Arbeiten mit Auditory HEI-OC1-Zellen

Zusammenfassung

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

Zusammenfassung

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 °C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 °C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.

Einleitung

House Ear Institute-Corti - Organ 1 (HEI-OC1) Zellen werden aus dem Hörorgan einer transgenen Maus ^1,2 abgeleitet. Inkubation einer beliebigen Zelle aus dieser transgenen Maus , bei 33 ° C / 10% CO ₂ (permissive Bedingungen) induziert die Expression eines Gens , das Immortalisieren Entdifferenzierung und beschleunigter Proliferation auslöst; Bewegen der Zellen auf 39 ° C / 5% CO ₂ (nicht-permissive Bedingungen) führen zu einer verminderten Proliferation, Differenzierung und zumindest im Fall von HEI-OC1, Zelltod ^2,3.

HEI-OC1-Zellen wurden in unserem Labor vor über einem Jahrzehnt kloniert und charakterisiert, und die anfängliche Studien gezeigt, dass sie spezifische Marker der Cochlea-Haarzellen, wie prestin, Myosin 7a, Atoh1, BDNF, Calbindin und Calmodulin exprimieren, sondern auch Marker der Stütz Zellen wie Connexin 26 und Fibroblasten - Wachstumsfaktor - Rezeptor (FGF-R) ^2. Daher wurde vorgeschlagen, dass HEI-OC1 eine commo darstellen könnten Vorläufer für sensorische und Stützzellen des Corti - Organ ^2. Parallel Studien lieferten starke Hinweise darauf , dass ototoxic Medikamente wie Cisplatin, Gentamicin und Streptomycin induzierte Caspase-3 - Aktivierung in diesen Zellen archetypischen, während Medikamente als nicht-ototoxische, wie Penicillin, nicht ^2,3. Daher wurde diese Zelllinie als ein in vitro - System vorgeschlagen , um die zellulären und molekularen Mechanismen in Ototoxizität beteiligt zu untersuchen , und für das Screening des potentiellen Ototoxizität oder otoprotektiven Eigenschaften neuer pharmakologischer Wirkstoffe. Es wird geschätzt, dass HEI-OC1-Zellen wurden in mehr als einhundertfünfzig Untersuchungen in den letzten zehn Jahren veröffentlicht verwendet.

Während der Suche das Hauptziel der meisten Studien war auf dem Potential pro-apoptotische Wirkung verschiedener Medikamente beteiligt diese Zelllinie, andere wichtige Zellprozesse wie Autophagie und Seneszenz haben gerade erst begonnen ^4-7 in HEI-OC1 - Zellen untersucht werden. ichna aktuelle Studie aus unserem Labor ⁸ verwendeten wir HEI-OC1 - Zellen einen umfassenden Satz von Daten über den Zelltod, Überleben, Proliferation, Seneszenz und durch unterschiedliche pharmakologische Wirkstoffe in der Klinik verwendet häufig induzierten Autophagie zu sammeln. Wir verglichen auch einige der Antworten von HEI-OC1-Zellen mit denen aus HEK-293 (menschliche embryonale Nierenzellen) und HeLa (humane Epithelzellen) Empfangen identische Behandlung. Unsere Ergebnisse zeigten, dass HEI-OC1 Zellen an die jedes Medikament in einer charakteristischen Art und Weise, mit einem unverwechselbaren dosis- und zeitabhängige Empfindlichkeit auf mindestens einer der Mechanismen zu untersuch reagieren. Wir betonten auch in dieser Studie , dass eine korrekte Interpretation der experimentellen Ergebnisse erfordern parallel Studien mit mehr als eine Technik ⁸ durchgeführt wird .

In einer anderen Studie untersuchten wir die Verwendung von HEI-OC1 - Zellen die funktionelle Reaktion von Prestin, das Motorprotein von Cochlea äußeren Haarzellen (OHC) ⁹ zu bewerten . Wir berichteten Durchflusszytometrie und der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie Studien über die Muster von Prestin Ausdruck, sowie nichtlineare Kapazität (NLC) und Ganzzell-Patch-Clamp-Untersuchungen in HEI-OC1-Zellen, die in permissiven (P-HEI-OC1) und nicht permissive (NP-HEI-OC1) Bedingungen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sowohl die Gesamt prestin Expression und Plasmamembran-Lokalisations Anstieg in einer zeitabhängigen Weise in NP-HEI-OC1-Zellen. Interessanterweise fanden wir auch , dass der Anstieg in prestin Lokalisierung in der Plasmamembran von NP-HEI-OC1 - Zellen mit einer Abnahme korreliert in Na ⁺ K ⁺ ATPase, welche von der Plasmamembran zum Zytoplasma ohne wesentliche Änderungen in Gesamtzellexpressions transloziert. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass P-HEI-OC1-Zellen haben eine robuste NLC Motorfunktion prestin verbunden, die abnimmt, wenn die Dichte der prestin Moleküle, die an der Plasmamembran erhöht. Insgesamt stark diese Ergebnisse die Nützlichkeit von HEI-OC unterstützen1-Zellen auditorischen Proteine ​​zu untersuchen.

In diesem Video-Artikel beschreiben wir, wie HEI-OC1-Zellen zu Kultur, warum es bequem ist, Zellen zu verwenden, die an der permissiven Bedingungen (P-HEI-OC1) für Zytotoxizitätsuntersuchungen, wie der Mechanismus / s von arzneimittelinduzierten Zytotoxizität zu bewerten und wie elektro~~POS=TRUNC Untersuchungen (zB Patch-clamp, nicht-lineare Kapazität (NLC)) durchzuführen funktionellen Eigenschaften von prestin, der molekularen Motor Cochlea OHCs zu untersuchen.

Protokoll

1. Zellkultur

Hinweis: Alle Zellkulturprotokolle müssen unter Verwendung geeigneter Zellkulturtechniken durchgeführt werden (als Referenz siehe die ersten drei Kapitel der Zellbiologie: A Laboratory Handbook, Band I ^10). HEI-OC1-Zellen benötigen keine zusätzliche Beschichtung oder Behandlung der Zellkulturschalen für eine ordnungsgemäße Anhaftung und Wachstum. Sehr wichtig: Verwenden Sie keine Glaswaren Geschirr für die Zellkultur Zwecke; der Phänotyp und biologische Reaktion der Zellen auf pharmakologische Wirkstoffe ändert (G Kalinec & F Kalinec, nicht veröffentlicht); herkömmlichen Kunststoff-Zellkulturschalen (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung) empfohlen. Achten Sie besonders auf aseptischer Techniken Kontaminationen zu vermeiden, aber niemals Antibiotika (zB Ampicillin oder Streptomycin) mit HEI-OC1 - Zellen verwendet werden . Verwenden Sie bei Bedarf Amphotericin B. Während HeLa und HEK-293 - Zellen wurden als Kontrolle in früheren Studien mit HEI-OC1 ^8, jede andere Zelllinie könnte verwendet wordenakzeptabel für diesen Zweck.

1. Resuscitation of Frozen HEI-OC1-Zellen
   Hinweis: Dieses Protokoll kann auch mit anderen Zelllinien aus der gleichen transgenen Maus entwickelte in unserem Labor, wie OC-k3 verwendet werden, von Corti - Organ ^11,12 und SV-k1, aus Stria vascularis ^13,14.
   1. Entfernen Sie ein Fläschchen mit kryokonservierten HEI-OC1 - Zellen aus flüssigen N _2, und legen Sie es bei 37 ° C in einem Wasserbad. Versenken Sie nur die untere Hälfte des Fläschchens, und lassen Sie es zu tauen, bis nur noch eine geringe Menge an Eis in der Flasche bleibt. Wischen Sie die Außenseite des Fläschchens mit 70% Alkohol.
   2. Pipette , die Zellen aus dem Fläschchen und liefern das gesamte Volumen (~ 1,5 × 10 ⁵ Zellen / ml) langsam, tropfenweise in ein 15 ml konisches Röhrchen von 10 ml einer vorgewärmten Nährmedium enthält, wie Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium ( DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS).
   3. Entfernen DMSO durch das Rohr bei 300-500 xg für 5 min zentrifugiert, t Verwerfener Überstand und Resuspendieren der Zellen in 9 ml frisches Wachstumsmedium (DMEM + 10% FBS). Disaggregieren Klumpen oder Folien aus Zellen durch Fluss- und Rückfluss der suspendierten Zellen, aus der Pipette in das Medium und umgekehrt, drei- bis viermal mit der Spitze der Pipette den Boden des Röhrchens zu berühren.
   4. Platzieren des Gesamtvolumens der in Wachstumsmedium suspendierten Zellen in 100 mm-Durchmesser unbehandeltem, Kunststoff-Zellkulturschalen.
   5. Inkubieren der Zellen bei 33 ° C mit 10% CO ₂ (permissive Bedingungen).
2. Subculture von HEI-OC1-Zellen
   Hinweis: Vor der Konfluenz (~ 80%) sollten die Zellen in Suspension und subkultiviert, um gebracht werden, um die Kultur zu verhindern, zu sterben. Dieses Protokoll kann auch mit anderen Zelllinien entwickelt , in unserem Labor aus der gleichen transgenen Maus, wie OC-k3, von Corti - Organ ^11,12 und SV-k1, aus Stria vascularis ^13,14 verwendet werden.
   1. Entfernen Sie alte Medium und waschen Sie die Zellen mit 2 ml PBS.
   2. Decken die Zellschicht mit einer Lösung von 0,25% Trypsin, unter Verwendung von 1 ml pro 25 cm ² Oberfläche. So verschieben Sie auf den nächsten Schritt mehr als 40% der Zellen müssen gelöst werden. Untersuchen Sie die Zellen, die ein inverses Mikroskop mit und, falls erforderlich, "schlagen oder tippen Sie auf" die Kulturschalen sanft alle verbleibenden anhaftenden Zellen zu lösen.
      Hinweis: Achten Sie darauf, wie Trypsinisierung für längere Zeit kann zum Zelltod führen; nicht genug, und die übertragenen Zellen werden für die geplanten Studien unzureichend.
   3. Resuspendieren der Zellen, nach dem in 1.1.3 beschriebenen Verfahren, und sie auf einem 15 ml konischen Röhrchen.
   4. Zentrifuge für 5 Minuten bei 300 bis 500 · g, entsorgen Sie das Medium, um die Zellen mit frischem Wachstumsmedium sammeln und Saatgut sie in zumindest vier 100 mm-Durchmesser-Zellkulturschalen. Die Anzahl der Zellen pro Schale wird gewonnen auf der Menge der Zellen ab. Inkubieren der Zellen bei 33 ° C mit 10% CO ₂ (P-HEI-OC1) und dividieren wieder so oft wie erforderlich ,die geplanten Experimente oder für ein neues Lager zu erzeugen.
   5. Für die Stoffaufbereitung, ersetzen 100 mm-Schalen mit einem Durchmesser von 250 bis 550 ml Zellkulturflaschen; für Experimente, kleinere Gerichte oder mehreren Vertiefungen Platten können mehr ausreichend sein.
   6. Zur Unterscheidung brüten HEI-OC1-Zellen bei permissiven Bedingungen, bis sie ~ 80% Konfluenz erreichen; bewegen dann die Teller bis 39 ° C mit 5% CO ₂ (NP-HEI-OC1) für 2 bis 3 Wochen.
      Hinweis: Die Zellen progressiv stoppt wuchernden und Sterben. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag, um tote Zellen zu entfernen. In Abhängigkeit von der ursprünglichen Anzahl von Zellen, in der Regel nach ca. 4 Wochen keine weiteren Zellen für Experimente zur Verfügung steht. Die Differenzierung beginnt, sobald die Zellen bei NP Bedingungen gestellt werden, aber nicht jede Zelle unterscheiden im gleichen Tempo. Wichtig ist , dass Prestin - Expression und Membranlokalisierung nimmt während des Differenzierungsprozesses (Repräsentative Ergebnisse, siehe Abbildung 4), wird eine qualitative Bereitstellungund quantitative Angabe der Ebene der Differenzierung.

2. Drug Zytotoxizitätsstudien

Hinweis: HEI-OC1 - Zellen bei permissiven Bedingungen gezüchtet (P-HEI-OC1) sind für diese Studien empfohlen (siehe Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 1).

1. Zelllebensfähigkeit (MTT-Assay)
   1. Sammeln P-HEI-OC1-Zellen durch das Verfahren in 1.2 beschrieben nachfolgen und zählen sie entweder mit einem automatischen Zellzähler oder Hämozytometer. Stellen Sie die Konzentration auf 2,0 x 10 ⁵ Zellen / ml.
   2. Seed die Zellen auf 96-Well-klar-Flachbodenplatten (100 ul pro Vertiefung), Inkubation über Nacht zur Befestigung an dem Substrat, und dann behandeln sie mit den Drogen von Interesse. Vergessen Sie nicht, Leerzeichen enthalten und nicht-behandelten Zellen (Kontrolle)!
   3. Nach medikamentöse Behandlung (in der Regel 24 oder 48 Stunden bei 33 ° C), führen Sie den MTT-Test gemäß dem Protokoll des Herstellers. Im AlgemeinenDie Protokolle für diesen Test haben die folgenden Schritte:
      1. Werden 10 ul MTT-Reagenz zu jedem Well.
      2. Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 2 bis 4 Stunden, bis lila Farbstoff sichtbar ist, und dann wurden 100 ul der MTT Waschmittel Reagent hinzufügen zu jeder Vertiefung. Sie nicht die Platte schütteln.
      3. Decken Sie die Platte und lassen Sie ihn im Dunkeln für 2 bis 4 Stunden bei 37 ° C.
      4. Verwenden Leser eine Mikrotiterplatten-Absorption bei 570 nm zu messen, in jede Vertiefung, einschließlich der Zuschnitte (Wachstumsmedium allein). Normalisieren Daten die durchschnittliche OD in Kontrollzellen als 100% der Lebensfähigkeit verwendet wird.
2. Caspase 3/7 Aktivierungs-Assay
   Hinweis: HEI-OC1-Zellen bei permissiven Bedingungen gezüchtet (P-HEI-OC1) sind für diese Studien empfohlen.
   1. Sammeln Sie HEI-OC1-Zellen durch das Verfahren in 1.2 beschrieben nachfolgen und zählen sie entweder mit einem automatischen Zellzähler oder einem Hämozytometer. Stellen Sie die Konzentration auf 2,0 x 10 ⁵ Zellen / ml.
   2. Seed die Zellen auf white-walled 96-Well-Platten (100 & mgr; l pro Vertiefung), Inkubation über Nacht zur Befestigung an dem Substrat, und dann behandeln sie mit den Drogen von Interesse. Vergessen Sie nicht, Leerzeichen enthalten und nicht-behandelten Zellen (Kontrolle)!
   3. Nach medikamentöse Behandlung (in der Regel 24 oder 48 Stunden bei 33 ° C), führen Sie die Caspase-Test gemäß dem Protokoll des jeweiligen Herstellers. In der Regel haben die Protokolle für diesen Test die folgenden Schritte:
      1. Bereiten Sie die Reagenzien, mischen sie gut, und es ihnen ermöglichen, auf Raumtemperatur äquilibrieren.
      2. Entfernen der Zellen aus dem Inkubator und lassen die Platten auf Raumtemperatur äquilibrieren.
      3. Fügen Sie die angegebene Menge an Reagenz in jede Vertiefung, eine Kreuzkontamination zu vermeiden, wobei darauf geachtet, indem sie nicht zu berühren Vertiefungen, die unterschiedliche Proben mit den gleichen Pipettenspitzen.
      4. Decken Sie die Platte und mischen für 30 Sekunden einen Plattenschüttler bei 300-500 UpM.
      5. Inkubieren der Platte bei Raumtemperatur für einen Zeitraum von mindestens 30 min. determine die optimale Inkubationszeit empirisch. Wenn die Raumtemperatur schwankt eine konstante Temperatur Inkubator verwendet werden, da Temperaturschwankungen Lumineszenz Lesen beeinflussen.
      6. Messen Sie Lumineszenz in jeder Vertiefung und normalisieren Werte unter Zugrundelegung eines durchschnittlichen Lumineszenz in Kontrollzellen als 100% der Caspase-Aktivierung.
3. Zellteilung (Proliferation)
   1. Sammeln Sie HEI-OC1-Zellen durch das Verfahren in 1.2 beschrieben nachfolgen und zählen sie entweder mit einem automatischen Zellzähler oder einem Hämozytometer. Stellen Sie die Konzentration auf 2,0 x 10 ⁵ Zellen / ml.
   2. Seed die Zellen auf 96-Well-klar-Flachbodenplatten (100 ul pro Vertiefung), Inkubation über Nacht bei permissiven Bedingungen für die Befestigung an dem Substrat, und dann behandeln sie mit den Drogen von Interesse. Vergessen Sie nicht, Leerzeichen enthalten und nicht-behandelten Zellen (Kontrolle)!
   3. Eine Stunde nach der Behandlung, fügen Sie in jede Vertiefung 1 ul vorbereitet 100x BrdU (5-Brom-2'-deoxyurispeisen) Lösung, und kehren die Platten in den Inkubator bei 33 ° C.
   4. Nach 12, 24 und 48 Stunden, entfernen Sie das vorhandene Medium aus den entsprechenden Platten und waschen jede Vertiefung einmal mit PBS.
   5. Führen Sie die Zellproliferationsassay gemäß dem Protokoll des Herstellers. In der Regel haben die Protokolle für diesen Test die folgenden Schritte:
      1. Bereiten Sie die Reagenzien, einschließlich Befestigungs / Denaturierungslösung, Waschpuffer, primärer Antikörper-Nachweislösung, sekundäre Antikörper-Nachweis-Lösung und BrdU-Lösung wie im Protokoll des Herstellers angegeben.
      2. Fügen Sie die Befestigungs / Denaturierungslösung zu jeder Vertiefung, in den Mengen, in dem Protokoll des Herstellers angegeben ist, und halten Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 min.
      3. Entfernen Sie die Befestigungs / Denaturierungslösung und fügen Sie den primären Antikörper bei der Konzentration in dem Protokoll des Herstellers angegeben. Halten Sie die Platte bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
      4. Entfernen Sie die Lösung mit dem primären antibody, waschen Sie die Platte 3-mal mit Waschpuffer und dann den sekundären Antikörper bei der Konzentration in dem Protokoll des Herstellers angegeben hinzuzufügen. Halten der Platte mit dem sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für 30 min.
      5. Entfernen Sie die Lösung mit dem sekundären Antikörper, waschen Sie die Platte 3-mal mit Waschpuffer, und fügen Sie das Substrat. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur, fügen Sie die STOP-Lösung. Seien Sie vorsichtig: Steuern Sie die Änderung in der Farbe; wenn die Lösung sehr dunkel wird, stoppen Sie die Reaktion vor der Standard-Entwicklungszeit von 10 min.
      6. Lesen Sie die Absorption bei 450 nm innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stopplösung.
4. Zytotoxizität
   Hinweis: HEI-OC1-Zellen bei permissiven Bedingungen gezüchtet (P-HEI-OC1) sind für diese Studien empfohlen.
   1. Inkubieren bei permissiven Bedingungen, in der Regel für 24 bis 48 Stunden, HEI-OC1-Zellen in Zellkulturmedium allein (Kontrolle) oder Medium plus die Medikamente von Interesse.
   2. Am Ende der Behandlungs, Wasche die Zellen dreimal mit PBS und pro 25 cm ² der Oberfläche einer nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung für 3 min unter Verwendung von 1 ml lösen.
   3. Nach Abtrennen und Sammeln der Zellen durch Zentrifugation bei 3000 × g für 5 min pelletieren, entfernen Sie den Überstand und die Zellen mit dem Reagenz für 15 min im Dunkeln Fleck in Zytotoxizitätstest enthalten.
   4. Bestimmung der Anzahl der lebenden HEI-OC1-Zellen durch Flusszytometrie als Zytometer vom Hersteller der Strömung angedeutet ist.
5. Vergreisung
   1. Inkubieren bei permissiven Bedingungen, in der Regel für 24 bis 48 Stunden, HEI-OC1-Zellen in Zellkulturmedium allein (Kontrolle) oder Medium plus die Medikamente von Interesse.
   2. Bestimmen die Anzahl der Seneszenz-assoziierte beta-Galactosidase - positiven Zellen mit dem Protokoll unter Verwendung von Durchflusszytometrie beschrieben von Debacq-Chainiaux et al. ¹⁵ oder ein anderes Verfahren bekannt , um zuverlässige Ergebnisse zu liefern. Ein kurzes Protokoll für die Durchflusszytometrie ist das folgende:
      1. Am Ende der experimentellen Behandlungen, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und dann für 1 Stunde bei permissiven Bedingungen mit 100 nM Bafilomycin A1 in Zellkulturmedium inkubiert.
      2. Hinzufügen C12FDG bei einer Endkonzentration von ~ 33 & mgr; M, und weiterhin die Zellen für 1-2 h inkubiert.
      3. Wasche die Zellen zweimal mit PBS, ernten sie unter Verwendung von 1 ml pro 25 cm ² der Oberfläche einer nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung für 3 min und pelletieren sie durch Zentrifugation bei 3.000 xg für 5 min.
      4. Resuspendieren der Zellen in eiskalter PBS und bestimmen Zytometrie die Anzahl der positiven HEI-OC1-Zellen durch Durchfluss-Zytometer, wie vom Hersteller des Strömungs angegeben.
6. autophagy
   1. Sammeln Sie HEI-OC1-Zellen steuern und ausgehungert (beraubt Serum für 48 Stunden) nach dem Verfahren in 1.2 beschrieben, und verarbeiten sie für Western-Blot nach Standardprotokollen. In der Regel haben die Protokolle für die Western-Blot die folgende steps:
      1. Seed HEI-OC1 - Zellen in 6-Well - Platten bei einer Konzentration von 1,0 x 10 ⁵ Zellen / ml. Nach 24 und / oder 48 Stunden, waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS.
      2. Lyse mit 200 ul TNESV Puffer (1% NP40, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM Na ₃ VO ₄₎ mit Protease - Inhibitor - Cocktail und 1 mM PMSF für 5 min auf Eis.
      3. Sammeln Sie die Zellen (durch den Boden jeder Vertiefung Schaben), Transfer zum Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 16.800 xg für 5 min bei 4 ° C.
      4. Sammeln Sie die Überstände und zu quantifizieren, um die Proteinkonzentration des BCA-Assay verwendet wird.
      5. In 5x Ladepuffer und 1 mM DTT zu jeder Probe und kochen für 5 Minuten um die Proteine ​​zu denaturieren.
      6. Führen Sie die Proben SDS-PAGE auf einem 4-12% Gel und Transfer auf PVDF-Membranen verwendet wird.
      7. Blockieren die Membranen mit 5% fettfreier Trockenmilch in TBS-T mit 0,1% Tween 20 für 60 min bei RT.
      8. Inkubieren der Membranen über Nacht bei 4 ° C mit primären antibodies.
      9. Am nächsten Tag waschen die Membranen ausgiebig mit TBS-T, und Inkubieren mit einem Sekundärantikörper IgG, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase (HRP) (1: 1500) für 1 Stunde.
      10. Erkennen Immunreaktivität mit einer verstärkten Chemilumineszenz (ECL) Detektionssystem. Normalisieren Proteinexpressionsniveaus unter Verwendung von GAPDH (1: 2000 in TBS-T mit 10% fettfreie Trockenmilch) als Standard.
   2. In den Western-Blots untersucht, die Expression von zumindest zwei verschiedene Marker der autophagy wie Beclin-1 und LC3B (in der Regel bei 1: 1000-Verdünnung in TBS-T mit 2,5% BSA). Nicht für eine Kontrolle der Proteinexpression wie GAPDH oder Aktin aussehen vergessen.
   3. Bewerten Sie die Expression des Proteins von Interesse durch Densitometrie eines digitalen Blot-Scanner oder Computer-Software wie dem öffentlichen Bereich NIH-Image oder ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/) verwenden.

3. Elektrophysiologie Experimente mit HEI-OC1-Zellen

1. Ernte Zellen
   Hinweis: Verwenden Sie Zellen wachsen in 100 mm Durchmesser Kulturschalen bei 50% -80% Konfluenz. Trypsin, Accutase, enzymfreie Lösung oder p hosphate- b uffered s aline + e Avio d iamine t etra eine cetic Säure (PBS-EDTA) können zum Anheben der Zellen ohne nennenswerte Auswirkungen auf die Anzahl und Qualität der Gigaseals verwendet werden . In einigen Fällen jedoch macht Trypsinbehandlung die Zellen zerbrechlicher. In diesen Fällen lassen sich die Zellen für etwa 30 Minuten zu erholen, bevor die Experimente beginnen.
   1. Wasche die Zellen zweimal mit 10 ml PBS ohne Ca ²⁺ und Mg ^2+.
   2. 2 ml eines enzymfreien detacher Lösung, wie nicht-enzymatische Zelldissoziationslösung und inkubieren das Geschirr für 3 min bei 37 ° C mit 5% CO _2.
   3. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop die Ablösung der Zellen zu überprüfen. Falls erforderlich, bewegen Sie den cell Kulturschale zu mehr Zellen lösen, aber tun Sie es sanft.
      Hinweis: Verwenden Sie nicht das Gericht schütteln.
   4. 10 ml DMEM + 10% FBS und die Zellen Pipette vorsichtig auf und ab fünf Mal mit einer 10-ml-Pipette.
   5. Schauen Sie sich die Zellen unter einem Mikroskop. Wenn> 80% der Zellen bereits getrennt sind (single), sind keine weiteren Pipettieren erforderlich. Wenn die Zellen noch in Clustern sind, wiederholen Sie die vorsichtiges Pipettieren, bis mehr als 80% Zellen Single sind.
   6. Legen Sie die ~ 10 ml suspendierten Zellen in eine 15 ml konischen Röhrchen, Zentrifuge für 2 min bei 100 · g, und den Überstand verwerfen.
   7. Verwenden ~ 200 ul externen Aufzeichnungslösung (Leibovitz L-15-Medium auf 305 eingestellt - 310 mOsm mit destilliertem Wasser), um die Zellen zu resuspendieren. Eine optische Kontrolle der Zellen sollten viele einzelne, runde Zellen mit glatten Membrankanten zeigen.
2. Patch-Clamp und NLC-Messungen
   1. Führen patch-clamp-Messungen und der spannungsabhängigen nichtlinearen Kapazität (NLC) unter Verwendung einesdequate Verstärker und Software, sowie Standard-elektrophysiologischen Techniken. Als interne (intrapipette) -Lösung Einsatz 150 mM KCl, 1 mM MgCl _2, 0,1 mM EGTA, 2 mM ATP-Mg, 0,1 mM GTP-Na und 10 mM HEPES; pH-Wert auf 7,2 mit Tris.
   2. Unter dem Mikroskop, wählen Sie eine einzelne, gesunde Zelle, mit runden und glatten Membrankanten. Bringen Sie die Spitze der Glaspipette an die Zelloberfläche und Membranwiderstand überprüfen. Dies sollte etwa 3-6 Megaohm, entsprechend einem Innendurchmesser (ID) von der Spitze der Pipette von ~ 2 um betragen.
   3. Drücken Sie vorsichtig die Mikropipettenspitze gegen die Zellplasmamembran und dann absaugen. Ein Teil der Zellmembran wird in die Pipette angesaugt werden kann, einen elektrischen Widerstand in der Größenordnung von 10 zu erzeugen - 100 Gigaohm (Giga-Dichtung).
   4. Stellen Sie die Ganzzell-Zustand durch die Plasmamembran mit Saugpulsen zu stören.
   5. Verwenden Sie Zellen , die als Kontrolle ⁹ nicht Prestin, wie HEK-293 - express.
      Hinweis: Die Stromantworten bei 5 kHz gefiltert werden soll, und Korrekturen für die Auswirkungen der Restserienwiderstand aus. All die Datenerfassung und die meisten Analysen kann mit der Software in der Regel mit den Lock-in-Verstärker eingeschlossen durchgeführt werden. Kapazitätsfunktion kann auf die erste Ableitung eines Zweizustand - Boltzmann - Funktion in Bezug auf nichtlineare Ladungsmembranspannung ¹⁶ versehen sein.
      
      

Ergebnisse

In ein paar jüngsten Veröffentlichungen berichteten wir eine umfassende Reihe von Studien zur Bewertung der Reaktion von dem Ziel HEI-OC1 - Zellen auf mehrere häufig verwendete pharmakologische Wirkstoffe sowie die Untersuchung prestin Funktion ^8,9. In diesen Studien haben wir die Verwendung aller Protokolle in den vorhergehenden Abschnitten beschrieben.

Eines der Ergebnisse dieser früheren Studien war , dass HE...

Diskussion

In diesem Bericht beschreiben wir, wie sie zur Kultur HEI-OC1-Zellen und verwenden Mechanismen der medikamenteninduzierten Zytotoxizität zu bewerten und funktionellen Eigenschaften von Prestin, der molekulare Motor der Cochlea-OHC zu untersuchen. Die technischen Verfahren sind jedoch allgemein genug, um leicht an verschiedene Studien anzupassen.

Alle Protokolle hier beschrieben sind, erfordern die korrekte Verwendung von gut etablierten Zellkulturtechniken ^10. Genau wie bei jedem...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEI-OC1 cells			ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS
Class II Biological Safety cabinet	The Baker Company	Sterilgard III	AND COMPANIES INDICATED IN THE
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	5810R	PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY
Inverted microscope	Zeiss	Axiovert 25	EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR
Waterbath	Stovall	HWB115	PRODUCT COULD BE USED.
Cell counter	Nexcelom	Cellometer Auto T4
Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2	Forma Scientific	3110
Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents	Greinier Bio-One	664-160
Cell culture dishes , PS,  60 mm x 15 mm with vents	Greiner Bio-One	628160
Cellstar tissue culture flasks  250 ml	Greiner Bio-One	658-175
Cellstar tissue cultur  flasks 550 ml	Greiner Bio-One	660-175
6 well cell culture plate, with lid-Cellstar	Greiner Bio-One	657-160
Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid	Becton Dickinson	353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom	Greiner Bio-One	655098
50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars	Becton Dickinson	352070
15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars	Greiner Bio-One	188-271
PBS pH 7.4 (1x)	Life Technologies	10010-023
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-084
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Gibco/Invitrogen	21083-027
Trypsin, 0.25%	Life Technologies	25200-056
TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Assay  kit	Promega	G8091
BrdU Cell Proliferation Assay Kit	Cell Signaling	6813
Non-enzymatic cell dissociation solution	Sigma-Aldrich	C5789
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit	Promega	G8741
FACSAriaIII instrument	BD Biosciences	FACSAriaIII	With 488 nm excitation (blue laser)
Digital Blot Scanner	LI-COR	C-DiGit
Electrophoresis and Blotting Unit	Hoefer	SE300 miniVE
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software	Molecular Devices	SpectraMax 5
Patch-clamp amplifier	HEKA	EPC-10
Puller for preparing patch electrodes	Sutter Instruments	P-97