与听觉HEI-OC1细胞工作

摘要

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

摘要

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 °C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 °C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.

引言

科尔蒂1的房子耳研究所-器官（HEI-OC1）细胞是从转基因小鼠^1,2的听觉器官的。在33℃/ 10％CO _2（在允许的条件）从此转基因小鼠的任何细胞的温育诱导触发去分化和加速扩散的永生化基因的表达;移动单元至39℃/ 5％CO _2（非许可条件）导致减少的增殖，分化和，至少在开平OC1，细胞死亡^2,3的情况。

HEI-OC1细胞克隆和表征在我们的实验室在十多年前，和最初的研究表明，它们表达耳蜗毛细胞，如prestin无，肌球蛋白7a中，Atoh1的，BDNF钙结合蛋白和钙调蛋白的特异性标志物，而且还支持标记细胞如连接蛋白26和成纤维细胞生长因子受体^{（FGF-R）2。}因此，有人建议，HEI-OC1可以表示的commoñ祖为²尔蒂的器官感觉和支持细胞。平行研究提供了有力的证据表明，典型的耳毒性药物如顺铂，庆大霉素，链霉素诱导的caspase-3的活化在这些细胞中，而药物视为非耳毒性，如青霉素，没有^2,3。因此，该细胞系被提出作为在体外系统来研究参与耳毒性及潜在耳毒性或新的药理学药物otoprotective性质筛选的细胞和分子机制。据估计，HEI-OC1细胞已经发表在过去十年超过150研究中使用。

而在寻找不同的药物的潜在促凋亡作用是最涉及该细胞系研究 ​​的主要目标，其他重要的细胞过程像自噬和衰老刚刚开始HEI-OC1细胞^4-7进行调查。一世呐最近我们实验室⁸研究中，我们采用HEI-OC1细胞收集一套完整的有关细胞死亡，存活，增殖，衰老和自噬在临床上经常使用不同的药理学药物诱发的数据。我们还比较了一些开平OC1细胞与那些从HEK-293（人胚肾细胞）和HeLa（人上皮细胞）接受相同治疗的响应。我们的结果表明，开平OC1细胞的每种药物响应的特征的方式，具有鲜明的剂量和时间依赖的灵敏度所研究的机制中的至少一个。我们还强调，在这项研究的实验结果的正确解释，需要与多个技术进行⁸平行研究。

在不同的研究中，我们调查了采用HEI-OC1细胞来评价prestin无的功能反应，耳蜗外毛细胞马达蛋白（外毛细胞^）9 。我们报道流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜研究上prestin无表达在容许（P-HEI-OC1）和非培养的HEI-OC1细胞的模式，以及非线性电容（NLC）和全细胞膜片钳研究容许（NP-HEI-OC 1）的条件。我们的结果表明，在NP-HEI-OC 1细胞以时间依赖性的方式既总prestin无表达和血浆膜定位增加。有趣的是，我们还发现，在含有的Na ⁺ K ⁺ ATP酶的减少，这从质膜易位到细胞质而不在总细胞表达显著变化相关的NP-HEI-OC1细胞的质膜的增加prestin无定位。此外，我们表明，P-HEI-OC 1细胞具有强大的NLC关联prestin无运动功能，当存在于质膜prestin无分子的密度增加，这降低。总之，这些结果强烈支持HEI-OC的用处1细胞研究听觉蛋白质。

在这个视频文章我们将描述如何培养开平OC1细胞，为什么它是方便使用的细胞在允许的条件（P-HEI-OC 1）细胞毒性的研究越来越大，如何评估药物诱导的细胞毒性，以及如何的机制/ s的执行电生理学研究（ 如 ，膜片钳，非线性电容（NLC））调查prestin无，耳蜗外毛细胞的分子马达的功能特性。

研究方案

1.细胞培养

注意:所有的细胞培养协议必须使用适当的细胞培养技术来执行（参考见细胞生物学的第3章:实验室手册，第I卷^10）。 HEI-OC1细胞不要求的适当附着和生长的细胞培养皿的任何附加涂层或处理。非常重要:不要用细胞培养的目的玻璃器皿菜肴;表型和细胞对药物的药物的生物反应会改变（G Kalinec＆F Kalinec，未发表）;建议使用传统的塑料细胞培养皿（见材料/设备表）。要特别注意无菌操作技术，以避免污染，但从来没有使用具有HEI-OC1细胞的抗生素（ 如氨苄青霉素或链霉素）。如果需要的话，可以使用的两性霉素B.边HeLa和HEK-293细胞已被用作在以前的研究与开平OC1 ^8，任何其他的细胞系能控制是为此目的可以接受的。

1. 冷冻HEI-OC1细胞复苏
   注意:此协议也可以与从本实验室开发的，如OC-K3，从科尔蒂^11,12的器官的相同的转基因小鼠，和SV-K1其它细胞系使用的，从血管纹^13,14。
   1. 从_液态氮中取出冷冻开平OC1细胞的小瓶，并将其放置在水浴中在37℃。淹没只小瓶的下半部，并允许它解冻直到只有冰少量残留在小瓶中。擦拭用70％酒精小瓶的外部。
   2. 来自小瓶吸取细胞和递送的全部体积（〜1.5×10 ^5个细胞/ ml）缓慢逐滴入含有10ml预温热的生长培养基中，如Dulbecco改进的Eagle培养基15毫升锥形管中（ DMEM）中，补充有10％胎牛血清（FBS）。
   3. 通过离心管中，在300-500 XG除去DMSO 5分钟，丢弃吨他上清液并重新悬浮细胞于9ml新鲜生长培养基（DMEM + 10％FBS）的。由悬浮的细胞的磁通和回流分解团块或细胞的薄片，从吸管向培养基中，反之亦然，三至四次用吸管接触管的底部的前端。
   4. 放置悬浮于生长培养基中毫米直径100未处理，塑料细胞培养皿的细胞的总体积。
   5. 孵育所述细胞在33℃用10％的CO _2（在允许的条件）。
2. HEI-OC1细胞亚文化
   注意:至汇合之前（〜80％）的细胞应使悬浮液和传代培养，以防止培养垂死。该协议也可以与来自相同的转基因小鼠在我们实验室开发的其它细胞系，如OC-K3，从科尔蒂^11,12，和SV-K1的器官时，从血管纹^13,14。
   1. 用2毫升的PBS除去旧培养基并洗涤细胞。
   2. 覆盖细胞单层用0.25％胰蛋白酶的溶液中，使用每表面积为25cm ² 1毫升到移动到下一个步骤的细胞的40％以上，必须分开。检查使用倒置显微镜的细胞，并且如果必要的，"拍击或轻按"培养皿轻轻释放任何残留的附着的细胞。
      注:请注意胰酶消化作为长期可引起细胞死亡;没有足够和转移细胞就会不足计划的研究。
   3. 悬浮细胞，按照1.1.3中描述的方法，并且将它们转移到15毫升锥形管中。
   4. 离心机在300-500 XG 5分钟，弃去培养基，收集用新鲜的生长培养基中的细胞，并在种子他们，至少四个100毫米直径细胞培养皿。每盘的细胞数目将取决于回收的细胞的量。孵育所述细胞在33℃用10％的CO _{2（P-HEI-OC1）}并在必要时对分割再次多次计划的实验或用于生成新的股票。
   5. 对于备料，取代250-550毫升的细胞培养瓶百毫米直径的菜肴;进行实验，较小的菜肴或多井板可能会更充足。
   6. 对于差异化，孵化HEI-OC1细胞在允许的条件，直到他们达到〜80％汇合;然后移动的菜至39℃，5％的CO _{2（NP-HEI-OC} 1）为2至3周。
      注:细胞将逐渐停止增殖和死亡。改变介质隔日以去除死细胞。根据原始数量的细胞，一般经过〜4周没有更多的细胞将可用于实验。当细胞被放置在NP条件下分化尽快启动，但不是每个单元格以同样的速度差异。重要的是，在分化过程prestin无表达和膜定位增加（见代表结果 ， 图4），提供质和分化水平的定量指示。

2.药物毒性研究

注意:推荐用于这些研究（见代表结果 ， 图 1）在允许条件（P-HEI-OC 1）生长开平OC1细胞。

1. 细胞活力（MTT法）
   1. 收集的P-HEI-OC 1细胞通过以下在1.2中描述的方法，用任一自动细胞计数器或血细胞计数器计数。浓度调整到2.0×10 ^5个细胞/ ml。
   2. 种子的细胞在96孔透明平底平板（每孔100μl），用于附连到衬底孵育过夜，然后与感兴趣的药物治疗。不要忘了，包括空格和非处理的细胞（对照）！
   3. 药物治疗后（通常24或在33℃48小时），则执行根据制造商的协议MTT测定。一般来说，对于该测定的协议具有以下步骤:
      1. 加入10微升的MTT试剂至各孔中。
      2. 孵育在37℃的板2至4小时直到紫色染料是可见的，然后添加100微升的MTT洗涤剂试剂的每个孔中。不要摇晃板。
      3. 覆盖板并使其保持在黑暗中进行2至4小时，在37℃。
      4. 使用微量板读板器测量各孔在570nm的吸光度，包括空白（单独生长培养基）。利用在控制细胞存活率为100％的平均OD值正常化的数据。
2. 胱天蛋白酶3/7活化分析
   注:建议这些研究在允许的条件（P-HEI-OC1）成长HEI-OC1细胞。
   1. 收集HEI-OC 1细胞通过以下在1.2中描述的方法，用任一自动细胞计数器或血细胞计数器计数。浓度调整到2.0×10 ^5个细胞/ ml。
   2. 种子上WH细胞伊特-壁96孔板（每孔100μl），孵育过夜用于附着到衬底上，然后与感兴趣的药物治疗。不要忘了，包括空格和非处理的细胞（对照）！
   3. 药物治疗后（通常24或在33℃48小时），则执行以下的各制造商的协议的胱天蛋白酶测定法。在一般情况下，对于该测定的协议具有以下步骤:
      1. 准备试剂，它们搅拌均匀，并允许他们平衡至室温。
      2. 除去从培养箱的细胞，并允许所述板平衡至室温。
      3. 试剂的量表示每孔加入，小心通过不接触含有不同的样品具有相同的枪头井避免交叉污染。
      4. 覆盖板，并用板振荡器在300-500转30秒混合。
      5. 在室温下孵育该板的一段，至少30分钟。 DeterminË最佳的潜伏期经验。如果室内温度波动使用的恒温培养箱，因为温度波动会影响发光读数。
      6. 测量每个发光良好，使用控制细胞平均发光的caspase激活的100％标准化值。
3. 细胞分裂（增殖）
   1. 收集HEI-OC 1细胞通过以下在1.2中描述的方法，用任一自动细胞计数器或血细胞计数器计数。浓度调整到2.0×10 ^5个细胞/ ml。
   2. 种子的细胞在96孔透明平底平板（每孔100μl）中，在用于附连到基片允许的条件下孵育过夜，然后与感兴趣的药物治疗。不要忘了，包括空格和非处理的细胞（对照）！
   3. 处理后一小时，加至每孔1μl的准备100倍的BrdU（5-溴-2'- deoxyuri用餐）溶液，并在33℃将板返回孵化器。
   4. 12，24和48小时后，取出从相应板中的现有的介质，并用PBS洗每个孔一次。
   5. 执行按照制造商的协议的细胞增殖试验。在一般情况下，对于该测定的协议具有以下步骤:
      1. 制备的试剂，其中包括定影/变性溶液，洗涤缓冲液，一级抗体检测溶液，二次抗体检测溶液，和BrdU溶液如制造商的方案表示。
      2. 定影/变性溶液添加到各孔中，在制造商的方案中所示的量，并保持在室温下将板进行30分钟。
      3. 拆下定影/变性溶液和在该制造商的协议所指示的浓度添加第一抗体。保持在室温下将板1小时。
      4. 删除与主蚂蚁的解决方案ibody，洗涤平板用洗涤缓冲液3次，然后在该制造商的协议所指示的浓度添加二次抗体。保持与第二抗体的板在室温下30分钟。
      5. 删除与第二抗体的溶液，冲洗板用洗涤缓冲液3次，并添加底物。 10分钟，在室温孵育后，添加一站式解决方案。请注意:控制颜色的变化;如果解决方案变得很暗，停止之前的10分钟的标准开发时的反应。
      6. 在450 nm处加入终止液后的30分钟内读取吸光度。
4. 细胞毒性
   注:建议这些研究在允许的条件（P-HEI-OC1）成长HEI-OC1细胞。
   1. 孵育在允许的条件，通常为24-48小时，开平OC1细胞单独细胞培养基（对照）或培养基加上感兴趣的药物。
   2. 在治疗结束时，洗涤细胞三次，用PBS，并使用每3分钟一个非酶细胞解离溶液的表面积为25cm ²¹毫升分离。
   3. 分离后，收集并在3000 xg离心离心沉淀细胞5分钟，除去上清液，并将细胞染色15分钟，在黑暗中与包括在细胞毒性测定试剂。
   4. 通过流确定活开平OC1细胞的数目通过流式细胞仪的制造商仪所指示的。
5. 衰老
   1. 孵育在允许的条件，通常为24-48小时，开平OC1细胞单独细胞培养基（对照）或培养基加上感兴趣的药物。
   2. 确定使用具有由已知提供可靠的结果Debacq-Chainiaux 等人 ¹⁵或其它方法中描述的协议流式细胞仪的衰老相关的β-半乳糖苷酶阳性细胞的数目。流式细胞仪简要方案如下:
      1. 在的实验处理结束时，洗涤细胞三次，用PBS，然后用100nM巴弗洛霉素A1孵育它们在细胞培养基中在允许的条件1小时。
      2. 添加C12FDG在〜33μM的终浓度，并继续培养细胞1-2小时。
      3. 用PBS洗细胞两次，使用每3分钟一个非酶细胞解离溶液的表面积为25cm ²¹毫升收获它们，并在3000 xg离心离心沉淀他们5分钟。
      4. 悬浮细胞在冰冷的PBS中，流式细胞仪通过流式细胞确定由流动的生产细胞仪指示正开平OC1细胞的数目。
6. 自噬
   1. 收集HEI-OC1细胞控制和饥饿通过以下在1.2中描述的方法（剥夺血清的48小时），并对其进行处理用于印迹以下标准协议。在一般情况下，用于Western印迹的协议具有以下ST每股收益:
      1. 种子HEI-OC 1细胞在6孔板以1.0×10 ⁵细胞/ ml的浓度。 24和/或48小时后，洗细胞用冰冷的PBS中。
      2. 裂解用200μlTNESV缓冲液（1％NP40，的50mM Tris -盐酸pH值7.5，100mM NaCl的，2mM的EDTA，1mM的钠₃ VO _4）与蛋白酶抑制剂混合物和1mM PMSF在冰上5分钟的。
      3. 收集细胞（由刮每个孔的底部），在4℃下转移到微量离心管并离心16,800×g离心5分钟。
      4. 收集上清液并使用BCA测定法量化蛋白质浓度。
      5. 添加5×上样缓冲液和1mM DTT向每个样品并煮沸5分钟以变性蛋白。
      6. 运行使用4-12％凝胶上的SDS-PAGE的样品，并转移到PVDF膜上。
      7. 用0.1％方框与在TBS-T的5％脱脂奶粉的膜吐温20在室温下60分钟。
      8. 过夜孵育该膜在4℃下与伯蚂蚁ibodies。
      9. 第二天，用TBS-T广泛洗涤该膜，并与缀合至辣根过氧化物酶（HRP）（1:1500）的次级IgG抗体孵育1小时。
      10. 检测免疫反应性与增强的化学发光（ECL）检测系统。正常化使用GAPDH蛋白质表达水平（1:2,000在TBS​​-T中，在10％的脱脂奶粉）作为标准。
   2. 在Western印迹调查中，表达至少，自噬的两种不同的标记物，如自噬基因Beclin 1和LC3B（通常在1:1000稀释在TBS-T中，用2.5％BSA）中。不要忘记寻找如GAPDH或肌动蛋白表达这样的控制。
   3. 评估通过使用数字印迹扫描器或计算机软件密度感兴趣的蛋白质的表达，如在公共领域NIH图像或的ImageJ（http://rsb.info.nih.gov/nih-image/）。

3.电生理学实验与HEI-OC1细胞

1. 收获细胞
   注意:使用的细胞以50％-80％汇合生长100毫米直径的培养皿中。胰蛋白酶，的Accutase，不含酶的溶液，或b uffered 小号艾琳+ E thyleneðiamine 吨 ETRA 一个 cetic酸（PBS-EDTA） 芘 hosphate-可以用于提起细胞而不对gigaseals的数量和质量的影响显著。在某些情况下，但是，胰蛋白酶处理使得细胞更脆弱。在这些情况下，使细胞在开始实验前约30分钟恢复。
   1. 用10ml的PBS不含Ca ²⁺和Mg ²⁺洗细胞两次。
   2. 在37℃下加入2毫升不含酶的分离器的溶液，如非酶细胞解离溶液中，并孵育菜3分钟，用5％ _的 CO _2。
   3. 使用倒置显微镜来检查细胞的脱离。如果有必要，将CEL升培养盘分离更多的细胞，但做到这一点温和的。
      注意:不要摇晃菜。
   4. 加入10毫升的DMEM + 10％FBS和吸取细胞轻轻上下五次用10毫升移液管。
   5. 看在显微镜下的细胞。如果细胞的> 80％的已分离的（单），则不需要进一步的移液。如果细胞仍处于集群，重复轻轻吹打，直至超过80％的细胞是单身。
   6. 所述〜10毫升悬浮细胞置于15毫升锥形管，离心机在100 xg离心2分钟，并弃去上清液。
   7. 使用〜200微升的外部记录溶液（Leibovitz的L-15培养基调节至305 - 310毫渗透摩尔浓度用蒸馏水）以悬浮细胞。该细胞的光控应显示许多单身，圆形细胞具有光滑的膜边缘。
2. 膜片钳和测量NLC
   1. 执行膜片钳和使用电压依赖性的非线性电容的测量（NLC）dequate放大器和软件，以及标准电生理技术。内部（intrapipette）溶液使用150mM的氯化钾，1毫_氯化镁 ，0.1毫EGTA，2毫摩尔ATP-Mg系，0.1毫GTP-钠，和10mM HEPES;调节pH值至7.2用Tris。
   2. 在显微镜下，选择一个单一的，健康的细胞，与圆滑的边缘膜。附加玻璃吸管到细胞表面的前端，并检查膜电阻。这应该是周围3-6兆欧，对应于〜2微米的吸移管的尖端的内径（ID）。
   3. 轻轻按压细胞质膜的枪头，然后应用吸。细胞膜的一部分将被吸入到移液管​​，产生在10顺序的电阻 - 100千兆欧姆（千兆欧密封）。
   4. 通过破坏抽吸脉冲质膜建立全细胞的条件。
   5. 使用不表达prestin无细胞如HEK-293，作为对照的⁹。
      注:电流响应应该在5千赫进行过滤，并校正残余的串联电阻的作用的。可使用通常包含在锁相放大器的软件来执行的所有数据收集和多数分析。电容功能可以安装在与非线性电荷膜电压¹⁶的两状态波尔兹曼函数的一阶导数。
      
      

结果

在一对夫妇最近的出版物中，我们报道了一整套旨在评估HEI-OC1细胞对几种常用药理学药物的反应，以及调查prestin无功能^8,9研究。在这些研究中，我们利用了在前面部分中描述的所有协议。

一这些以前的研究的结果是，开平OC1细胞在非允许条件培养（39℃/ 10％的CO ₂ = NP-HEI-OC 1）显示出在细胞活力高度显著下降?...

讨论

在本报告中，我们描述了如何培养开平OC1细胞，并利用它们来评价药物诱导的细胞毒性的机制，并调查prestin无，耳蜗外毛细胞的分子马达的功能特性。该技术程序，然而，有足够一般可以很容易地适应不同的研究。

这里描述的所有协议需要正确的使用成熟细胞培养技术^10。就像任何其他细胞系，以开平OC1细胞工作，需要一个适当装备的细胞培养设备，具有认证生物安...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEI-OC1 cells			ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS
Class II Biological Safety cabinet	The Baker Company	Sterilgard III	AND COMPANIES INDICATED IN THE
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	5810R	PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY
Inverted microscope	Zeiss	Axiovert 25	EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR
Waterbath	Stovall	HWB115	PRODUCT COULD BE USED.
Cell counter	Nexcelom	Cellometer Auto T4
Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2	Forma Scientific	3110
Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents	Greinier Bio-One	664-160
Cell culture dishes , PS,  60 mm x 15 mm with vents	Greiner Bio-One	628160
Cellstar tissue culture flasks  250 ml	Greiner Bio-One	658-175
Cellstar tissue cultur  flasks 550 ml	Greiner Bio-One	660-175
6 well cell culture plate, with lid-Cellstar	Greiner Bio-One	657-160
Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid	Becton Dickinson	353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom	Greiner Bio-One	655098
50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars	Becton Dickinson	352070
15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars	Greiner Bio-One	188-271
PBS pH 7.4 (1x)	Life Technologies	10010-023
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-084
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Gibco/Invitrogen	21083-027
Trypsin, 0.25%	Life Technologies	25200-056
TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Assay  kit	Promega	G8091
BrdU Cell Proliferation Assay Kit	Cell Signaling	6813
Non-enzymatic cell dissociation solution	Sigma-Aldrich	C5789
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit	Promega	G8741
FACSAriaIII instrument	BD Biosciences	FACSAriaIII	With 488 nm excitation (blue laser)
Digital Blot Scanner	LI-COR	C-DiGit
Electrophoresis and Blotting Unit	Hoefer	SE300 miniVE
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software	Molecular Devices	SpectraMax 5
Patch-clamp amplifier	HEKA	EPC-10
Puller for preparing patch electrodes	Sutter Instruments	P-97