplifierHEKAEPC-10
Puller for preparing patch electrodesSutter InstrumentsP-97

References

  1. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
  2. Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
  3. Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
  4. Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
  5. Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
  6. Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
  7. Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
  8. Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
  9. Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
  10. Celis, J. E. . Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (2006).
  11. Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
  12. Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
  13. Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
  14. Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  16. Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
  17. Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
  18. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
  19. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
  20. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
  21. Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
  22. Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
  23. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
  24. Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
  25. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  26. Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
  27. Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

115 OC1 prestin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved