طريقة بديلة لإعداد نموذج مع انخفاض عدد الخلايا لتحليل تيم

Summary

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Abstract

انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) على تفاصيل تنظيم الخلوية والتركيب الدقيق. ومع ذلك، وتحليل تيم من السكان الخلية نادرة، وخاصة الخلايا في تعليق مثل الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)، لا يزال محدودا نظرا لاشتراط وجود عدد الخلايا عالية أثناء إعداد العينات. هناك عدد قليل من cytospin أو أحادي الطبقة نهج لتحليل تيم من عينات نادرة، ولكن هذه الأساليب تفشل في الحصول على بيانات كمية كبيرة من عدد محدود من الخلايا. هنا، يتم وصف نهج بديل ورواية لإعداد العينات في الدراسات تيم لسكان الخلية النادرة التي تمكن من تحليل الكمي.

عدد الخلايا منخفضة نسبيا، أي 10000 HSCs، وقد استخدمت بنجاح لتحليل تيم مقارنة ملايين الخلايا التي تستخدم عادة لدراسات تيم. على وجه الخصوص، تم تنفيذ ايفانز تلطيخ الأزرق بعد امتصاص العرق، غلوتارالدهيد (PFA-GA) تثبيت لتصور ااا خلية صغيرةالسماح، الأمر الذي سهل مبنية الاغاروز. وقد لوحظت مجموعات من الخلايا عديدة في قطاعات رقيقة جدا. كانت الخلايا التشكل الحفاظ عليها بشكل جيد، وكانت التفاصيل فائقة الهيكلية للالميتوكوندريا جولجي المعقدة وعدة مرئية. يسمح هذا البروتوكول كفاءة، وسهلة وقابلة للتكرار تحضير عينات من عدد الخلايا منخفضة، ويمكن استخدامها لتحليل تيم النوعي والكمي على السكان الخلية نادرة من العينات البيولوجية محدودة.

Introduction

وقد تم كشف النقاب عن تفاصيل فائقة الهيكلية وشبه العضيم بصفة أساسية من الخلايا بواسطة المجهر الإلكتروني انتقال (تيم) دراسات من الأنسجة أو الكريات خلية ^1،2. القطع الصلبة من أنسجة يمكن استخدامها بسهولة للدراسات المجهر الإلكتروني. ومع ذلك، تيم يحلل ^1،3 على الخلايا في تعليق تظل صعبة وتتطلب أعداد الخلايا عالية، أي الملايين من الخلايا. وبسبب هذا، تحليلات فائقة الهيكلية للسكان الخلية نادر في التعليق، وعلى سبيل المثال، الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)، لا يتم تقييمها بسهولة. فشلت محاولات متعددة لتحليل تيم من العينات النادرة باستخدام cytospin أو أحادي الطبقة النهج للحصول على بيانات كمية كبير من عدد محدود من الخلايا. وهكذا، فإن اشتراط وجود عدد الخلايا عالية يحد من استخدام هذه الأداة القوية لفهم تفاصيل التركيبية التحت خلوية من السكان الخلية نادرة.

والقيد الرئيسي للدراسات تيم مع عدد محدود من الخلاياالصورة في تعليق هو توطين الخلايا للمعالجة، وبالتالي، لا تزال الدراسات تيم من خلايا محدودة مع بخاصة الأحجام الصغيرة الصعبة. وقد تم اعتماد عدة أساليب بديلة لمواجهة هذا القيد: جيش صرب البوسنة / bisacrylamide (BSA-BA) البلمرة بوساطة من تعليق خلية، وتلطيخ الخلايا مع صبغة لجعلها مرئية على دعم رقيقة بما coverslips، وتيم يحلل من الاستعدادات cytospin ^4-6. ومع ذلك، تم تحقيق نجاح محدود جدا، كما تم العثور على عدد قليل جدا من الخلايا في الفروع بعد فائقة باجتزاء. التحدي الرئيسي المتمثل في تحديد الخلايا المتفرقة استمرت لأحادي الطبقة الخلية لا تزال في معظمها غير مرئية في هلام طدت لباجتزاء. وعلاوة على ذلك، وإعداد cytospin من الخلايا قد يغير منظمتهم الخلوية بسبب انتشار الخلايا وهشاشة بنية الخلية. وبالتالي، هذه العيوب المتأصلة تستدعي نهجا جديدا لإجراء دراسات تيم من السكان الخلية نادرة مع أكثرالتناسق. للتغلب على هذه المشكلة، التي وصفناها رواية وعينة بديلة طريقة التحضير للدراسات تيم من السكان الخلية نادرة ^7.

هنا، نحن الإبلاغ عن كفاءة بروتوكول إعداد نموذج لأداء تيم من العينات البيولوجية النادرة مع النتائج النوعية والكمية متسقة. تم إجراء ايفانز تلطيخ الأزرق بعد تثبيت لتوطين بيليه خلية صغيرة من الخلايا انخفاض عدد، أي 10000 نخاع العظم الجذعية المكونة للدم والخلايا الاولية التي لولاها بقيت غير مرئية، وكان جزءا لا يتجزأ من بيليه إلى الاغاروز قبل عمليات الجفاف والراتنج التضمين. هذه الطريقة مجموعات الخلايا معا، ويمكن تحليل كفاءة التركيب الدقيق وتنظيم التحت خلوية من الخلايا الجذعية المكونة للدم (يدعى لين ^- هيئة السلع التموينية-1 ⁺ ج كيت ⁺ Flt3 ^- CD34 ^-، شهادة الثانوية العامة)، نادر 0.2 - السكان الخلية 0.5٪ في نخاع العظام. هذا الموالية التجريبيtocol يمكن أن تكون مفيدة لإجراء دراسات فائقة الهيكلية والحصول على النتائج الكمية على العديد من السكان نادر لكنه مهم للغاية.

Protocol

وقد وافق جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة الحيوان المؤسسية في مؤسسة أبحاث سينسيناتي للأطفال. لهذه الدراسة، تم عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم من نخاع العظام من C57BL / 6 الفئران الفطرية الذين تتراوح أعمارهم بين 2-4 أشهر. الفرز الخلية باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بعد تلطيخ BM مع صناع سطح مختلفة بما في ذلك النسب، ج كيت، هيئة السلع التموينية-1، واستخدمت Flt3 وCD34 لتنقية شهادة الثانوية العامة على أساس Lin- هيئة السلع التموينية-1 ⁺ ج ⁺ كيت Flt3 ^- CD34 ^- النابضة استراتيجية كما وصف بروتوكول قياسي قبل ^8.

تنبيه: وتستخدم عدة مواد كيميائية شديدة السمية أثناء هذا الإجراء. هذه هي سامة عن طريق الإستنشاق وملامسة الجلد. يرجى ارتداء القفازات والملابس الواقية. العمل في غطاء الدخان بينما كان يعمل مع هذه المواد الكيميائية.

1. الخلايا، التثبيت، تلطيخ وقبل التضمين

1. نوع 10000 الخلايا الجذعية المكونة للدم (باستخدام لين ^- هيئة السلع التموينية-1 + ج ⁺ كيت Flt3 ^- CD34 ^- النابضة الاستراتيجية؛ السكان LT-شهادة الثانوية العامة) في أنبوب 1.5 مل microcentrifuge تحتوي 600 ميكرولتر التعديل Dulbecco Iscove لوالمتوسطة (IMDM) مع 10٪ مصل بقري جنيني باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية.
2. تدور باستمرار HSCs فرزها في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل باستخدام جهاز للطرد المركزي مع دلاء أرجوحة بها. إزالة المتوسطة من قبل التطلع لطيف وترك 200 ميكرولتر المتوسطة في أنابيب في كل خطوة. في هذه المرحلة، لا يزال بيليه خلية غير مرئية في الأنبوب.
3. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 0.2 مل من محلول تثبيتي 2X في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة ^1،9.
   1. جعل الحل تثبيتي الطازجة قبل استخدامها. في 1X، ويتألف الحل من 3٪ امتصاص العرق و 2.5٪ غلوتارالدهيد في 0.1 م العازلة كاكوديلات.
4. الطرد المركزي الخلايا في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة عند 30 درجة مئوية باستخدام أجهزة الطرد المركزي مع دلاء البديل التدريجي.
5. غسل الخلايا مع 600 ميكرولتر من العازلة 0.1 M كاكوديلاتباستخدام الطرد المركزي وترك العازلة 200 ميكرولتر في الأنبوب بعد الطرد المركزي.
6. وصمة عار على الخلايا الثابتة بإضافة 200 ميكرولتر من 2 ملغ حل / مل من إيفانس الأزرق في المخزن كاكوديلات واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT. سوف تكون ملونة الخلايا الأزرق.
7. غسل الخلايا 3 مرات مع 600 ميكرولتر من 0.1 M عازلة كاكوديلات باستخدام الطرد المركزي وترك العازلة 200 ميكرولتر في الأنبوب في كل مرة.
8. إعادة تعليق الخلايا في 200 العازلة ميكرولتر ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 0.5 مل. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة باستخدام جهاز للطرد المركزي أعلى الجدول. إزالة العازلة بلطف من دون إزعاج الآن مرئية بيليه خلية صغيرة، وترك عازلة 50 ميكرولتر في الأنبوب.
9. إضافة 200 ملغ انصهار منخفضة الاغاروز إلى 5 مل من 0.1 M عازلة كاكوديلات في أنبوب 15 مل عن حل الاغاروز 4٪. إذابة الاغاروز عن طريق نقل أنبوب إلى الماء المغلي في زجاجة 100 مل والحفاظ فاتر حتى استخدامها.
10. إضافة 200 ميكرولتر من 4٪ انصهار منخفضة حل الاغاروز في 0.1 M cacodylaالشركة المصرية للاتصالات عازلة لتعليق الخلية في أنبوب 0.5 مل وعلى الفور أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة عند 30 درجة مئوية باستخدام أعلى الجدول الطرد المركزي.
11. بعد التأكد من أن الخلايا مكعبات في الجزء السفلي من أنبوب 0.5 مل في الاغاروز شبه صلبة بعد الطرد المركزي، ونقل على الفور الأنبوب إلى 4 درجات مئوية أو الثلج لمدة 20 دقيقة لترسيخ الاغاروز. هذه الخطوة هي حرجة للغاية، وبيليه خلية مرئية صغير في هذه النتائج خطوة في كتلة جيدة من الخلايا تحت المجهر الالكتروني.
12. نقل بعناية الاغاروز طدت تحتوي على بيليه خلية من الأنبوب إلى 35 مم البلاستيك طبق بتري تحتوي العازلة باستخدام 27 إبرة G ^3،10.
13. تقليم الاغاروز المتصلبة التي تحتوي على بيليه خلية في قطعة واحدة من حوالي 1-2 ملم مع مشرط. نقل قطعة الاغاروز التي تحتوي على بيليه الخلية إلى أنبوب 1.5 مل جديد.
14. يغسل 2-3 مرات باستخدام 600 ميكرولتر من العازلة 0.1 M كاكوديلات عن طريق إضافة وإزالة العازلة باستخدام ماصة دون الطرد المركزي. استخدام هذه القطعة الاغاروز التي تحتوي على بيليه خلية للخطوة التالية. في هذه الخطوة، يمكن تخزين العينة عند 4 درجات مئوية خلال الليل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

2. المعاملة بالأوزميك، الجفاف، تضمين

1. إزالة المنطقة العازلة كاكوديلات من أنبوب 1.5 مل مع بيليه الخلية التي تحتوي على الاغاروز باستخدام ماصة. إضافة 1.0 مل من 1٪ أكسيد الأوزميوم الثماني (أوسو ₄₎ حل في غطاء الدخان، واحتضان لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
2. يغسل ثلاث مرات مع 600 ميكرولتر من 0.1 M عازلة كاكوديلات ونقل العينة إلى 20 مل الزجاج التلألؤ قنينة مع غطاء.
3. معالجة عينة من الجفاف، تسلل وتضمينها في الراتنج (على سبيل المثال، LX-112) مع تغييرات المسلسل من الحلول التالية في لوحة 6 جيدا. نقل الاغاروز قطعة خلية بيليه باستخدام ملقط.
   1. تزج العينة في 25٪ من الإيثانول في RT لمدة 15 دقيقة.
   2. تزج العينة في 50٪ من الإيثانول في RT لمدة 15 دقيقة.
   3. تزج العينة في 75٪ الإيثانول في RT لمدة 15 دقيقة.
   4. تزج العينة في 95٪ من الإيثانول في RT لمدة 15 دقيقة.
   5. تزج العينة في الإيثانول بنسبة 100٪ في RT لمدة 15 دقيقة، مرتين.
   6. تزج العينة في الإيثانول: الراتنج (3: 1) في RT لمدة 30 دقيقة.
   7. تزج العينة في الإيثانول: الراتنج (1: 1) في RT لمدة 30 دقيقة.
   8. تزج العينة في الإيثانول: الراتنج (1: 3) في RT لمدة 30 دقيقة.
   9. تزج العينة في الراتنج النقي في RT لمدة 60 دقيقة، مرتين.
4. نقل العينة إلى الجزء السفلي من الهرم طرف العفن على شكل المطاط باستخدام ملقط بعناية وإضافة الراتنج أكثر نقاء على رأس عينة لملء القالب. احتضان العينة على 60 درجة مئوية لمدة 72 ساعة للبلمرة الراتنج.
5. إزالة هرم راتنج بلمرة من القوالب قبل التواء في قالب من المطاط. وينبغي أن تكون كتلة سوداء صغيرة من الخلايا مرئية في هرم راتنج بلمرة، كما هو موضح سابقا ^7. إرفاق هرم راتنج بلمرة على اسطوانة تصاعد استخدام cyanoacrylate.

معشوقة = "jove_title"> 3. باجتزاء ونقل المجهر

1. تقليم كتلة الهرم بشفرة حلاقة وسكين الماس بعد تصاعد كتلة على مشراح-فائقة. جعل قصيرة شكل شبه منحرف واسعة مع الجزء العلوي والجزء السفلي من كتلة موازية لبعضها البعض، ومع الجانبين الزاوية بالتساوي. هذا الشكل من الهرم يساعد لباجتزاء المسلسل.
2. وعلاوة على ذلك، وتقليم كتلة حول الخلية بيليه مع سكين الماس وإزالة الأجزاء البلاستيكية حول الخلية بيليه الاغاروز قطعة.
3. قطع 1 ميكرون المقاطع باستخدام وسيلة مشراح جدا. نقل 1 ميكرون المقاطع من قارب الماء لشريحة زجاجية باستخدام أداة رمش وأداة حلقة معدنية كما ذكرت سابقا ^7. نقل المقاطع على الشرائح والشرائح نقل إلى صفيحة ساخنة (37 درجة مئوية) لمدة التجفيف.
4. إضافة قطرة من طولويدين حل الأزرق إلى أقسام باستخدام حقنة مجهزة 0.22 ميكرون تصفية واحتضان لمدة 3 دقائق. شطف الشرائح مع الماء المقطر ولوآخرون الأقسام تجف. تحقق مع المجهر الضوئي لتحديد موقف من الخلايا.
5. قطع المقاطع رقيقة جدا (70-100 نانومتر) باستخدام سكين الماس. نقل 2-3 أقسام على شبكات 200 شبكة من القارب المياه إلى طبق بيتري الزجاج باستخدام أداة رمش.
6. نقل الزجاج طبق بتري تحتوي على شبكات مع أقسام لوحة الساخنة عند 30 درجة مئوية لتجف أقسام لمدة 30 دقيقة.
7. وصمة عار على شبكات مع قطرات من 1٪ خلات اليورانيل في RT لمدة 10 دقيقة ثم يشطف في الماء المقطر 6-8 مرات. وصمة عار مع رينولدز يؤدي سيترات، في RT لمدة 5 دقائق ويشطف في الماء المقطر 6-8 مرات. نقل الزجاج طبق بتري تحتوي على شبكات لوحة الساخنة عند 37 درجة مئوية لتجف أقسام.
8. تحليل المقاطع باستخدام المجهر الإلكتروني، في 80 كيلو فولت ^7.

النتائج

بروتوكول فعال وثابت لإعداد نموذج لأداء تحليل تيم من يوصف انخفاض عدد الخلايا. ساعد بعد تثبيت تلطيخ مع ايفانز الأزرق ونقل الخلايا إلى أنبوب 0.5 مل microcentrifuge لتصور بيليه خلية صغيرة ^7. المعاملة بالأوزميك مع tetraoxide الأوسيميوم في الاغاروز أدى إلى سهولة ...

Discussion

تمكن هذه الطريقة تحليل تيم على أرقام الهواتف المحمولة المنخفضة، باستخدام ايفانز تلطيخ الأزرق والاغاروز التضمين في توطين بيليه خلية صغيرة خلال الجفاف، التضمين الراتنج والعمليات باجتزاء. الأهم من ذلك أنها تحتفظ مجموعات الخلايا معا، ويحافظ على الخلية فائقة هيكل، الذ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln	Electron microscopy Sciences	15713	CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.
Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln	Electron microscopy Sciences	16350	CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.
Cacodyladate buffer	Electron microscopy Sciences	12300	Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 °C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.
Evans Blue	Sigma	E-2129
Low melting agarose	Sigma Aldrich	A-5030
Osmium tetraoxide	Electron microscopy Sciences	19130	1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.
LX-112 Embedding Kits (LADD®)
DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)	LADD	21340	Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30
NMA (Nadic methyl anhydride)	LADD	21350
Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)	LADD	21310	CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.
DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)	LADD	21370
Reynolds lead citrate (EM Stain II)	Leica		CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.
Uranyl acetate (EM Stain I)	Leica	8072820	CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	ATCC	30-2005	composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx
Pyramid tip mold	Ted Pella	10585
mounting cylinders	Ted Pella	10580
Ultra-microtome	(Leica EM UC7)
200 mesh grids (nikil)	Electron microscopy Sciences	G-200 Ni
Electron Microscope	Hitachi model H-7650
Image capture engine software	AMT-600
35 mm plastic Petri dishes	Fisher scientific
Quick Bond Super glue Cyanoacrylate	Electron microscopy Sciences	72588
Razor blades
Glass scintillation vials	Fisher scientific	03-337-14
Glass slides
Eyelash tool
Metal Loop tool