عن طريق الاستجابة أثار اللمس والحركة فحوصات لتقييم أداء العضلات وظيفة في الزرد

Summary

Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.

Abstract

تنمية العضلات الزرد يتم حفظها للغاية مع أنظمة الثدييات مما يجعلها نموذجا ممتازا لدراسة وظيفة العضلات والمرض. العديد من الاعتلالات العضلية التي تؤثر على وظيفة العضلات والهيكل العظمي يمكن تقييم بسرعة وسهولة في الزرد خلال الأيام القليلة الأولى من التطور الجنيني. قبل 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، wildtype الزرد العقد بصورة تلقائية العضلات الذيل وبنسبة 48 HPF، الزرد معرض تسيطر السلوكيات السباحة. انخفاض في وتيرة، أو تغييرات أخرى في، هذه الحركات قد تشير إلى وجود ضعف في العضلات والهيكل العظمي. لتحليل سلوك السباحة وتقييم أداء العضلات في التنمية الزرد في وقت مبكر، ونحن على حد سواء الاستفادة من الهروب الاستجابة والحركة المقايسات أثار اللمس.

المقايسات استجابة الهروب أثار اتصال يمكن استخدامها لتقييم أداء العضلات أثناء حركات انفجار قصيرة الناتجة عن تقلص الألياف العضلية سريعة نشل. وردا على حافز خارجي، وهو في هذه الحالة هو الصنبور علىالرأس، wildtype الزرد في 2 يوما بعد الإخصاب (DPF) عادة ما تظهر موجة السباحة قوية، يرافقه المنعطفات الحادة. أسلوبنا الكمي وظيفة العضلات والهيكل العظمي عن طريق قياس أقصى تسارع خلال حركة السباحة انفجار، وتسارع يجري يتناسب طرديا مع القوة الناتجة عن تقلص العضلات.

في المقابل، تستخدم فحوصات الحركة في وقت مبكر خلال نمو اليرقات الزرد لتقييم أداء العضلات خلال فترات متواصلة من النشاط العضلي. باستخدام نظام تتبع لرصد سلوك السباحة، ونحن الحصول على حساب الآلي وتيرة النشاط والمسافة في 6 أيام الزرد القديم، وهذا انعكاس وظيفة الهيكل العظمي والعضلات الخاصة بهم. قياسات الأداء السباحة قيمة لتقييم المظهري من نماذج المرض والفحص الإنتاجية العالية من الطفرات أو العلاجات الكيميائية التي تؤثر على وظيفة العضلات والهيكل العظمي.

Introduction

وعلى مدى العقد الماضي الزرد تستخدم بشكل متزايد لدراسة العضلات بيولوجيا الخلية والمرض. تطوير الخارجية السريعة للجنين الزرد، إلى جانب وضوحه البصرية، بما يسمح للرؤية مباشرة من تشكيل العضلات والنمو والوظيفة. عملية تنمية العضلات والحفظ جدا في الزرد وسمحت هذه النمذجة الناجح لمجموعة من أمراض العضلات بما في ذلك ضمور العضلات واعتلال العضلات الخلقية ^1-8. لم تقدم دراسة تفصيلية لنماذج الزرد فقط رؤى جديدة في البيولوجيا المرضية من هذه الظروف ولكن أيضا توفير منصة لاختبار علاجات مناسبة ^6،9-13.

تحليل النماذج الزرد من أمراض العضلات يعتمد على فحوصات موثوقة وقابلة للتكرار لقياس أداء العضلات. وقياس الدراسات السابقة بنجاح قدرة توليد قوة العضلات جذع الزرد في الأسماك ما بين 3 و 7 DPF بواسطةتحفيز بالكهرباء تقلص من الأسماك يجمد تعلق على نظام القوة التنبيغ ^14. هذا يمكن أن توفر قياسات مفصلة للقوة ولكنها ليست مناسبة بشكل مثالي لتجارب إنتاجية أعلى، وهناك مزايا لقياس أداء العضلات أثناء السباحة. في 2 DPF العضلات الزرد تعمل بكامل طاقتها ويمكن أن الأسماك تثير حركات السباحة انفجار في الاستجابة للمؤثرات. يتم استخدام الهروب فحص استجابة لمسة واستحضار لقياس التسارع أثناء الحركة السباحة انفجار، والتي يمكن استخدامها كمقياس لقوة مقلص.

أحد التدابير الأكثر استخداما من وظيفة العضلات في المرضى الذين يعانون اعتلال عضلي هو الاختبار مسافة 6 دقائق، الذي يسجل المسافة الإجمالية مشى على سطح مستو من الصعب ^15،16. لقد طبقنا اختبار مشابه لقياس وظيفة العضلات في 6 يرقات DPF الزرد، حيث أننا رصد المسافة الإجمالية سبحوا، وعدد من الحركات التي أدلى بها كل يرقة على مدى فترة 10 دقيقة. يتم تنفيذ هذاباستخدام نظام التتبع الآلي، والتي توفر قياسات موثوقة وعالية الإنتاجية من أداء العضلات. الاختبارين العضلات هي تكرار للغاية واستخدمت لتحديد الاختلافات في أداء العضلات في نماذج عضلي الزرد ^8.

Protocol

1. أثار اللمس الفحص الاستجابة

1. إعداد 2 DPF الأجنة مقابل أثار اللمس الفحص الاستجابة
   1. تأكد من أن الوقت من اليوم الذي يتم فيه إجراء اختبار يتسق بين التجارب بسبب النشاط يمكن أن تختلف بشكل كبير طوال اليوم ^17،18.
      ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ تجربة أعمى وترتيب التجارب العشوائية للحد من الأعمال الفنية التجريبية.
   2. تعيين الأسماك سلالات عددا، الذي هو غير معروف للفرد تنفيذ التجربة. وفي أعقاب ذلك، باستخدام الأدوات المتاحة على الانترنت بحرية تولد قائمة العشوائية التي تملي ترتيب الاختبار.
   3. ساعة واحدة على الأقل قبل الاختبار والأجنة dechorionate من تمزيق حفرة في المشيمه وسحب بلطف المشيماء بصرف النظر باستخدام زوج من ملاقط غرامة. إزالة أي حطام من طبق بتري قبل أن تعود إلى 28 درجة مئوية الحاضنة.
2. أداء أثار اللمس الفحص الاستجابة
   1. ستا الحرارةجنرال الكتريك إلى 28 درجة مئوية على الأقل 15 دقيقة قبل بدء الاختبار.
      ملاحظة: يتم التحكم في درجة حرارة هذه المرحلة، وسوف تظل في 28   ° مئوية لمدة الاختبار. ودرجة الحرارة تؤثر على النشاط ولذلك فمن المهم للحفاظ على درجة حرارة ثابتة. إذا مرحلة ساخنة لم يعد متوفرا ثم درجة حرارة الماء يجب مراقبة وينبغي إجراء جميع التجارب في نفس درجة الحرارة.
   2. وضع طبق بتري مليئة المتوسطة الجنين (5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.17mM بوكل، 0.33 ملي CaCl _2، 0.33 ملي MgSO ₄ في الماء) على مرحلة مضيئة وتركيب كاميرا عالية السرعة على طبق بتري.
   3. إطلاق برنامج تسجيل كاميرا الفيديو (مثل تيار بيكسل 5، هو موضح هنا) وتحت علامة التبويب "مساحة العمل" تحديد 1000 إطار في الثانية (1000 إطارا في الثانية)، وسرعة القبض على ضمان عمل السباحة سريع من الأسماك يتم تسجيلها.
   4. العمل مع جنين واحد في وقت واحد، وضع الجنين في MIDDلو طبق بتري مع الزرد واضحة للعيان في مجال الرؤية.
      ملاحظة: إذا كان الجنين يسبح مسبق بعيدا لبدء التجربة استبداله بآخر، كما يسترد وضعية الجنين قد يؤدي إلى أن تصبح المتفجرات إلى التحفيز والردود انفجار المتكررة قد يشجع ضعف العضلات في بعض النماذج المرض.
   5. بدء التسجيل عن طريق النقر على زر "سجل"، وتقديم الحوافز ميكانيكية حسية إلى الجنين عن طريق لمس برفق مع إبرة حادة في الجزء العلوي من الرأس.
   6. إيقاف التسجيل بعد أن سبح الجنين للخروج من مجال الرؤية أو إعادتها إلى بقية.
      ملاحظة: قمم تسارع في 0.2 ثانية الأولى من الاستجابة الهروب انفجر بعد التحفيز الميكانيكي. لذلك، تأكد من أن على الأقل خلال 0.2 ثانية الأولى من الاستجابة الهروب تسجيل الأسماك في مجال الرؤية. باستخدام برنامج هو موضح في الخطوة 1.2.3، سيتم حفظ البياناتكملف فيديو افي. فيديو البديل التقاط برامج مثل لقطة فيديو مجانية أو Softonic، هي متاحة بحرية للتحميل وكلا الأمرين، ويمكن أيضا أن تستخدم.
   7. العودة الجنين إلى طبق بتري جديد وحدد الجنين آخر للاختبار. أداء الاختبار على ما لا يقل عن 15 سمكة.
3. الكمي للسلوك سباحة
   1. لتحديد سلوك السباحة، وإطلاق البرنامج وحدد "واحدة يرقات الحركة دون خلفية الطرح" وحدة لفتح حفظ افي ملف الفيديو.
   2. باستخدام "مرفوعة" أو "مضلع" أداة من المناطق شريط القوائم مختارة من الفيلم لاستخدامها في التحليل. تأكد من أن المنطقة تضم كلا من موقعها الأصلي من الأسماك والمنطقة التي السمك والسباحة فيها. تأكد من أن التحقيق يتم استبعاد من المنطقة المراد تحليلها. يقوم البرنامج تلقائيا تتبع مسار الأسماك داخل المنطقة المرغوبة.
   3. لأداء رانه تحليل، انقر على "التجربة" من شريط القوائم واختيار "تنفيذ". عندما يطلب منك حفظ الملف الخام تحليل البيانات (.phr الشكل) في المكان الذي ترغب به. بمجرد حفظ، انقر على "ابدأ" لبدء تحليل. إنهاء تحليل عن طريق النقر على "وقف" تحت عنوان "التجربة" القائمة المنسدلة. سيتم عرض نافذة تحتوي على النتائج.
   4. انتقل إلى الحق في الحصول على قيمة "أقصى قدر من التسارع". إذا رغبت في ذلك، تصدير هذه البيانات عن طريق إغلاق إطار النتائج والنقر على زر "تصدير نتائج فورية" تحت عنوان "النتائج" القائمة المنسدلة. حدد الخام ملف تحليل البيانات المناسبة وانقر على فتح. سيتم حفظ ملف نصي يمكن فتحه في برنامج جدول بيانات في مجلد الوجهة.
   5. كرر هذه العملية لكل الأسماك الفردية والمتوسط للحصول على أقصى تسارع متوسط لكل سلالة (انظر الشكل 1).
      ملاحظة: كبديل لالنقيبز البرنامج الموصوف هنا، ومجموعات مماثلة مثل برنامج ImageJ المتاحة بحرية يمكن استخدامها لاستخراج بيانات حركة ذات الصلة. البرنامج المساعد 3D الجسيمات المقتفي يمكن استخدامها لتتبع مسارات السباحة.

2. الحركة الفحص - 10 دقيقة السباحة اختبار

1. إعداد 6 DPF الأجنة لتحليل سباحة
   1. إذا لزم الأمر، نوع الأجنة لالجيني المطلوب، على سبيل المثال من خلال دراسة تعبير عن بروتين فلوري أو النمط الظاهري، ووضع في طبق بتري منفصلة (25-30 الأجنة في الطبق). بدلا من ذلك، النمط الجيني يمكن تحديدها بعد الانتهاء من فحص الحركة.
   2. في 3 DPF، وإعادة النظر في أطباق بتري وإزالة أي أجنة لم يفقس والحطام. العودة أطباق بتري إلى 28 درجة مئوية الحاضنة حتى 6 DPF.
   3. أداء اختبار جميع سلالات 09:00 حتي 12:00، وهو الوقت الذي اليرقات الزرد هي الأكثر نشاطا. بطريقة عشوائية ترتيب الاختبار والموقف في صفي وقت متأخر من wildtype وعينات متحولة للحد من آثار الخلافات الساعة البيولوجية وغيرها من التحيز التجريبية.
      ملاحظة: من المهم أن وقت الاختبار يتسق بين التجارب بسبب النشاط يمكن أن تختلف بشكل كبير طوال اليوم.
   4. لا يقل عن 30 دقيقة قبل الاختبار، ومكان اليرقات في لوحة 48-جيدا مع يرقة واحدة لكل بئر. بعد نقل، وملء الآبار بحيث سطح الماء هو أقل بقليل من رأس البئر، وضمان عدم وجود فقاعات. العودة لوحات إلى 28 درجة مئوية الحاضنة.
   5. تأخذ لوحات من الحاضنة والتأقلم في ضوء لمدة خمس دقائق قبل الاختبار.
2. أداء الحركة الفحص
   1. وضع لوحة 48-جيدا إلى غرفة تسجيل، وهو مجهز بكاميرا رقمية الأشعة تحت الحمراء، واستولت على ما يصل الى 60 لقطة / ثانية، لذلك يمكن أن يتم الكشف عن اليرقات في الظلام. تأكد من أن جميع الآبار يتم وضعها داخل الشبكة الدائرية على برنامج الحركة وأن جميع اليرقات كليكشف آرلي.
   2. إطلاق برنامج وحدد "تتبع" وحدة. تحت عنوان "ملف" انقر على "توليد بروتوكول جديد" وتحرير عدد من الآبار المستخدمة للتجربة. تعيين كل من مدة التجربة وفترة الاندماج لمدة 10 دقيقة عن طريق النقر على "المعلمات" القائمة المنسدلة واختيار "المعلمات بروتوكول" وبعد ذلك "الوقت" علامة التبويب. في نفس مربع الحوار "معلمات بروتوكول" انقر فوق علامة التبويب "خيارات" وتأكد من النقر على مربع "Numeriscope" وبعد ذلك، يمكن أن يتم إغلاق "المعلمات بروتوكول" مربع الحوار.
   3. لتعيين المناطق تسجيل تبرز الشبكة بأكملها، وانقر مرتين على إحدى الآبار. انقر على زر "المناطق رسم" ورسم حول الجزء العلوي الأيسر، أعلى اليمين، والآبار أسفل اليسار وانقر على "بناء"، والذي يسمح البرنامج لتحديد موقف كل تلقائيا أيضا. رسم أيضا في نطاقمنع وانقر على "تنطبق على مجموعة". وبمجرد الانتهاء، انقر على زر "رسم المناطق".
   4. تحديد بصريا عتبة الكشف عن طريق تحريك "عتبة الكشف" بار إلى المستوى الذي سلط الضوء على حركات الأسماك فقط مع عدم وجود إشارات الخلفية.
      ملاحظة: إن عتبة الكشف تختلف بين سلالات وبالتالي لا بد من تحديد متى يتم اختبار سلالة جديدة العتبات. في قدمت بيانات تمثيلية عتبة الكشف عن 25 ملم / استخدمت ثانية.
   5. قبل البدء في اختبار دخول عتبات الحركة للكشف عن الخمول، والحركات الصغيرة والكبيرة.
      ملاحظة: في قدمت بيانات تمثيلية عتبة الخمول من 6 ملم / ثانية والنشاط انفجار عتبة 30 ملم / استخدمت ثانية. العتبات تحدد الحد الأدنى من الحركة إلى اعتبار النشط والمستوى المطلوب لاعتبار النشاط انفجار وتسمح تصنيف النشاط داخل صغيرة (نشط ولكن دون activi انفجارعتبات تي واي) والكبيرة (أكبر من عتبة النشاط انفجار الحركات). ويمكن تغيير العتبات تبعا لنوع النشاط من سلالات الأسماك معينة تحليلها.
      ملاحظة: على الرغم من أن الفحص لا يمكن أن يؤديها في أي ظروف الإضاءة أو مظلمة، وقد ثبت اليرقات الزرد إلى أن تكون أكثر نشاطا في الظلام ^18.
   6. تعيين شدة الضوء داخل الغرفة لتكون على 0٪ من خلال النقر على زر "إعدادات القيادة الخفيفة" تحت عنوان "المعلمات" القائمة المنسدلة. في مربع الحوار الناتج، إضافة إعدادات الخفيفة المطلوبة.
      ملاحظة: شدة الضوء داخل الغرفة يمكن أن تسبب لتشغيل وإيقاف خلال فترة الاختبار لتحفيز النشاط اليرقات
   7. إغلاق باب غرفة تسجيل والبدء في تسجيل الفيديو.
3. الكمي للسلوك سباحة
   1. بعد اكتمال التجربة، انقر على "وقف" تحت عنوان "التجربة" القائمة المنسدلة. وبو الحوارسيتم عرض X مع كل النتائج.
   2. للوصول إلى هذه النتائج في التفوق اضغط على "فتح مجلد يحتوي على" وفتح ملف اكسل الذي يظهر في المجلد الناتج. المعلمات الهامة "smlct" (صغير العد الحركة)، "larct" (كبير العد الحركة)، "smldist" (المسافة الإجمالية من الأسماك في حركات صغيرة مغطاة) و "lardist" (المسافة الإجمالية من الأسماك في تحركات واسعة تغطيها ).
      ملاحظة: بعد التسجيل، البرنامج أيضا بإرجاع ملفين الإنتاج الإضافية في شكل ملف .avi (التي تحتوي على لقطات فيديو لتسجيل 10 دقيقة)، وملف صورة بابوا نيو غينيا (التي تحتوي على تمثيل مرئي للتنقل خلال 10- تجربة دقيقة، وانظر الشكل 2).
   3. مرة واحدة يتم احتساب قيم الحركة واعادة افي وبابوا نيو غينيا الملفات إلى مراجعة ما إذا كانت القيم تحرك محسوب بدقة تصوير حركات السباحة من الأسماك (انظر الشكل3).
      ملاحظة: كبديل لاستخدام البرنامج الموصوفة هنا، وحزم مثل برنامج ImageJ المتاحة بحرية يمكن استخدامها لتتبع سلوك تحركي.

النتائج

أثار اتصال فحص استجابة يمكن استخدامها لتحديد سرعة وتسارع حركات السباحة وهو مقياس نسبي من قوة العضلات. وردا على التحفيز الميكانيكي، مثل صنبور صغير على الرأس 2 DPF النوع البري المعرض الزرد عمل السباحة السريعة. تم القبض على أشرطة الفيديو وتحليلها لمدة نماذج مختلفة الزرد عضلي: تيراغرام (ACTA1 ^D286G -eGFP)، وهذا نموذج من اعتلال عضلي خيطي أن ثبت لديها ضعف العضلات كبير، ونموذج من ضمور العضلات دوشين التي تم وصفها العيوب العضلات شديدة في 5 DPF ^19،20. صور من الفيديو من لمسة نموذجي أثارت فحص ممثلة في الشكل 1A. تم فحص التسارع من الزرد وجدت أن تصل إلى ذروتها في غضون 0.2 ثانية الأولى من الاستجابة الهروب سباحة انفجار (الشكل 1B). يوفر هذا أقصى تسارع الذروة وهو الإجراء الذي يتناسب مع قوة زenerating قدرة العضلات والهيكل العظمي. وبلغ متوسط قيم التسارع القصوى للحصول على قيمة متوسط أقصى قدر من التسارع (± الخطأ المعياري للمتوسط) لكل سلالة: تيراغرام (ACTA1 ^D286G -eGFP): يعني = 276.0 ± 28.8 متر / ثانية ^2، ن = 3 تجارب تكرار مستقلة تضم 15 سمكة على حدة؛ السيطرة wildtype: متوسط = 500.8 ± 50.28 م / ث ^2، ن = 3 تجارب تكرار مستقلة تتألف من 15 سمكة على حدة؛ نائب العضو المنتدب ^{للPC2 - / -} متحولة: متوسط = 249.9 ± 19.1 متر / ثانية ^2، ن = 3 تجارب تكرار مستقلة تتألف من 12-19 سمكة على حدة؛ نائب العضو المنتدب ^{للPC2 +/-} الزيجوت: متوسط = 235.9 ± 8.7 م / ث ^2، ن = 3 تجارب تكرار مستقلة تتألف من 16-27 سمكة على حدة؛ نائب العضو المنتدب للالزيجوت المتماثلة الألائل ^{PC2 + / +} wildtype: متوسط = 230.9 ± 8.7 م / ث ^2، ن = 3 تجارب تكرار مستقلة تتألف من 8-27 الأسماك الفردية (الشكل 1C). كما هو متوقع، تيراغرام (ACTA1 ^D286تم العثور G -eGFP) الأسماك لديهم انخفاض ملحوظ في أقصى تسارع مشيرا إلى انخفاض وظيفة العضلات، وهو ما يتسق مع نماذج الماوس وبيانات المرضى ^{8،21،22. وPC2} DMD ^{- / -} الأسماك متحولة ومع ذلك، لم تظهر أي اختلاف في أقصى تسارع، في 2 DPF، بما يتفق مع الكشف عن العيوب العضلات من 3 DPF ²⁰ (1D الشكل).

وقد أجريت فحوصات تنقل في 6 DPF لتحديد النشاط والمسافة سبحوا من سلالات الزرد كمؤشر على أداء العضلات. وبعد الاختبار، تم إنشاء تمثيل شكلي للحركات السباحة خلال فترة الاختبار لمدة عشر دقائق، مع خطوط حمراء وخضراء تمثل فترات من الحركة البطيئة والسريعة على التوالي وخطوط سوداء تمثل فترات من الخمول (الشكل 2). فرد wildtype الزرد تظهر ارتفاع النشاط مع عدم وجود فترات من الخمول نسبيا كما opposإد لتيراغرام (ACTA1 ^D286G -eGFP) الأسماك، والتي هي أقل نشاطا خلال فترة الاختبار (الشكل 2B).

وكان كميا سلوك السباحة عن طريق حساب متوسط القيم الفردية لعدد من الحركات وسبحوا بعد كل الأسماك (الشكل 3). تم العثور على الأسماك متحولة (الشكل 3C و 3D) لديهم انخفاض ملحوظ في متوسط عدد الحركات والمسافة سبح مقابل كل منهم ^{- على} حد سواء، تيراغرام (ACTA1 ^D286G -eGFP) السمك (الشكل 3A و 3B)، ونائب العضو المنتدب ^{للPC2 - /} الضوابط: تيراغرام (ACTA1 ^D286G -eGFP) الأسماك: يعني عدد من الحركات = 94.3 ± 13.6، يعني بعد سبحوا = 112.9 ± 18.4 مم، ن = 3 تجارب تكرار مستقلة تضم 45 السمك. ضوابط نوع البرية: يعني عدد من الحركات = 177.4 ± 14.0، يعني بعد سبحوا = 300.2 ± 22.8 مم، ن = 3 ص مستقلةتجارب eplicate تضم 45 السمك. نائب العضو المنتدب ^{للPC2 - / -} متحولة: يعني عدد من الحركات = 163.3 ± 30.0، يعني بعد سبحوا: 298.4 ± 60.37 ملم، ن = 3 تجارب تكرار مستقلة تتألف من 12-20 الأسماك. نائب العضو المنتدب ^{للPC2 +/-} الزيجوت: متوسط عدد الحركات = 362.3 ± 38.8، يعني سبحوا المسافة: 660.3 ± 86.1mm ن = 3 تجارب تكرار مستقلة تتألف من 17-27 الأسماك. نائب العضو المنتدب للالزيجوت المتماثلة الألائل ^{PC2 + / +} wildtype: يعني عدد من الحركات = 341.9 ± 91.6، يعني سبحوا المسافة = 574.3 ± 170.9mm ن = 3 تجارب تكرار مستقلة تتألف من 8-25 الأسماك.

الشكل 1: الكمي لمسة تثير فحص استجابة ل2 DPF الأجنة الزرد الصور (A) لقطة من الزرد السيطرة خلال لمس استحضار فحوصات في 2 DPF. (ب) لمحة تسريع ل0.2 ثانية الأولى منواحد تيراغرام (ACTA1 ^D286G -eGFP) (الحمراء)، وتحكم واحد (الأزرق) الزرد بعد تطبيق التحفيز التي تعمل باللمس. ويمثل أقصى تسارع من قبل الخطوط المنقطة. (C، D) الكمي من الحد الأقصى للسرعة (م / ث ²⁾ المسجلة من المقايسات استجابة أثار مسة من (C) تيراغرام (ACTA1 ^D286G -eGFP) الزرد و (D) ^PC2 DMD ^{- / -} الأسماك متحولة مقارنة للسيطرة على الزرد في 2 DPF. تمثل أشرطة الخطأ ± SEM لمدة 3 تجارب تكرار، * ف <0.05. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تمثيل فحوصات الحركة للأجنة الزرد (أ) توضع الأجنة الزرد في لوحات 48-جيدا وسجلت الحركة من فوق باستخدام الكاميرا الرقمية الأشعة تحت الحمراء. (ب) رسم تخطيطي للحركة الزرد أثناء فترة الاختبار مع الخطوط الحمراء التي تصور الحركات السريعة وخطوط خضراء تصور الحركات البطيئة وخطوط سوداء تصور الخمول (على النحو الذي يحدده عتبات الكشف دخلت في البرنامج). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3):. الكمي لفحوصات الحركة لمدة 6 يرقات DPF الزرد الكمي ل(أ) عدد من الحركات و (ب) المسافة التي يقطعها تيراغرام الزرد (ACTA1 ^D286G -eGFP) مقارنة للسيطرة على الزرد في 6 DPF.الكمي ل(C) عدد من الحركات و(D) المسافة التي يقطعها DMD ^{PC2 - / -} الأسماك متحولة مقارنة للسيطرة على الزرد في 6 DPF. تمثل أشرطة الخطأ ± SEM لمدة 3 تجارب تكرار، * ف <0.05، ** ف <0.01. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وقد ساهمت العديد من النماذج الحيوانية المختلفة بما في ذلك الفئران والكلاب والزرد، الذباب والديدان نحو فهمنا الأساس الجيني والجزيئي للأمراض العضلات، والمساعدة في تطوير المناهج العلاجية لمكافحتها. الزرد يضم العديد من المزايا لدراسة مرض في العضلات. يوفر الزرد نظام manipulable وراثيا لتقييم الزخرفة العضلات المعقدة في بيئة الفسيولوجية المناسبة، وهو أمر غير ممكن في نظم الاستزراع في المختبر. على عكس النماذج الحيوانية الفقاريات الأخرى، وعدد كبير من الأسماك المنتجة، جنبا إلى جنب مع وضوحه البصرية، يسهل السريع، وارتفاع الإنتاجية في الصناعات الكيميائية الجسم الحي والفحص الجيني.

نحن هنا وصف وضع المقايسات حركة الزرد لتوفير الإنتاجية العالية وطريقة تلقائية لتقييم أداء العضلات خلال مرحلة التطور الجنيني الزرد. على حد سواء المقايسات لا بد من الاعتراف بأن الإيقاعات اليومية ووالمثيرات البيئية الخارجية تؤثر تأثيرا كبيرا على سلوك السباحة الزرد ^17،18. والاختبار المتكرر لنفس الزرد يؤدي أيضا إلى التعود مما تسبب في انخفاض ردا على اللمس التحفيز ^23. ولذلك، من أجل تحقيق نتائج استنساخه بين التجارب كل جنين الزرد ينبغي اختبار مرة واحدة فقط، وهي المرة من الظروف اليوم والإضاءة ينبغي أن تكون موحدة، ويحتاج إلى درجة حرارة الماء إلى تنظيم محكم.

عن طريق لمسة أثار تحليل في 2 DPF يمكننا قياس مباشرة أقصى تسريع عمل السباحة انفجار، الذي يتناسب مع قوة العضلات. وقد درست تقنيات السابقة في الزرد قوة العضلات عن طريق ربط طرفي الأجنة إلى التجريبية يلي المعدات التي تقلص العضلات وحفز باستخدام المجال الكهربائي والقدرة على توليد قوة العضلات ¹⁴ يقاس. بينما هذه الطريقة يقيس قوة توليد قدرة رانه العضلات اليرقات، فإنه لا قياس القوة الفعلية الناتجة عن العضلات اليرقات أثناء السباحة. لذا قمنا بتطوير طريقة لتقييم بشكل غير مباشر على القوة المتولدة أثناء الحركة السباحة اليرقات الطبيعية لتوفير مقياس عام لصحة العضلات. نظام الفيديو عالية السرعة، قادرة على تسجيل حركات الزرد الفردية في معدل الإطار من 1000 لقطة / ثانية يمكن استخدامها لتحديد الاختلافات صغيرة ولكنها مهمة في وظيفة العضلات، والتي لا يمكن تمييزها مباشرة بالعين. وسوف تكون ذات فائدة لنرى كيف سابقا عن تغييرات في توليد قوة حفز كهربائيا ربط مع التغييرات في الأداء السباحة.

وبالإضافة إلى ذلك أثار لمسة يمكن أيضا فحوصات استجابة استخدامها لتقييم الكينماتيكا السباحة، مثل الشكل وسرعة موجة الجسم أثناء الحركة السباحة ^24، لإعطاء القياس الكمي للسلوك تحركي.

ويرجع ذلك إلى حركة عفوية من zebrafاليرقات العش بعد 3 DPF، لم نكن قادرين على إجراء فحوصات لمسة واستحضار لقياس وظيفة العضلات. على العكس من ذلك، قمنا بقياس أداء العضلات على مدى فترة أطول من خلال تحديد سبحوا المسافة من اليرقات الزرد في 6 DPF. هذا الاختبار، على الرغم من أن مقياس غير مباشر من وظيفة العضلات، ويمكن استخدامها لتحديد الأسماك التي تظهر ضعف أداء العضلات ⁸ أو التنكس العصبي ^25،26. هذا الاختبار ليس فقط يوفر قياس مشابه لاختبار مسافة 6 دقائق ولكن هو أيضا مناسبة لالآلي عالية الإنتاجية في شاشات المخدرات أو الطفرات الجسم الحي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 G x 1' Blunt Needle	Terumo/Admiral Medical Supplies	TE2125
48-well plates	Sigma	M8937
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products PT	S90001
High Speed Camera	Baumer	HXC20
http://www.randomization.com	N/A		Steps 1.1.2, 2.1.3
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
Plastic Pipette	VWR	16001-188
StreamPix5	NorPix		Step 1.2.3
Temperature Control Unit	Viewpoint
Tweezers, style 8	ProSciTech	T04-821
Zebrabox System	Viewpoint
Zebralab	Viewpoint		Steps 1.3.1, 2.2.1