القياس الكمي لمستويات حمض الريتينويك النسبية في E8.5 الأجنة وNeurosphere الثقافات باستخدام F9 نادر-Lacz القائم على خلية مراسل الفحص

Summary

Methods to accurately measure retinoic acid (RA) levels in small amounts of tissue do not exist. This protocol describes the easy, quantitative measurement of relative RA levels in E8.5 embryos and neurospheres using an RA reporter cell line.

Abstract

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, neurogenesis, patterning of the hindbrain and spinal cord, and the development of multiple organ systems. Due to its chemical nature as a small amphipathic lipid, direct detection and visualization of RA histologically remains technically impossible. Currently, methods used to infer the presence and localization of RA make use of reporter systems that detect the biological activity of RA. Most established reporter systems, both transgenic mice and cell lines, make use of the highly potent RA response element (RARE) upstream of the RAR-beta gene to drive RA-inducible expression of reporter genes, such as beta-galactosidase or luciferase. The transgenic RARE-LacZ mouse is useful in visualizing spatiotemporal changes in RA signaling especially during embryonic development. However, it does not directly measure overall RA levels. As a reporter system, the F9 RARE-LacZ cell line can be used in a variety of ways, from simple detection of RA to quantitative measurements of RA levels in tissue explants. Here we describe the quantitative determination of relative RA levels generated in embryos and neurosphere cultures using the F9 RARE-LacZ reporter cell line.

Introduction

حمض الريتينويك (RA) هو مشتق الأيض الريتينول أو فيتامين (أ) ويتم إنتاج من خلال النشاط متتابعة من عدة أنزيم نازع للهيدروجين الخلوية ^1. بسبب الطبيعة الكيميائية amphiphatic، فإنه يعبر بسهولة الأغشية الدهنية ويمكن أن تكون بمثابة عامل تخلقية للذوبان ^1. وهو جزيء الضروري أن ينظم العديد من العمليات الخلوية التنموية والكبار عن طريق العمل كمركز ليجند لمستقبلات ريتينويد النووية وتفعيل التعبير الجيني ^2-10. دون RA، هذه المستقبلات RA (RARS) راريس ربط في الحمض النووي، وتقوم بدور repressors. RA ملزمة لهذه المستقبلات تحولهم إلى تفعيل النسخي مما أسفر عن هدف التعبير الجيني ^1،5،6.

على الرغم من أن مسار RA إشارات تتميز بشكل جيد، وحجم صغير (~ 300 دا) وطبيعة متقابلة الزمر للاتحاد الإقليمي يجعل التصور النسيجي المباشر وقياس RA حاليا غير مجد من الناحية الفنية ^11. الطريقة الوحيدة للديرإلخ قياس مستويات RA هو من خلال عزل RA من عينات الأنسجة باستخدام عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) ^11. يتطلب هذا الأسلوب عادة كميات كبيرة من الأنسجة، ويسر عن طريق تجميع عينات مختلفة ^12. وهكذا، وهذا الأسلوب هو ضعيف مناسبة لقياس مستويات RA في الأجنة الفردية أو كميات صغيرة من عينة / الأنسجة.

من أجل التحقيق في وظيفة الخلايا من التهاب المفاصل الروماتويدي، وقد وضعت عدة طرق للاستدلال غير مباشر وجود التهاب المفاصل الروماتويدي. هذه الطرق الاستفادة من أنظمة مراسل تحتوي على عالية الاستجابة RAR بيتا نادر القيادة التعبير عن بيتا غالاكتوزيداز أو وسيفيراز ^11،13،14. ونادر-LacZ مراسل الفئران المحورة جينيا الناتجة عن Rossant وآخرون. ¹³ هو النظام المثالي لتصور المناطق الزمانية المكانية للاتحاد الإقليمي إشارات في الموقع ^{11،13،15،16} لكن غير مناسب لقياس الكمي. وF9 خط الخلية نادر-LacZ ^14، على روقال انه ومن ناحية أخرى، أمر مفيد للكشف عن التهاب المفاصل الروماتويدي والقياسات الكمية للمستويات RA في إإكسبلنتس الأنسجة ^{11،12،14،17،18.}

خلايا سرطانة مسخية F9 تعبر ألفا الذاتية وبيتا، وحمض غاما الريتينويك مستقبلات ^19، والشروع التمايز إلى الأديم الجدارية بعد التعرض لالتهاب المفاصل الروماتويدي ^19-21. ولطالما تم إنشاء خلايا F9 كنموذج للتمايز الخلايا التي يسببها التهاب المفاصل الروماتويدي، والذي هو السبب في اختياره كخط خلية مثالية للمقايسة مراسل RA. وسيل 15 RA خط الخلية مراسل المستمدة F9 الناتجة عن فاغنر وآخرون. ¹⁴ يحتوي على E. coli'LacZ الجين المصب من نسخة واحدة من 64 شركة بريتيش بتروليوم الريتينويك عنصر استجابة حمض (نادر) من (RAR بيتا) الجينات بيتا الريتينويك البشري حمض مستقبل. من أجل تحديد والحفاظ على الحيوانات المستنسخة مستقرة، يتضمن بناء أيضا الجين أمينوغليكوزيد ناقلة الفسفات ^(ص الأجسام القريبة من الأرض) كعلامة اختيار في وجود G418. هذا البناء المشتركnfers التعبير محرض للب غالاكتوزيداز في وجود التهاب المفاصل الروماتويدي، والتي يمكن أن تصور من خلال تلطيخ LacZ وهذا الرد يمكن أن يكون في وقت لاحق كميا باستخدام الأساليب اللونية ^{11،12،14،18.}

وقد استخدم هذا الخط خلية مراسل متعددة للغاية على نطاق واسع في الكشف عن إنتاج RA الذاتية من خلال ثقافة مشتركة من عينات الأنسجة مع الخلايا المراسل، مثل قوقعة ¹⁷ و الجنينية إإكسبلنتس لوحة الطابق ^14. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام هذا الخط مراسل لتقدير مستويات RA في الحبل الشوكي النامية عن طريق زراعة أقسام المجمعة من النخاع الشوكي الجنينية بشكل منفصل وإضافة وسائل الإعلام مكيفة من هذه الثقافات إلى F9 الخلايا نادر-LacZ ^18. وقد أجريت الكمي بعد LacZ تلطيخ من خلال القراءة اللونية باستخدام معيار ELISA لوحة القارئ ^11،12،18. وأخيرا، تم استخدام هذا الخط الخلية مراسل في الكشف عن وجود التهاب المفاصل الروماتويدي الإنزيمات الأيضية التي كتبها monitoriالتغييرات نانوغرام في مستويات RA ^12،18.

نحن هنا أبلغكم أن حساسية هذا الخط خلية مراسل يسمح أيضا لقياس مستويات RA المتولدة من الأجنة E8.5 شارك مثقف الفردية. وهذا يتيح للمقارنة بين الأجنة الفردية من المورثات مختلفة. وكمثال محدد، Gpr161 هو النوع من الاختزال اليتيم الذي ينظم تكون العصيبة جزئيا من خلال RA إشارات الطريق ^22، ونفيدكم باستخدام هذا الخط خلية مراسل لدراسة تأثير طفرة المتنحية في Gpr161 (Gpr161 ^فل) على مستويات RA الشاملة في جنين. بالإضافة إلى ذلك، فإن تعدد وسهولة في استخدام هذا النظام مراسل يسمح للحرية لقياس ومقارنة مستويات RA في عينات الأنسجة المختلفة، حتى في الثقافات neurosphere تم الحصول عليها من خلايا الجذعية في العمود الفقري الكبار. نحن هنا وصف تحديد كمية مستويات RA النسبية في الأجنة والثقافات neurosphere من خلال المباشرة ثقافة مشتركة مع F9 نادر-LacZ RA مندوبخط الخلية orter.

Protocol

وقد تم كل عمل الحيوانية وفقا للأساليب روتجرز-RWJMS IACUC المعتمدة.

1. الحل وإعداد وسائل الإعلام

1. إعداد الأوراق المالية وعازلة الحلول كما في الجدول 1. إعداد حلول العامل وفقا للجدول رقم 2.

2. الثقافة وصيانة الخلايا نادر-LacZ F9

1. خلايا مجمدة ذوبان
   1. إعداد F9 نادر-LacZ مستنبت الخلية كما هو موضح في الجدول رقم (2).
   2. معطف أطباق ثقافة 10 سم (زراعة الخلايا المعالجة) مع 10 مل من 0.2٪ الجيلاتين (راجع الجدول رقم 2) لمدة 30 دقيقة في RT. يغسل الجيلاتين الزائدة مع اثنين يشطف من 10 مل من الماء المقطر. على الفور إضافة 9 مل من F9 نادر-LacZ مستنبت الخلية في قارورة لمنع الجيلاتين من الجفاف.
   3. ذوبان الجليد قارورة من F9 الخلايا نادر-LacZ ¹⁴ في حمام مائي C 37 ° عن 2-3 دقائق. خلايا لوحة (حوالي 1 × 10 ⁶ خلية / مل) في المغلفة طبق جontaining 9 مل من مستنبت. الثقافة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2. تغيير المتوسطة في اليوم التالي.
2. صيانة F9 الخلايا نادر-LacZ
   1. الحفاظ على مرور دوري كل 2-3 أيام في نسبة 01:10.
      ملاحظة: لا تدع الخلايا تنمو في confluency لأن هذا سيؤدي في المفاضلة الخاصة بهم.
   2. تقسيم الثقافات في confluency من 80-90٪. إزالة وسائل الإعلام وغسل الخلايا مع 10 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من التربسين، واحتضان لمدة 5 دقائق. إضافة 9 مل من مستنبت، ماصة الخلايا صعودا وهبوطا وتقسيم 01:10 لمرور.
3. تجميد F9 الخلايا نادر-LacZ
   1. يعرض للتريبسين طبق 10 سم تحتوي على خلايا نادر-LacZ F9 في 80 - 90٪ التقاء كما هو موضح في الخطوة 2.2.2. نقل الخلايا فصل في أنبوب الطرد المركزي 15 مل وتدور في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
   2. إزالة وطاف بيليه الخلية resuspend في 10 مل من F9 النادرة LacZ وreezing المتوسطة (انظر الجدول 2). قسامة 1 مل في cryovials وصفت وقارورة نقل في حاويات التجميد. وضع تجميد الحاويات في الفريزر -80 درجة مئوية O / N ونقل قوارير إلى خزانات النيتروجين السائل في اليوم التالي.

3. تشريح E8.5 الأجنة

1. التزاوج قفص مجموعة المتابعة والتوصيل تحقق
   1. انشاء قفص التزاوج تحتوي على زوج التزاوج واحد. في صباح اليوم التالي، تحقق من وجود المكونات المهبلية وتعيين اليوم تم العثور على المكونات كيوم 0.5 ^23. في E8.5 يوم والأجنة الحصاد.
2. تشريح الأجنة
   1. تضحية السد من خلال خلع عنق الرحم ورش منطقة البطن مع الايثانول 70٪ (انظر الجدول 2). جعل عرضية قطع في الجلد فوق البطن باستخدام مقص جراحي وسحب اللوحات باستثناء اثنين (الأمامية والخلفية) لفضح منطقة البطن. اجراء خفض مماثلعلى الصفاق لفضح البطن.
   2. تحديد موقع عنق الرحم والافراج عن ناقلة البيضات ومسراق الرحم باستخدام زوج من مقص ^23. وضع الرحم في 6 سم طبق (ثقافة غير الخلايا المعالجة) مع 10 مل برنامج تلفزيوني 1X ليغسل الدهون الزائدة والدم. نقل إلى طبق آخر 6 سم تحتوي على 10 مل جديدة برنامج تلفزيوني 1X.
   3. منفصلة الرحم واحدة تحتوي على جنين واحد عن طريق خفض تشغيله باستخدام مقص جراحي. إزالة الرحم والساقط والافراج عن الكيس المحي التي تحتوي على الجنين باستخدام اثنين من أزواج لا. 5 ملقط ^23.
   4. فصل الكيس المحي من الجنين، ونقل الكيس المحي لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل لاستخراج الحمض النووي الجيني لاستخدامها في التنميط الجيني. استخدام ماصة P20 مع طرف على نطاق تتحمل، ونقل الجنين كله في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على 10 ميكرولتر من التربسين. وضع أنبوب على الجليد.
   5. كرر الخطوات من 3.2.3 - 3.2.4 حتى يتم تشريح جميع الأجنة.
3. جنين التفكك
   1. احتضان 1.5 مل أنابيب تحتوي على أجنة في التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتسهيل تفارق الأنزيمية.
      1. يسحن بلطف باستخدام pipettor P20 عن التفكك الميكانيكية للجنين، ولوحة كامل حجم 10 ميكرولتر التي تحتوي على جنين فصلها واحد أكثر من واحد من الخلايا نادر-LacZ F9 في لوحة 96-جيدا (راجع الخطوة 5.1 لخلايا الطلاء F9 نادر-LacZ في لوحة 96-جيدا). ثقافة O / N عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.

4. استئصال الصفيحه، تشريح الكبار القطني النخاع الشوكي وNeurosphere الثقافة

1. الثقب
   1. التضحية الكبار (P60) الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
   2. رش الجانب الظهري مع 70٪ من الإيثانول واجراء خفض عرضية باستخدام مقص جراحي. سحب كل من اللوحات (الأمامي والخلفي) على حدة لفضح الظهر والعمود الفقري.
   3. باستخدام مقص جراحي، وتقليم قبالة العضلات التي تغطي العمود الفقري.تحديد المنطقة القطنية من النخاع الشوكي، تحت الأضلاع. باستخدام مقص، واجراء خفض عميق لقطع العمود الفقري في هذه المرحلة لفضح الحبل الشوكي.
   4. سحب ما يصل إلى المنطقة القطنية من العمود الفقري بلا. 5 ملقط بحيث المقطع العرضي المكشوفة من الحبل الشوكي تواجه المجرب. باستخدام نصائح من مقص غرامة، قص فقرة والعضلات في المواقف 03:00 و09:00 من نهاية المكشوفة. فهم رفرف الظهري للقطع فقرة بالملقط. مواصلة هذه التخفيضات caudally حتى يتعرض طول الحبل الشوكي القطني.
   5. الافراج عن الحبل الشوكي من الفقرات باستخدام رقم 5 وكذلك ملقط العضوية صريحا. نقل النخاع الشوكي لأنبوب 15 مل تحتوي على 3 مل من DMEM المتوسطة / ثقافة F12. الحفاظ على الجليد حتى تم عزلها عن النخاع الشوكي القطني.
2. الشوكي تشريح الحبل
   1. صب مستنبت مع الحبل الشوكي في طبق 6 سم (ثقافة غير خلية معاملتها).
   2. تحت مجهر تشريحي، وإزالة العقد الجذرية الظهرية والأوعية الدموية في جميع أنحاء قطاع الحبل الشوكي عن طريق استيعاب العقد والأوعية الدموية باستخدام اثنين من أزواج لا. 5 ملقط وسحب منهم بلطف بعيدا عن الحبل الشوكي. نقل جزء الحبل الشوكي إلى طبق 6 سم مع عدم وجود المتوسطة واللحم المفروم ناعما النسيج باستخدام شفرة المشرط.
   3. نقل مفروم الأنسجة لأنبوب 15 مل تحتوي على 1 مل من وسائل الاعلام neurosphere التفكك (انظر الجدول 2). وضع أنبوب على الجليد وكرر الخطوات من 4.2.1 - 4.2.2 حتى يتم معالجة كافة النخاع الشوكي.
   4. احتضان الأنابيب التي تحتوي على الأنسجة المفروم في المتوسط ​​التفكك عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ونفض الغبار الأنبوب على الجانب خلط ثم احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة أخرى. بعد الهضم الأنزيمي، يسحن مع ماصات مصقول النار من تناقص بأقطار لتفارق الميكانيكية.
      ملاحظة: إعداد الماصات النار مصقول من تناقص بأقطار قبل إجراء التجارب. خذ كوب باستورماصة والمكونات نهاية واسعة مع قطنية نظيفة. باستخدام مصباح الكحول، والبولندية النار على نصائح من الماصات في الشعلة لخلق بأقطار مختلفة: "العادية"، "بخير"، و "غرامة اضافية". لماصات مصقول "العادية"، برم نهاية ماصة في الشعلة لجولة من حواف دون التقليل من قطر (~ 1 مم). وتناوب على نهاية ماصة في الشعلة لفترات أطول قليلا لخلق "بخير" (~> 1 مم و> 5 مم)، و "غرامة إضافية" (~ 0.5 مم) ماصات مصقول. لا تستخدم ماصات بأقطار أقل من 0.5 مم.
3. Neurosphere الثقافة
   1. تدور باستمرار الأنابيب التي تحتوي نأت أنسجة الحبل الشوكي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة وطاف بيليه الخلية resuspend في 1 مل من وسائل الإعلام ثقافة neurosphere (انظر الجدول 2). يسحن مع ماصة P1،000 تليها ماصة P200 لتسهيل التفكك.
      ملاحظة: تجنب فقاعات إدخال،الذي من شأنه أن يقلل بقاء الخلية.
   2. نقل 10 ميكرولتر من خلايا نأت إلى عدادة الكريات والحصول على عدد خلايا. لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة من 1X10 ^5/10 مل في قارورة T25 مع 10 مل من وسائل الإعلام ثقافة neurosphere. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 7 أيام حتى تظهر neurospheres ^24.
4. Neurosphere التفكك
   1. جمع الثقافة neurosphere ونقل إلى 15 مل أنابيب. تدور في 200 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة معظم طاف وترك 1 مل وراء. يسحن مع ماصة P1،000 ل resuspend بيليه الخلية وفصل neurospheres إلى الخلايا وحيدة. نقل 10 ميكرولتر من خلايا نأت إلى عدادة الكريات والحصول على عدد خلايا.
   2. لوحة 1 × 10 ⁵ فصل الخلايا neurosphere أكثر من واحدة من F9 نادر-LacZ في لوحة 96-جيدا (انظر القسم 5.1 لتصفيح F9 نادر-LacZ في لوحة 96 أيضا). لوحة 3 آبار كما مكررات. ثقافة O / N عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.

5. RA الفحص من E8.5 الجنين والحبل الشوكي Neurospheres

1. تصفيح F9 نادر-LacZ في لوحة 96-جيدا
   1. قبل يوم واحد الأجنة E8.5 الحصاد أو تفكك neurospheres، ومعطف لوحة 96-جيدا مع 100 ميكرولتر من 0.2٪ الجيلاتين لكل بئر لمدة 30 دقيقة في RT. نضح من الجيلاتين وشطف مرتين مع 200 ميكرولتر من الماء المقطر.
   2. يعرض للتريبسين F9 الخلايا نادر-LacZ حافظت في أطباق 10 سم كما هو موضح في الخطوة 2.2.2. لوحة 1 × ⁵ 10 خلايا / جيد من خلايا LacZ F9 نادرة، ولكن هذه المرة باستخدام مستنبت دون G418.
   3. إعداد ما يكفي من الآبار للثقافة مشتركة من الأجنة (~ 12-20، اعتمادا على حجم القمامة)، neurospheres (3 آبار / الوراثي)، وكذلك لمنحنى قياسي في ثلاث نسخ (27 بئرا).
2. شارك في ثقافة F9 نادر-LacZ وE8.5 الأجنة أو الحبل الشوكي Neurospheres
   1. الأجنة الحصاد على النحو المفصل في القسم 3.2 ولوحة على رأس F9نادر-LacZ في لوحة 96-جيدا من القسم 5.1. بطريقة مماثلة، فصل neurospheres ولوحة على رأس F9 نادر-LacZ في لوحة 96-جيدا كما هو مبين بالتفصيل في الخطوة 4.4. ثقافة O / N عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
3. توليد منحنى قياسي
   1. لإنشاء منحنى قياسي، وإعداد جميع العابر RA (في-RA) حلول مع التركيزات التالية: 100 نانومتر و 10 نانومتر، 1 نانومتر، و 100 م، 22:00، 01:00، و 100 وزير الخارجية، عن طريق التخفيف المتسلسل من الذرات الأسهم RA (انظر الجدول 1) مع F9 مستنبت نادر-LacZ.
   2. إضافة 100 ميكرولتر من هذه مختلفة في-RA تركيزات إلى خلايا نادر-LacZ F9 من القسم 5.1. تعيين الآبار التي تحتوي على F9 غير المعالجة الخلايا نادر-LacZ سيطرة سلبية. إعداد يثلث كل تركيز RA وآبار المراقبة السلبية. ثقافة O / N عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
      ملاحظة: خلايا نادر-LacZ F9 تستجيب بطريقة خطية تعتمد على الجرعة لتركيزات مختلفة من التهاب المفاصل الروماتويدي جميع العابر.
4. RA الفحص
   1. بعد ثقافة O / N من لوحة 96-جيدا تحتوي على منحنيات القياسية وشارك في الثقافات، وإزالة وسائل الإعلام وإصلاح الثقافات وذلك بإضافة 100 ميكرولتر من 2.5٪ غلوتارالدهيد (انظر الجدول رقم 2) لمدة 15 دقيقة، RT. إزالة تثبيتي، ويغسل مرتين مع 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X، 10 دقيقة لكل يغسل.
   2. إزالة برنامج تلفزيوني ويغسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من محلول الغسيل LacZ (انظر الجدول 2)، 10 دقيقة لكل يغسل. أثناء غسل الثالث، وإعداد حل تلطيخ X-غال في أنبوب 15 مل ملفوفة في احباط (انظر الجدول 2). كيفية حساب حل تلطيخ بكثير هو مطلوب وإعداد كمية مناسبة (200 ميكرولتر / جيد).
      ملاحظة: حل X-غال تلطيخ خفيف حساسة. استخدام الحل تلطيخ خلال 15 دقيقة بعد الإعداد.
   3. إعداد غرفة ترطيب عن طريق وضع منشفة ورقية مبللة بالماء المقطر إلى وعاء من البلاستيك كبيرة بما يكفي لعقد لوحة 96-جيدا. إضافة 200 ميكرولتر من Xحل تلطيخ -gal لكل بئر من لوحة 96-جيدا ووضع لوحة في غرفة ترطيب.
   4. احتضان غرفة ترطيب يحتوي على لوحة 96-جيدا عند 37 درجة مئوية للسماح لتطوير راسب أزرق اللون. لأجنة E8.5، احتضان لوحة O / N (12-16 ساعة). لneurosphere الثقافات، واحتضان لوحة لمدة 4-8 ساعة.
5. قراءة الامتصاصية في التطوير التنظيمي ₆₁₀ و التصوير
   1. بعد رد فعل اللون، وإزالة حل LacZ تلطيخ واستبدالها مع 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X. قياس الامتصاصية في 610 نانومتر باستخدام معيار ELISA لوحة القارئ لقياس استجابة مراسل لالتهاب المفاصل الروماتويدي. صورة الآبار الفردية باستخدام مجهر تشريحي القياسية مزودة بكاميرا.

6. استنساخ فرعي من F9 الخلايا نادر-LacZ

1. فحص F9 نادر-LacZ rResponse إلى RA
   1. قبل البدء في أي التجارب، واختبار رد فعل خلايا نادر-LacZ F9 لالتهاب المفاصل الروماتويدي. لوحة F9 نادر-LacZ جملتعلمي اللغة اإلنكليزية في لوحة 96-جيدا (انظر القسم 5.1)، وإضافة 1 نانومتر جميع العابر حمض الريتينويك (راجع الخطوة 5.3). احتضان في غرفة ترطيب عند 37 درجة CO / N.
   2. تصور تطوير راسب اللون الأزرق باستخدام المجهر. إذا تنمية اللون ليست موحدة في جميع أنحاء الخلايا في البئر (انظر الشكل 1B، يسار)، نفذ استنساخ فرعي المفصلة أدناه.
2. استنساخ فرعي من F9 الخلايا نادر-LacZ
   1. انقسام الخلايا نادر-LacZ F9 مثقف في 10 سم أطباق كما هو موضح في الخطوة 2.2.2. بدلا من نسبة 01:10، لوحة كثافة البذر منخفضة من 1 × 10 ⁵ خلية / 10 مل في صحن 10 سم للسماح لنمو مستعمرات معزولة مثل أن كل مستعمرة تنشأ من F9 واحد خلية نادر-LacZ.
   2. بعد يومين، ومعطف 24 لوحة جيدا مع 500 ميكرولتر من 0.2٪ الجيلاتين لكل بئر لمدة 30 دقيقة. إزالة حل الجيلاتين وشطف الآبار مرتين مع 500 ميكرولتر الماء المقطر. استبدال المياه مع 500 ميكرولتر من F9 نادر-LacZ مستنبت الخلية.
   3. اختيار مستعمرة باستخدام معقم طرف P10 ماصة ونقل إلى واحدة بشكل جيد؛ تفعل هذا 24 مرات للحصول 24 المستعمرات الفردية. الثقافة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ لمدة 3 - 4 أيام.
   4. تقسيم المستعمرات الفردية في اثنين من 24 لوحات جيدا. بعد 2 أيام في الثقافة، إضافة 1nM من RA إلى كل بئر واحد 24 لوحة جيدا والثقافة O / N. أداء LacZ تلطيخ على النحو المفصل في القسم 5.4 لاختبار المستجيبين عالية. تصور رد فعل اللون من كل بئر تحت المجهر لتحديد المستجيبين قوية وموحدة.
   5. مرة واحدة يتم تحديد مستجيب subclone قوي، وتوسيع ثقافة المناظرة من 24 لوحة جيدا أخرى. توسيع تلك المستعمرة في صحن 10 سم، وتجميد هبوطا عدة قوارير على النحو المفصل في القسم 2.3، وتجاهل كل المستعمرات الأخرى.
      ملاحظة: فقط حوالي ربع عدد المستعمرات الأصلية يؤدي إلى المستجيبين عالية. عادة، في الجولة الأولى من استنساخ فرعي لا يؤدي إلى تلطيخ LacZ موحد وجولة لاحقة من استنساخ فرعي يجب القيام به لتحقيق المستجيبين قوية موحدة.

النتائج

ونادر-LacZ مراسل F9 هو الجنينية خط خلية سرطان ملتصقة نمت على سطح الجيلاتين المغلفة. وبناء مراسل يسمح للخلايا للرد كميا لRA مع الحث النسبي للبيتا غالاكتوزيداز. ^{11،12،14،18.} هذه الخلايا عرض على التشكل الظهارية (الشكل 1A). بسبب معدل مضاعفة عالية، وينصح أن هذه الخلايا يمكن تقسيم كل 2-3 أيام في نسبة 01:10. خلال عملنا مع هذا الخط خلية المراسل، لاحظنا أنه حتى مع إضافة G418 في مستنبت، واستجابة هذه الخلايا إلى RA تضعف بعد العديد من المقاطع (الشكل 1B، يسار)، وهذا يمكن أن يؤثر على قدرة مراسل هذا خط الخلية. قد يكون راجعا إلى فقدان جزئي للالتحوير في الممرات في وقت لاحق هذا فقدان القدرة على الاستجابة. كما لا بد من هذا القبيل، استنساخ فرعي الدوري لضمان الاستجابة قوية وموحدة إلى RA (الشكل1B، يمين).

في حين الاستخدامات المختلفة لهذا الخط الخلية قد نشرت سابقا ^12،14-18، ذكرت هنا هو استخدام هذا الخط الخلية لقياس مستويات RA الذاتية من أجنة E8.5 الفردية مع الأنماط الوراثية المختلفة. انخفضت نتائج Gpr161 ^{فل / فل} طفرة في الاتحاد الإقليمي الجنينية يشير ^22. كما يتضح من شارك في ثقافة الأجنة فصل مع خلايا نادر-LacZ F9، خفضت هذه Gpr161 ^{فل / فل} الأجنة الذاتية RA مقارنة تتزاحم البرية من نوع (الشكل 2A). ونظرا لبراعة هذا خط الخلية المراسل، كما ذكرت هنا هي رواية استخدام هذه الخلايا للكشف عن مستويات RA التي تنتجها الثقافات neurosphere تم الحصول عليها من الكبار Gpr161 ^وزن الفئران ^{/ وزن} (الشكل 2B). وكان هذا الخط خلية مراسل قادرة على إثبات أن الثقافات neurosphere من الخلايا الجذعية في العمود الفقري للبالغين إنتاج RA الذاتية. وفرق كبيرerence في كثافة تلطيخ يشير إلى استجابة الخلية مراسل أكبر لneurospheres الحبل الشوكي مقارنة مع الأجنة E8.5. قد يكون هذا بسبب أكبر بكثير مستويات RA الناتجة عن neurospheres مع مرور الوقت مقارنة مع الأجنة E8.5، التي يمكن أن تكون يرجع ذلك إلى حقيقة أن neurosphere الثقافات هي أكثر تجانسا من الأجنة E8.5 وبالتالي تحتوي على أكثر من الخلايا RA المنتجة.

إضافة تركيزات مختلفة من النتائج في-RA في رد خطي تعتمد على جرعة من الخلايا المراسل. ويمكن قياس هذا الرد colorimetrically من خلال قراءة الامتصاصية في 610 نانومتر. ويمكن بعد ذلك المنحنى القياسي المتولدة يمكن استخدامها لقياس مستويات RA في العينات، كما هو الحال في الثقافات من النوع البري neurosphere (الشكل 3A) أو الأجنة E8.5 (الشكل 3B).

الشكل 1. للصيانةenance واستنساخ فرعي من خلايا نادر-LacZ F9. (A) يظهر صورة المرحلة على النقيض من الخلايا نادر-LacZ F9. هذه الخلايا وقتا مضاعفة ~ 10 ساعة ويجب أن يتم تمرير كل 3 أيام. (ما يقرب من 70-80٪ التقاء) بنسبة 01:10 (ب) اختبار الدوري الثقافات مع اضافة 1 نانومتر في-RA وLacZ لاحق ويجب أن يتم تلطيخ لضمان بقاء الثقافات المستجيبين قوية وموحدة إلى RA (يمين). في حالة المستجيبين الفقيرة وغير موحدة (يسار)، يجب إجراء استنساخ فرعي. على نطاق ويمنع 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عينات الشكل 2. LacZ تلون المشارك مثقف (فصل E8.5 الأجنة / Neurospheres) وF9 الخلايا نادر-LacZ. (أ) الجنين E8.5 الماوس تم فصلها الصورة من مختلف الأنماط الجينية ومطلي على رأس F9 الخلايا نادر-LacZ. LacZ تلطيخ 24 ساعة في وقت لاحق يسمح التصور من رد F9 الخلايا نادر-LacZ لالذاتية RA التي تنتجها عينات شارك مثقف. وGpr161 ^فل النتائج طفرة في الاتحاد الإقليمي الذاتية انخفضت كما تصور من قبل خفضت استجابة الخلايا مراسل (ب) نقاط. وأظهرت صورة على النقيض من المرحلة من neurospheres مثقف من الحبل الشوكي الخلايا الجذعية العصبية الكبار. حق. تم فصلها Neurospheres المستمدة من الكبار Gpr161 ^وزن الحبل الشوكي ^{/ وزن} ومطلي على رأس F9 الخلايا نادر-LacZ. وجود راسب أزرق التالية تلطيخ LacZ تشير إلى وجود الذاتية RA في هذه neurospheres. الفرق في تلطيخ كثافة بين neurosphere والجنين E8.5 المشترك الثقافات تشير إلى مستويات أعلى من RA موجودة في neurospheres من الأجنة E8.5. على نطاق ويمنع 100 ميكرون.الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. منحنى قياسي واللونية الكمي لمستويات RA. وكان رد LacZ نادر خط F9 خلية مراسل يمكن قياس colorimetrically في 610 نانومتر باستخدام معيار ELISA لوحة القارئ. (A) منحنى مستوى الممثل تستخدم لقياس مستويات RA النسبية لل النوع البري neurosphere ثقافة الصورة. (ب) الكمي لمستويات RA النسبية من شارك مثقف الأجنة E8.5. N = 3؛ * ف <0.05، اختبار t الطالب. أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ستوالمخازن المسيخ / حلول	مكونات	شروط التخزين
10٪ deoxycholate الصوديوم مونوهيدرات (C 24 H 39 ناو 4 · H 2 O)	10 مل في 100 مل O 2 درهم	4 درجات مئوية
1 M كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2)		RT
100X فيرو سيانيد البوتاسيوم (K 4 [الحديد (CN) 6] · 3H 6 O)	2.12 غرام في DH 10 مل 2 O	RT في الظلام
100X فيري سيانيد البوتاسيوم (K 3 [الحديد (CN) 6])	1.64 غرام في DH 10 مل 2 O	RT في الظلام
20 ملغ / مل X-غال (5-برومو-4-كلورو-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)	إضافة 5 مل ثنائي ميثيل الفورماميد لجعل 20 ملغ / مل حل الأوراق المالية	-20 درجة مئوية
10 ملم (3 ملغ / مل) كل طن تبريدالجواب حمض الريتينويك	حل 50 ملغ في 16.67 مل ايثانول المطلق. إعداد 1 مل قسامات.	-80 درجة مئوية في الظلام، في 1.5 مل أنابيب العنبر microcentrifuge ل
غراء	حل قنينة واحدة في 7 مل HBSS	4 درجات مئوية

الجدول 1. المخازن والحل التراكيب.

العمل المخازن / حلول	مكونات	شروط التخزين
F9 نادر-LacZ خلية ثقافة المتوسط	50 مل مصل بقري جنيني (FBS) (تركيز النهائي 10٪)	تصفية تعقيم.
	5 مل 100X البنسلين ستربتومايسين (نهائي اضرب 1X)	تخزين عند 4 درجات مئوية.
	4مل 50 ملغ / مل G418 (النهائي اضرب 0.4 ملغ / مل)
	500 مل DMEM / F-12 (مع L-الجلوتامين وHEPES)
0.2٪ الجيلاتين	25 مل 2.0٪ الجيلاتين	تخزين عند 4 درجات مئوية.
	80 مل من الماء المقطر
	اخلط جيدا
70٪ من الإيثانول	30 مل 95٪ من الإيثانول	وضع في زجاجة رذاذ.
	70 مل من الماء المقطر	متجر في RT
Neurosphere التفكك المتوسطة	1 مل 20U غراء	إعداد جديدة في كل مرة
	100 ميكرولتر 13 ملغ / مل التربسين
	100 ميكرولتر 7 ملغ / مل حمض الهيالورونيك
	28 ميكرولتر 10 ملغ / مل DNaseI
	50 ميكرولتر 4mg / حمض kynurenic مل
مستنبت Neurosphere	DMEM / F-12 (مع L-الجلوتامين وHEPES)	إعداد جديدة في كل مرة
	2٪ الملحق B-27
	مل 20 عامل نانوغرام / نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل)
	20ng عامل نمو البشرة (EGF)
2.5٪ غلوتارالدهيد	250 ميكرولتر 50٪ غلوتارالدهيد	إعداد جديدة في كل مرة
	4750 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X
LacZ محلول الغسيل	0.5 مل 10٪ deoxycholate (اضرب النهائي 0.1٪)	تخزين عند 4 درجات مئوية.
	1.0 مل 100٪ NP-40 (نهائي اضرب 0.2٪)
	50 مل 10X برنامج تلفزيوني
	الماء المقطر إلى 500 مل
X-غال حل تلطيخ	1X فيرو سيانيد البوتاسيوم	إعداد جديدة في كل مرة
	1X فيري سيانيد البوتاسيوم
	1 ملغ / مل X-غال
	للحجم المناسب باستخدام محلول الغسيل LacZ
F9 نادر-LacZ المتوسط ​​تجميد	F9 ثقافة نادر-LacZ المتوسطة + 5٪ DMSO	إعداد جديدة في كل مرة

الجدول 2. المخازن العامل، والحل التراكيب.

Discussion

خط الخلية نادر-LacZ F9 ¹⁴ هو نظام قوي التي يمكن استخدامها للكشف عن التهاب المفاصل الروماتويدي التي تنتجها الأنسجة إإكسبلنتس ^{12،14،17،18.} أنه حساس لتركيزات RA منخفضة تصل إلى 100 ​​FM، مع عدم وجود استجابة غير محددة في الكشف عن الخلايا غير المعالجة مع RA ^12،14،18. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا مراسل تستجيب لجميع العابر RA بطريقة خطية ضمن نطاق معين من التركيز، مما يسمح للرد فعل LacZ ليكون كميا وتستخدم لتحديد حجم مستويات RA ^12،14،18. مقايسة مراسل RA سريعة وسهلة المعروضة هنا يستخدم لنادر-LacZ خط الخلية مراسل F9 لتصور (الشكل 2) والقياس الكمي النسبي (الشكل 3) من الأجنة والكبار مثقف الخلايا الجذعية العصبية. هذا النظام مراسل يسمح بمقارنة مستويات RA الذاتية بين العينات الفردية، كما هو مبين في الشكل 2، وهي حساسة بما يكفي لتكون قادرة على الكشف عن التهاب المفاصل الروماتويديتولدها الأجنة الفردية E8.5 (الشكل 2A)، وكذلك التهاب المفاصل الروماتويدي التي تنتجها neurospheres مثقف (الشكل 2B). استجابة تعتمد على الجرعة من هذا الخط الخلية لتركيزات RA متفاوتة تسمح لتقدير مستويات RA (الشكل 3A) في عينات وكذلك المقارنة بين مستويات RA النسبية بين العينات (الشكل 3B). من المهم أن نلاحظ أن خط الخلية مراسل نادر F9 يقيس المبلغ الإجمالي للاتحاد الإقليمي المتولدة عن عينة من النسيج على الوقت من الحضانة. هذا هو ما يعادل صافي رصيد التوليف RA وهدم.

في حين أن نادر-LacZ نظام مراسل خلية F9 حساس للغاية وتنوعا، وهناك عدة خطوات حل المشاكل الحرجة التي أدخلنا من أجل ضمان موثوقية من هذا النظام. أولا، كما هو مبين في الشكل رقم 1، من المهم للحفاظ على صحة هذه الخلايا عن طريق الممرات العادية من دون السماح لهم زصف إلى confluency. ثانيا، لقد لوحظ في وقت لاحق الممرات عادة ما ينتج عنها ردود RA متناسقة، حتى لو تم الحفاظ على الثقافات باستمرار تحت التحديد مع G418. لاستكشاف هذا، فمن المستحسن أن تجاهل الثقافات بعد 20 الممرات وذوبان الجليد قارورة جديدة. وبالإضافة إلى ذلك، يجب إجراء فحوصات منتظمة للتأكد من أن الخلايا لا تزال مراسل المستجيبين قوية على وجود التهاب المفاصل الروماتويدي في وسائل الإعلام. ثالثا، إذا عرض الممرات مبكرة الاستجابة الضعيفة أو غير موحدة إلى RA (الشكل 1B، يسار)، واحد أو عدة جولات من استنساخ فرعي قد تكون ضرورية حتى يتم الحصول على المستجيبين قوية (الشكل 1B، تي righ). وأخيرا، قبل أن تشارك في الثقافة، فمن المستحسن أن عينات الأنسجة مثل الأجنة وneurospheres يتم فصل الخلايا واحدة. وقد لاحظنا أن تفارق من نتائج العينات في القياسات اللونية أكثر اتساقا. قد يكون هذا يرجع إلى توزيع أكثر عدالة للاتحاد الإقليمي في الآبار الثقافة، كما فصل الخلايا هي في يونيشكل من أشكال الاتصال مع الخلايا المراسل.

وقدمت العديد من التعديلات أيضا على بروتوكول الأصلي ^14. أولا، تم كميا استجابة RA الخلايا نادر-LacZ F9 عن طريق تحديد بشكل مباشر على الخلايا وقياس الامتصاصية في 610 نانومتر بدلا من جمع الخلايا وتحليل المحللة للنشاط ب غالاكتوزيداز ^14. تعديل آخر هو المباشرة ثقافة مشتركة من عينات فصلها مع F9 نادر-LacZ قبل القياس الكمي للاستجابة RA. وذكرت وسائل السابقة زرع العينات بشكل منفصل وإضافة فقط وسائل الإعلام من هذه الثقافات إلى F9 نادر-LacZ ^16،18.

على الرغم من كونه نظام القوية، وF9 نادر-LacZ مراسل مقايسة لديها العديد من القيود. واحد الحد من هذا الخط خلية المراسل هو أنه على الرغم من أنه يستجيب بقوة لوجود جميع العابر RA، فإنه يستجيب أيضا لأيزومرات حمض الريتينويك الأخرى بما في ذلك 9-رابطة الدول المستقلة-RA و 13 رابطة الدول المستقلة للاتحاد الإقليمي؛ ومع ذلك، فإنها هي 100 أضعاف أكثر حساسية لجميع العابر المقارنة RAالأحمر بأيسومرات أخرى ^18. الحد أخرى لهذا النظام هو أن استجابة تعتمد على الجرعة الخطية يقع فقط بين 10 ^-13 م إلى 10 ^-7 M في-RA ^14،18. وبالتالي، إذا بمقارنة مستويات RA خارج هذه الحدود، فإنه قد يكون من الضروري إجراء تخفيف التسلسلي للعينة حتى سقوط القياسات ضمن مجموعة خطية. وأخيرا، لأن هذا هو في المقام الأول مقايسة اللونية، ونقطة النهاية للتنمية اللون تختلف بين العينات والتجارب. وبالتالي، فمن المهم أن منحنى القياسية دائما تكون مطلية بشكل متواز لكل تجربة واحدة من أجل استخدامها لتقدير حجم خلية الرد المراسل.

في الختام، لقد ذكرت استخدام خط الخلية مراسل F9 نادر-LacZ RA RA لقياس مستويات كميا في الأجنة E8.5 ووغير المبلغ عنه سابقا، في neurospheres. براعة هذا النظام المراسل قد تسمح لتقدير مستويات RA في أي خلية أو نسيج نوع تقريبا، ومعبد المنعم يوسف يؤدي إلى تطوير تطبيقات متنوعة في المستقبل.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C3H/HeSn-Gpr161vl/J mouse strain	Jackson Laboratory	000316
F9 RARE-LacZ reporter cell line			from Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia)
DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES)	ThermoFisher Scientific	11330-057
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified	ThermoFisher Scientific	26140-079	Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm in 37 °C for media preparation
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; light-sensitive
G418	ThermoFisher Scientific	10131-027	Store at 4 °C; light-sensitive
2% Gelatin	Sigma Aldrich	G1393	Store at 4 °C
B-27 supplement (2 % stock solution)	ThermoFisher Scientific	17504-044	Store at -20 °C in 1-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm at room temperature for media preparation
Murine Epidermal Growth Factor (EGF)	PeproTech	315-09	Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1xPBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C
Murine Fibroblast Growth Factor (FGF)-basic	PeproTech	450-33	Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1x PBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C
50% glutaraldehyde	Amresco	M155	Store at 4 °C
Sodium deoxycholate monohydrate (C24H39NaO4 · H2O)	Sigma Aldrich	D5670	Store at RT
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside)	Promega	V3941	Store stock at -20 °C
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	41639	Store at RT
all-trans Retinoic Acid (at-RA)	Sigma Aldrich	R-2625	Store 1 ml aliquots of stock in -80 °C; extremely sensitive to light
TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12605-010	Store at RT
0.25% trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200-056	alternative to TrypLE Express; aliquot and store at -20 °C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	ThermoFisher Scientific	14170-112	Store at 4 °C
10x phosphate buffered solution (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010-023	Store at 4 °C
Papain	Worthington	LK003176	Store at 4 °C.
Trypsin	Worthington	LS003703	Store in 1 ml aliquots at -20 °C.
Hyaluronic acid	Calbiochem	385908	Store 200 μl aliquots at -20 °C.
DNaseI	Worthington	LS002139	Store in 200 μl aliquots at -20 °C
Kynurenic acid	Sigma Aldrich	K3375	Store in 200 μl aliquots at -20 °C
95% ethanol
Mr. Frosty Freezing container	ThermoFisher Scientific	5100-0001
10 cm culture dish (non-cell culture treated)
10 cm culture dish (cell culture treated)
6 cm culture dish (non-cell culture treated)
96-well cell culture plates
1.5 ml microcentrifuge tubes
1.5 ml amber microcentrifuge tubes
1.5 ml cryovials
37 °C water bath
surgical scissors
fine surgical scissors
no. 5 forceps
blunt-ended forceps
scalpel blade
glass pasteur pipettes
cotton
alcohol lamp
ELISA plate reader
stereomicroscope