JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

Аннотация

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 °C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 °C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.

Введение

Дом Ухо институт-кортиева органа 1 (HEI-OC1) клетки получают из слухового органа трансгенной мыши 1,2. Инкубационный любой клетки от этой трансгенной мыши при 33 ° C / 10% CO 2 (разрешающих условиях) индуцирует экспрессию гена увековечивающему, запускающего де-дифференциацию и пролиферацию ускоренную; перемещение клеток до 39 ° C / 5% CO 2 (не разрешающие условия) приводят к снижению пролиферации, дифференцировки и, по крайней мере , в случае Hei-OC1, гибели клеток 2,3.

Вуз-OC1 клетки были клонированы и охарактеризованы в нашей лаборатории более десяти лет назад, и первоначальные исследования показали, что они выражают специфические маркеры волосковых клеток улитки, такие как Prestin, миозина 7а, Atoh1, BDNF, кальбиндин и кальмодулин, но и маркеры поддержки клетки , такие как коннексина 26 и рецептора фактора роста фибробластов (FGF-R) 2. Поэтому было высказано предположение о том, что HEI-OC1 может представлять собой Коммоп прародителем для сенсорных и опорных клеток органа Корти 2. Параллельные исследования убедительно показали , что архетипическом ототоксичен препараты , как цисплатин, гентамицин и стрептомицин индуцированной активации каспазы-3 в этих клетках, в то время как препараты считаются не ототоксичен, как пенициллин, не сделал 2,3. Таким образом, эта клеточная линия была предложена в качестве системы в пробирке для исследования клеточных и молекулярных механизмов , участвующих в ототоксичность и для скрининга потенциальных ототоксичность или otoprotective свойств новых фармакологических препаратов. Предполагается, что HEI-OC1 клетки были использованы в более чем ста пятидесяти исследований, опубликованных за последние десять лет.

Принимая во внимание , глядя на потенциального проапоптотического влияния различных препаратов была основной целью большинства исследований , связанных с этой клеточной линии, другие важные клеточные процессы , такие как аутофагии и старении только начали исследовать в клетках HEI-OC1 4-7. яна недавнем исследовании нашей лаборатории 8, мы использовали клетки HEI-OC1 собрать полный набор данных о гибели клеток, выживание, пролиферацию, старении и аутофагии , вызванных различными фармакологическими препаратами , часто используемых в клинике. Мы также сравнили некоторые из ответов HEI-OC1 клеток с теми из НЕК-293 (эмбриональные клетки почки человека) и HeLa (эпителиальные клетки человека), получающих идентичную обработку. Наши результаты показали, что Hei-OC1 клетки реагируют на каждого лекарственного средства характерным образом, с характерным дозы и времени зависит чувствительность, по крайней мере, один из механизмов, на стадии изучения. Мы также подчеркнули , в этом исследовании , что правильная интерпретация экспериментальных результатов потребует проведения параллельных исследований с более чем одной техники 8.

В другом исследовании мы изучали использование клеток HEI-OC1 оценить функциональную характеристику Prestin, двигатель белок кохлеарных наружных волосковых клеток (OHCs) 9 . Мы сообщили проточной цитометрии и конфокальной микроскопии исследования лазерного сканирования по образцу Prestin выражения, а также нелинейной емкости (НЖК) и целые исследования прижимных клеток патч в Вуз-OC1 клеток, культивируемых в разрешительный (P-Hei-OC1) и не- разрешающие (NP-вуз-OC1) условиях. Наши результаты показали, что как общее выражение Prestin и плазмалеммы увеличение локализации в зависимости от времени в клетках NP-Вуз-OC1. Интересно отметить , что мы также обнаружили , что увеличение Prestin локализации в плазматической мембране клеток NP-Hei-OC1 коррелировало с уменьшением Na + K + АТФазы, которая транслокации из плазматической мембраны в цитоплазму без существенных изменений в общей экспрессии в клетках. Кроме того, мы показали, что Р-Вуз-OC1 клетки имеют надежный НЖК, связанный с Prestin двигательной функции, которая уменьшается, когда плотность молекул Prestin, присутствующих на мембране увеличена. В целом, эти результаты убедительно подтверждают полезность Hei-OC1 клетки для исследования слуховых белков.

В этом видео статье мы опишем, как культура клеток HEI-OC1, почему удобно использовать клетки растут в разрешающих условиях (P-Вуз-OC1) для исследований цитотоксичности, как оценить механизм / с лекарственно-индуцированной цитотоксичности и как для выполнения электрофизиологических исследований (например, патч-зажим, нелинейную емкость (НЖК)) для исследования функциональных свойств Prestin, молекулярного двигателя кохлеарного OHCs.

протокол

1. Культура клеток

Примечание: Все протоколы культивирования клеток должны быть выполнены с использованием надлежащих методов культивирования клеток (для справки см первые 3 главы клеточной биологии: A Laboratory Handbook, том I 10). Вуз-OC1 клетки не требуют какого-либо дополнительного покрытия или обработка посуды клеточных культур для надлежащего соблюдения и роста. Очень важно: не используйте стеклянную посуду посуду для целей культивирования клеток; фенотип и биологическая реакция клеток на фармакологических препаратов изменится (G & F Kalinec Kalinec, неопубликованный); Рекомендуется использовать традиционные блюда из пластика для культивирования клеток (см Таблицу материалов / оборудования). Обратите особое внимание на асептики , чтобы избежать загрязнения, но никогда не используют антибиотики (например, ампициллин или стрептомицин) с клетками HEI-OC1. При необходимости использовать амфотерицина В. В то время как HeLa и НЕК-293 клеток, были использованы в качестве контроля в предыдущих исследованиях с Hei-OC1 8, любая другая линия клеток можетбыть приемлемыми для этой цели.

  1. Реанимация Замороженный HEI-OC1 клеток
    Примечание: Этот протокол также может быть использован с другими клеточными линиями из той же трансгенной мыши , разработанной в нашей лаборатории, такие как OC-K3, из органа Корти 11,12 и SV-k1, с полоской vascularis 13,14.
    1. Удалить флакон криоконсервированных клеток Hei-OC1 из жидкого N 2, и поместить его на водяной бане при 37 ° С. Погрузите только нижнюю половину флакона, и дайте ему оттаять, пока лишь небольшое количество льда остается во флаконе. Протрите наружную поверхность флакона с 70% -ным спиртом.
    2. Пипетировать клетки из флакона и доставить весь объем (~ 1,5 × 10 5 клеток / мл) медленно, по капле, в 15 мл коническую пробирку , содержащую 10 мл подогретого среды для роста, как модифицированной среде Игла Дульбекко ( DMEM), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
    3. Удалить ДМСО при центрифугировании трубки при температуре 300-500 мкг в течение 5 мин, отбрасывая тон супернатант и ресуспендирования клеток в 9 мл свежей среды для роста (DMEM + 10% FBS). Дезагрегации комки или листы клеток флюса и флегмы взвешенных клеток, из пипетки в среде, и наоборот, в три-четыре раза с кончиком пипетки касаясь дна трубки.
    4. Поместите общий объем клеток, суспендированных в среде роста в мм диаметра 100 необработанных, пластиковые чашки для культивирования клеток.
    5. Инкубируйте клетки при 33 ° C с 10% CO 2 (разрешающих условиях).
  2. Субкультура HEI-OC1 клеток
    Примечание: До слияния (~ 80%), клетки должны быть приведены в подвеске и субкультивироваться для того, чтобы предотвратить культуру смерти. Этот протокол также может быть использован с другими клеточными линиями , разработанных в нашей лаборатории из той же трансгенной мыши, например, OC-K3, из органа Корти 11,12 и SV-k1, с полоской vascularis 13,14.
    1. Удалите старую среду и промыть клетки с 2 мл PBS.
    2. Накройте клеточный монослой с раствором 0,25% трипсина, с использованием 1 мл на 25 см 2 поверхности. Для того, чтобы перейти к следующему шагу более чем 40% клеток должна быть отсоединена. Исследуют клетки с использованием инвертированного микроскопа, и, при необходимости, "шлепать или нажмите" культуральных чашек осторожно, чтобы освободить все оставшиеся прикрепленные клетки.
      Примечание: Будьте осторожны, как трипсином в течение длительного времени может привести к гибели клеток; не достаточно, а переданные клетки будут недостаточными для планируемых исследований.
    3. Ресуспендируют клеток, следуя процедуре, описанной в разделе 1.1.3, и передавать их в коническую пробирку на 15 мл.
    4. Центрифуга в течение 5 мин при 300-500 XG, выбросьте среду, собирают клетки со свежей средой роста и семя их в, по меньшей мере, четыре 100 мм диаметра блюда клеточной культуры. Число клеток на чашку, будет зависеть от количества клеток, выделенных. Инкубируйте клетки при 33 ° C с 10% CO 2 (С-Hei-OC1) и разделить снова столько раз , сколько необходимо длязапланированные эксперименты или для создания нового запаса.
    5. Для подготовки запасов, заменить блюда мм диаметром 100 от 250-550 мл колбах для культивирования клеток; для экспериментов, небольшие блюда или мульти-луночные планшеты могут быть более адекватными.
    6. Для дифференцировки, клетки инкубировать HEI-OC1 в разрешающих условиях, пока они не достигают ~ 80% слияния; затем переместите посуду до 39 ° C с 5% CO 2 (NP-Вуз-OC1) в течение 2 -х до 3 -х недель.
      Примечание: Клетки будут постепенно остановить пролиферирующих и умирает. Изменение среды через день, чтобы удалить мертвые клетки. В зависимости от исходного количества клеток, как правило, после ~ 4 недели не больше ячеек не будут доступны для экспериментов. Дифференциация начинается, как только клетки помещают в условиях NP, но не каждая клетка дифференцируются в том же темпе. Важно отметить, что Prestin экспрессии и локализации мембраны возрастает в процессе дифференцировки (см Представитель Результаты, рисунок 4), обеспечивая качественноеи количественный показатель уровня дифференциации.

2. Drug Исследования цитотоксичности

Примечание: Вуз-OC1 клетки , выращенные в разрешающих условиях (P-Вуз-OC1) рекомендуются для этих исследований (см Представитель Результаты, Рисунок 1).

  1. Жизнеспособность клеток (МТТ)
    1. Собирают клетки Р-Hei-OC1, следуя процедуре, описанной в разделе 1.2, и сосчитать их либо с автоматическим счетчиком клеток или гемоцитометра. Регулировка концентрации до 2,0 х 10 5 клеток / мл.
    2. Семенной клетки на 96-луночный прозрачных плоскодонных планшетах (100 мкл на лунку), инкубировать в течение ночи для прикрепления к субстрату, а затем обработать их с препаратами, представляющим интерес. Не забывайте включать пробелы и необработанными клетками (контроль)!
    3. После того, как медикаментозное лечение (как правило, 24 или 48 ч при температуре 33 ° С), выполняют МТТ анализ в соответствии с протоколом производителя. В целом, Протоколы для данного анализа имеют следующие шаги:
      1. Добавьте 10 мкл реагента МТТ в каждую лунку.
      2. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение от 2 до 4 ч до тех пор, фиолетовый краситель не виден, а затем добавить 100 мкл МТТ Моющая реактива в каждую лунку. Не встряхивайте пластину.
      3. Закройте планшет и оставить его в темноте в течение 2 до 4 ч при температуре 37 ° С.
      4. Используйте устройство для чтения микропланшетов пластины для измерения оптической плотности при длине волны 570 нм в каждую лунку, включая пробелы (рост среднего в одиночку). Нормализация данных с использованием среднего OD в контрольных клетках, как 100% от жизнеспособности.
  2. Каспазы 3/7 Активация Анализ
    Примечание: Вуз-OC1 клетки, выращенные в разрешающих условиях (P-Вуз-OC1) рекомендуются для этих исследований.
    1. Собирают клетки Hei-OC1, следуя процедуре, описанной в разделе 1.2, и сосчитать их либо с автоматическим счетчиком клеток или гемоцитометра. Регулировка концентрации до 2,0 х 10 5 клеток / мл.
    2. Семенной клеток на КНИТО-стеной 96-луночные планшеты (100 мкл на лунку), инкубировать в течение ночи для прикрепления к субстрату, а затем обработать их с препаратами, представляющим интерес. Не забывайте включать пробелы и необработанными клетками (контроль)!
    3. После медикаментозного лечения (как правило, 24 или 48 ч при температуре 33 ° С), выполнить анализ каспазы следующий протокол соответствующего производителя. В целом, протоколы для данного анализа имеют следующие шаги:
      1. Подготовка реагентов, хорошо перемешать, и дать им возможность уравновешивания до комнатной температуры.
      2. Удалить клетки из инкубатора и позволяют пластины уравновешиваться до комнатной температуры.
      3. Добавьте указанное количество реагента в каждую лунку, соблюдая осторожность, чтобы избежать перекрестного загрязнения, не касаясь лунки, содержащие различные образцы с одинаковыми наконечниками пипеток.
      4. Закройте планшет и перемешивают в течение 30 секунд с помощью шейкере при температуре 300-500 оборотов в минуту.
      5. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение периода, по крайней мере, 30 мин. Determinе оптимальный период инкубации эмпирически. Если температура в помещении колеблется использовать постоянной температуры инкубатора, так как колебания температуры будут влиять на чтение люминесценции.
      6. Измеряют люминесценцию в каждую лунку, и нормализовать значения с использованием среднего люминесценцию в контрольных клетках, как 100% от активации каспазы.
  3. Деление клеток (пролиферации)
    1. Собирают клетки Hei-OC1, следуя процедуре, описанной в разделе 1.2, и сосчитать их либо с автоматическим счетчиком клеток или гемоцитометра. Регулировка концентрации до 2,0 х 10 5 клеток / мл.
    2. Семенной клетки на 96-луночный прозрачных плоскодонных планшетах (100 мкл на лунку), инкубируют в течение ночи при разрешающих условиях для прикрепления к субстрату, а затем обработать их с препаратами, представляющим интерес. Не забывайте включать пробелы и необработанными клетками (контроль)!
    3. Через час после обработки, добавляют в каждую лунку по 1 мкл приготовленной 100x BrdU (5-Бром-2'-deoxyuriобед) решение, и вернуть пластины в инкубатор при 33 ° С.
    4. После того, как 12, 24 и 48 ч, удалить существующую среду из соответствующих пластин и промыть каждую лунку один раз PBS.
    5. Провести анализ пролиферации клеток в соответствии с протоколом производителя. В целом, протоколы для данного анализа имеют следующие шаги:
      1. Подготовка реагентов, в том числе фиксации / денатурирующих раствор, моющий буфер, раствор первичного обнаружения антител, вторичное решение для обнаружения антител и BrdU раствора, как указано в протоколе изготовителя.
      2. Добавьте решение фиксирующее / денатурации в каждую лунку в количествах, указанных в протоколе изготовителя, и держать планшет при комнатной температуре в течение 30 мин.
      3. Удалите / денатурирующих фиксирующим раствором и добавляют первичное антитело в концентрации, указанной в протоколе изготовителя. Хранить планшет при комнатной температуре в течение 1 часа.
      4. Удалите раствор с первичным муравейibody, мыть пластины 3 раза промывочным буфером, а затем добавить вторичные антитела в концентрации, указанной в протоколе изготовителя. Держите пластину с вторичным антителом, при комнатной температуре в течение 30 мин.
      5. Удалите раствор с вторичным антителом, мыть пластины 3 раза промывочным буфером, и добавьте субстрат. Через 10 мин инкубации при комнатной температуре, добавляют раствор STOP. Будьте осторожны: контролировать изменение в цвете; если решение становится очень темно, остановить реакцию до начала стандартного времени разработки 10 мин.
      6. Измерить оптическую плотность при 450 нм в течение 30 мин после добавления стоп-раствора.
  4. Цитотоксичность
    Примечание: Вуз-OC1 клетки, выращенные в разрешающих условиях (P-Вуз-OC1) рекомендуются для этих исследований.
    1. Инкубируют при разрешающих услови х, как правило, в течение 24-48 ч, клетки Hei-OC1 только в клеточной культуральной среде (контроль) или среда плюс интересующих лекарственных средств.
    2. В конце лечения, Промыть клетки три раза PBS, и отделяться с использованием 1 мл на 25 см 2 площади поверхности неферментативного раствора для диссоциации клеток в течение 3 мин.
    3. После стягивания, сбора и осаждения клеток центрифугированием при 3000 х г в течение 5 мин, удалить супернатант, и окрашивать клетки в течение 15 мин в темноте с реагентом, включенного в цитотоксичности.
    4. Определить количество живых клеток Hei-OC1 с помощью проточной цитометрии, как указано изготовителем проточного цитометра.
  5. физиологическое старение
    1. Инкубируют при разрешающих услови х, как правило, в течение 24-48 ч, клетки Hei-OC1 только в клеточной культуральной среде (контроль) или среда плюс интересующих лекарственных средств.
    2. Определить количество Старение-ассоциированные бета-галактозидазы - положительных клеток с помощью проточной цитометрии с протоколом , описанным Debacq-Chainiaux и др. 15 или другим способом , известным , чтобы обеспечить надежные результаты. Краткий протокол для проточной цитометрии является следующее:
      1. В конце эксперимента обработок, промыть клетки три раза PBS, а затем инкубировать их с 100 нМ Bafilomycin A1 в культуральной среде клеток в течение 1 ч при разрешающих условиях.
      2. Добавить C12FDG в конечной концентрации ~ 33 мкМ, и продолжают инкубацию клеток в течение 1-2 ч.
      3. Вымойте клетки дважды с PBS, собирают их с использованием 1 мл на 25 см 2 площади поверхности неферментативного раствора диссоциации клеток в течение 3 мин, и гранул их центрифугированием при 3000 х г в течение 5 мин.
      4. Ресуспендируют клеток в охлажденном льдом PBS и определяют количество положительных клеток Hei-OC1 с помощью проточной цитометрии, как указано изготовителем проточном цитометре.
  6. аутофагия
    1. Собирают Hei-OC1 контрольные клетки и голодали (лишенные сыворотки в течение 48 ч) с помощью следующей процедуры, описанной в разделе 1.2, и обрабатывать их для Вестерн-блоттинга в соответствии со стандартными протоколами. В целом, протоколы для вестерн-блоттинга имеют следующую стEPS:
      1. Семенной Hei-OC1 клеток в 6-луночные планшеты при концентрации 1,0 х 10 5 клеток / мл. После того, как 24 и / или 48 ч, промыть клетки с охлажденным льдом PBS.
      2. Лизируйте с 200 мкл буфера TNESV (1% NP40, 50 мМ Трис-HCl , рН 7,5, 100 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ Na 3 VO 4) с ингибитором протеаз и 1 мМ PMSF в течение 5 мин на льду.
      3. Собирают клетки (путем соскоба в нижней части каждой лунки), трансфер в микроцентрифужных пробирках и центрифугируют при 16800 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
      4. Собирают супернатанты и количественного определения концентрации белка с помощью ВСА анализа.
      5. Добавить 5х буфера для загрузки и 1 мМ DTT, к каждому образцу и кипятят в течение 5 мин для денатурации белков.
      6. Запуск образцов с помощью SDS-PAGE на 4-12% геле и переносят на мембраны ПВДФ.
      7. Блок мембраны с 5% обезжиренным сухим молоком в TBS-T с 0,1% твина 20 в течение 60 мин при комнатной температуре.
      8. Инкубацию мембраны в течение ночи при 4 ° С с первичным муравейibodies.
      9. На следующий день, промывка мембран экстенсивно с TBS-T, и инкубировать с вторичным антителом IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) (1: 1500) в течение 1 часа.
      10. Обнаружение иммунореактивности с системой обнаружения усиливается хемилюминесценции (ECL). Нормализация уровней экспрессии белка с использованием GAPDH (1: 2000 в TBS-T с в 10% обезжиренного сухого молока) в качестве стандарта.
    2. В Вестерн-блоттинга исследовать экспрессию, по крайней мере, два различных маркеров аутофагией, такие как Beclin-1 и LC3B (как правило, в соотношении 1: 1000 разбавления в TBS-T, с 2,5% БСА). Не забудьте взглянуть на контроль экспрессии белка, такие как GAPDH или актина.
    3. Оценка экспрессии интересующего белка с помощью денситометрии с помощью цифрового сканера блот или компьютерного программного обеспечения, таких как публичного домена NIH Image или ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).

3. Электрофизиологические Эксперименты с вузом-OC1 клеток

  1. Сбор клеток
    Примечание: Используйте клетки растут в чашки для культивирования диаметром 100 мм на 50% -80% сплошности. Трипсин, Accutase, фермент-бесплатное решение, или р hosphate- б uffered сек Алины + е thylene d iamine т ETRA в cetic кислоту (PBS-EDTA) могут быть использованы для подъема клеток без значительного воздействия на количество и качество gigaseals , В некоторых случаях, однако, обработка трипсином делает клетки более хрупкими. В этих случаях, позволяют клеткам восстановиться в течение примерно 30 минут, перед началом экспериментов.
    1. Вымойте клетки дважды с 10 мл PBS без Са 2+ и Mg 2+.
    2. Добавляют 2 мл фермента раствора без съемника, например неферментативного раствора клеточной диссоциации, и инкубировать блюда в течение 3 мин при температуре 37 ° С с 5% CO 2.
    3. С помощью инвертированного микроскопа, чтобы проверить отряд клеток. При необходимости, переместите CELл культуры блюдо, чтобы отделить больше клеток, но сделать это мягко.
      Примечание: Не трясите блюдо.
    4. Добавьте 10 мл DMEM + 10% FBS и пипеткой клетки нежно вверх и вниз в пять раз с 10-мл пипетки.
    5. Посмотрите на клетки под микроскопом. Если> 80% клеток уже разделены (один), не далее пипеткой не требуется. Если клетки все еще находятся в кластерах, повторите осторожно пипеткой до более чем 80% клеток не одиноки.
    6. Поместите ~ 10 мл взвешенных клеток в коническую пробирку на 15 мл, центрифуга в течение 2 мин при 100 мкг, и отбросить супернатант.
    7. Используйте ~ 200 мкл внешнего раствора записи (Лейбовиц L-15 средней доводят до 305 - 310 мОсм с дистиллированной водой) для ресуспендирования клеток. Оптический контроль ячеек должны показать много одиночных, круглые клетки с гладкими краями мембраны.
  2. Патч-зажим и НЖК Измерения
    1. Выполните патч-зажим и измерения напряжения зависящих от нелинейной емкости (НЖК) с использованиемdequate усилители и программного обеспечения, а также стандартные электрофизиологические методы. Как использование внутреннего раствора (intrapipette) 150 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 0,1 мМ EGTA, 2 мМ АТФ-Mg, 0,1 мМ ГТФ-Na, и 10 мМ HEPES; доведения рН до 7,2 с помощью Триса.
    2. Под микроскопом, выбрать одну, здоровую клетку, с круглыми и гладкими краями мембраны. Прикрепите кончик стеклянной пипетки на клеточной поверхности и проверить сопротивление мембраны. Это должно быть около 3-6 МОм, что соответствует внутреннему диаметру (ID) наконечника пипетки из ~ 2 мкм.
    3. Слегка нажмите на кончик микропипетки против плазматической мембраны клетки, а затем применить всасывание. Часть клеточной мембраны будет отсасывается в пипетку, генерируя электрическое сопротивление в порядка 10 - 100 gigaOhms (gigaseal).
    4. Установить состояние целой клетки путем разрушения плазматической мембраны с всасывающим импульсами.
    5. Использование клеток , которые не экспрессируют Prestin, такие как НЕК-293, в качестве контроля 9,
      Примечание: Текущие ответы должны быть отфильтрованы на 5 кГц, а также исправления, сделанные для эффектов остаточного сопротивления серии. Все сбора данных и большинство анализов могут быть выполнены с использованием программного обеспечения, как правило, включены с замком усилителями. Функция емкостного сопротивления может быть установлен на первой производной двух государственной функции Больцмана , связанной нелинейной заряд мембраны напряжения 16.

Результаты

В нескольких недавних публикациях мы сообщали , полный набор исследований , направленных на оценку реакции клеток HEI-OC1 к нескольким наиболее часто используемых фармакологических препаратов, а также исследовать функцию Prestin 8,9. В этих исследованиях мы использова...

Обсуждение

В этом докладе мы опишем, как культура клеток HEI-OC1 и использовать их для оценки механизмов цитотоксичности медикаментозного и исследовать функциональные свойства Prestin, молекулярного двигателя кохлеарной OHCs. Технические процедуры, однако, являются достаточно общими, чтобы быть легко а...

Раскрытие информации

The authors declare no existing or potential conflict of interest.

Благодарности

This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
HEI-OC1 cellsALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS 
Class II Biological Safety cabinetThe Baker CompanySterilgard IIIAND COMPANIES INDICATED IN THE
Refrigerated centrifugeEppendorf5810RPREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY
Inverted microscopeZeissAxiovert 25EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR
WaterbathStovallHWB115PRODUCT COULD BE USED.
Cell counterNexcelomCellometer Auto T4
Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2Forma Scientific3110
Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with ventsGreinier Bio-One664-160
Cell culture dishes , PS,  60 mm x 15 mm with vents Greiner Bio-One628160
Cellstar tissue culture flasks  250 mlGreiner Bio-One658-175
Cellstar tissue cultur  flasks 550 mlGreiner Bio-One660-175
 6 well cell culture plate, with lid-CellstarGreiner Bio-One657-160
Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lidBecton Dickinson353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottomGreiner Bio-One655098
50 ml Polypropylene conical tube with cap CellstarsBecton Dickinson 352070
15 ml Polypropylene conical tubes with cap-CellstarsGreiner Bio-One188-271
PBS pH 7.4 (1x) Life Technologies10010-023
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Life Technologies11965-084
Fetal bovine serum (FBS) HycloneSH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol redGibco/Invitrogen21083-027
Trypsin, 0.25% Life Technologies25200-056
TACS MTT Cell Proliferation Assay KitTrevigen4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Assay  kitPromega  G8091 
BrdU Cell Proliferation Assay Kit Cell Signaling6813
Non-enzymatic cell dissociation solution Sigma-AldrichC5789
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay KitPromega  G8741 
FACSAriaIII instrument BD Biosciences FACSAriaIIIWith 488 nm excitation (blue laser)
Digital Blot ScannerLI-CORC-DiGit
Electrophoresis and Blotting UnitHoeferSE300 miniVE
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 SoftwareMolecular DevicesSpectraMax 5
Patch-clamp amplifierHEKAEPC-10
Puller for preparing patch electrodesSutter InstrumentsP-97

Ссылки

  1. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
  2. Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
  3. Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
  4. Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
  5. Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
  6. Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
  7. Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
  8. Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
  9. Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
  10. Celis, J. E. . Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (2006).
  11. Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
  12. Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
  13. Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
  14. Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  16. Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
  17. Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
  18. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
  19. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
  20. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
  21. Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
  22. Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
  23. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
  24. Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
  25. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  26. Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
  27. Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

115OC1FACSPrestin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены