גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח TEM

Summary

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Abstract

במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) ניתן פרטים על ארגון ultrastructure הסלולר. עם זאת, ניתוח TEM של אוכלוסיות תאים נדירות, במיוחד התאים בתרחיף כמו בתאי גזע hematopoietic (HSCs), נשאר מוגבל בשל הדרישה של מספר תאים גבוה במהלך הכנת המדגם. ישנן כמה גישות cytospin או בשכבה לניתוח TEM ממדגמים נדירים, אבל הגישות האלה לא מצליחות לקבל נתונים כמותיים משמעותיים מהמספר המצומצם של תאים. הנה, גישה חלופית ורומן להכנת מדגם במחקרי TEM מתוארת על אוכלוסיות תאים נדירות המאפשרות ניתוח כמוני.

מספר תאים נמוך יחסית, כלומר, 10,000 HSCs, שימש בהצלחה לניתוח TEM לעומת מיליוני תאים המשמשים בדרך כלל ללימודי TEM. בפרט, מכתים אוונס הכחול בוצע לאחר paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) קיבעון לדמיין את pel התא הזעירבואו, אשר הקלו מוטבע agarose. אשכולות של תאים רבים נצפו בסעיפים דקים. היו תאי מורפולוגיה השתמרה היטב, ואת הפרטים אולטרה-המבניים של המיטוכונדריה המורכב וכמה Golgi נראו. פרוטוקול יעיל, קל לשחזור זו מאפשר הכנת מדגם ממספר תא נמוך וניתן להשתמש בו לצורך ניתוח TEM איכותי וכמותיים על אוכלוסיות תאים נדירות מ דגימות ביולוגיות מוגבלות.

Introduction

Ultra-מבניים תת-אברון הפרטים של תאים נחשפו בעיקר על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (TEM) מחקרים מרקמות או כדורי תא ^1,2. חתיכות מוצקות של רקמות יכולות בקלות להיות מנוצלות ללימודים במיקרוסקופ אלקטרונים. עם זאת, TEM מנתח ^1,3 על תאים בתרחיף להישאר מאתגר להצריך מספרים סלולריים גבוהים, כלומר, מיליוני תאים. בגלל זה, ניתוחים אולטרה-מבניים של אוכלוסיות תאי נדירות השעיה, למשל, בתאי גזע hematopoietic (HSCs), אינם להעריך בקלות. ניסיונות מרובים עבור ניתוח TEM ממדגמים נדירים תוך שימוש בגישות cytospin או בשכבה מצליחים לקבל נתונים כמותיים משמעותי ממספר מצומצם של תאים. לכן, הדרישה של מספר תאים גבוהים מגבילה את השימוש של כלי רב עצמה זה כדי להבין את פרטי ultrastructural subcellular של אוכלוסיות תאים נדירות.

מגבלת מפתח ללימודי TEM עם מספר מצומצם של תאs השעיה הוא הלוקליזציה של התאים לעיבוד ולכן, מחקרי TEM מתאי מוגבל עם מידות קטנות במיוחד להישאר מאתגר. מספר גישות חלופיות אומצו כדי להתמודד עם מגבלה זו: ארגון ה- BSA / bisacrylamide (BSA-BA) פילמור בתיווך של השעיה התא, צביעת תאים עם צבע כדי לגרום להם גלוי על תמיכה סרט דק כולל coverslips, ו TEM מנתח מן ההכנות cytospin ^4-6. עם זאת, הצלחה מוגבלת מאוד הושגה, כמו מעט מאוד תאים נמצאו בסעיפים לאחר חתך אולטרה. האתגר המרכזי של לזיהוי תאים דלילים נמשך משום monolayer התא אינה נראית בעיקר ג'ל הקרושה עבור חתך. יתר על כן, הכנת cytospin של תאים עשויה לשנות הארגון הסלולר שלהם בשל הפצת תא ואת השבריריות של מבנה התא. לפיכך, חסרונות הגלומים אלה מתחייבים גישה חדשנית לבצע מחקרי TEM מן אוכלוסיות תאים נדירות עם יותרעֲקֵבִיוּת. כדי להתגבר על בעיה זו, שתארנו רומן ושיטת הכנת מדגם חלופי מחקרי TEM מן אוכלוסיות תאים נדירות ^7.

כאן אנו מדווחים פרוטוקול הכנת מדגם יעיל לבצע TEM מ דגימות ביולוגיות נדירות עם תוצאות איכותיות וכמותיות עקביות. כתמי כחולי אוונס בוצעו לאחר הקיבוע למקם תא גלול זעיר מתאי מספר נמוך, כלומר, 10,000 מח עצם גזע hematopoietic ו ובתאים שאחרת נותרו בלתי נראה, לבין הגלולה הייתה מוטבעת לתוך agarose לפני תהליכי הטמעת התייבשות שרף. שיטה זו אשכולות התאים יחד ומאפשר ניתוח יעיל של ultrastructure וארגון subcellular של תאי גזע hematopoietic (מזוהה לין ^- SCA-1 ⁺ c-Kit ⁺ FLT3 ^- CD34 ^-; HSC), 0.2 נדיר - האוכלוסייה 0.5% התא במח העצם. פרו ניסיוני זהtocol יכול להיות שימושי כדי לבצע מחקרים אולטרה-מבניים להשיג תוצאות כמותיות על אוכלוסיות נדירות רבות אבל מאוד חשובות.

Protocol

כל הפרוצדורות אושרו על ידי ועדת בעלי החיים המוסדית קרן המחקר של סינסינטי הילדים. לצורך המחקר, בתאי גזע hematopoietic בודדו ממח העצם של עכברים מולדים C57Bl / 6 בגילים 2 - 4 חודשים. מיון תאים באמצעות FACS לאחר צביעה של BM עם מקבלי משטח שונים כולל Lineage, c-Kit, SCA-1, FLT3 ו- CD34 שימש לטיהור HSC מבוסס על Lin- SCA-1 ⁺ c-kit ⁺ FLT3 ^- CD34 ^- gating אסטרטגיה כמו פרוטוקול סטנדרטי תיאר לפני ^8.

זהירות: כימיקלים רעילים מספר מאוד משמשים במהלך הליך זה. אלו הם רעילים משאיפת ומגע עור. יש ללבוש כפפות וביגוד מגן. לעבוד במנדף תוך כדי עבודה עם כימיקלים אלה.

1. תאים, קיבוע, מכתים טרום הטבעה

1. מיין 10,000 בתאי גזע hematopoietic (באמצעות לין ^- SCA-1 ^{+ c-kit + FLT3 - CD34 - gating האסטרטגיה; LT-HSC אוכלוסייה) בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge המכיל 600 μl השונה של Iscove הבינוני של Dulbecco (IMDM) עם 10% בסרום שור עוברי באמצעות FACS.}
2. ספין למטה HSCs מיון XG ב 1000 במשך 10 דקות בתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge באמצעות צנטריפוגות עם דליים התנופה-אאוט. הסר בינוני על ידי שאיפה עדינה ולהשאיר 200 בינוני μl של צינורות בכל שלב. בשלב זה, התא הגלול אינו נראה בצינור.
3. תקן את התאים על ידי הוספת 0.2 מ"ל של תמיסת מקבע 2x בטמפרטורת החדר (RT) במשך שעה 1 ^1,9.
   1. הפוך את הפתרון מקבע טרי לפני השימוש. בשעה 1x, הפתרון מורכב glutaraldehyde paraformaldehyde 3% ו -2.5% במאגר M 0.1 cacodylate.
4. צנטריפוגה התאים XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 30 ° C באמצעות צנטריפוגות עם דליים-אאוט התנופה.
5. שטפו תאים עם 600 μl של חיץ 0.1 M cacodylateבאמצעות צנטריפוגה ולהשאיר חיץ 200 μl בצינור לאחר צנטריפוגה.
6. הכתם התאים קבוע על ידי הוספת 200 μl של 2 פתרון מ"ג / מ"ל ​​של כחול אוונס במאגר cacodylate דגירה במשך 20 דקות ב RT. התא יהיה בצבע כחול.
7. לשטוף התאים 3 פעמים עם 600 μl של 0.1 מ 'צנטריפוגה באמצעות חיץ cacodylate ולהשאיר חיץ 200 μl בצינור בכל פעם.
8. Re- להשעות את התאים 200 חיץ μl ולהעביר את ההשעיה לתא צינור 0.5 מ"ל. צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 10 דקות באמצעות צנטריפוגות בראש הטבלה. הסר חוצץ בעדינות מבלי להפריע גלולה תא זעיר נראה כעת, ולהשאיר חיץ 50 μl בצינור.
9. הוספת 200 מ"ג התכה נמוכה agarose עד 5 מ"ל של 0.1 M חיץ cacodylate בצינור 15 מ"ל פתרון agarose 4%. ממיסים את agarose על ידי העברת צינור למים רותחים בתוך בקבוק זכוכית 100 מ"ל ולשמור פושרים עד בשימוש.
10. הוסף 200 μl של 4% התכה נמוכה מומס agarose ב 0.1 M cacodylate חיץ ההשעיה תא צינור 0.5 מ"ל ומיד צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 30 ° C באמצעות צנטריפוגות בראש הטבלה.
11. לאחר אישור תאים pelleted בתחתית הצינור 0.5 מ"ל לתוך agarose חצי מוצק לאחר צנטריפוגה, מיד להעביר את הצינור עד 4 מעלות צלזיוס או קרח למשך 20 דקות כדי לחזק את agarose. שלב זה הוא קריטי מאוד, כמו תא גלול גלוי קטן תוצאות שלב זה מקבץ טוב של תאים מתחת למיקרוסקופ האלקטרונים.
12. להעביר בזהירות את agarose הקרושה המכיל את התא גלולה מהצינור על צלחת פלסטיק 35 מ"מ פטרי המכילה חיץ באמצעות ^3,10 מחט 27 G.
13. חתוך את agarose הקרושה המכיל את התא גלולה לתוך חתיכה אחת של כ 1 - 2 מ"מ עם אזמל. מעבירים את פיסת agarose המכיל גלולה לתא צינור 1.5 מ"ל חדש.
14. לשטוף 2 - 3 פעמים באמצעות 600 μl של חיץ 0.1 M cacodylate ידי הוספה והסרה של חיץ באמצעות פיפטה ללא צנטריפוגה. השתמש חתיכת agarose זה המכיל את התא גלול עבור לשלב הבא. בשלב זה, המדגם יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני המעבר לשלב הבא.

2. Osmification, התייבשות, והטבעה

1. הסר את חוצץ cacodylate מהצינור 1.5 מ"ל עם תא גלולה המכילה באמצעות agarose טפטפת. להוסיף 1.0 מ"ל של 1% אוסמיום ארבע-חמצני (OSO ₄₎ פתרון במנדף, דגירה במשך שעה 1 ב 4 ° C..
2. לשטוף שלוש פעמים עם 600 μl של 0.1 מ 'cacodylate חיץ ולהעביר את המדגם כדי בקבוקון הנצנץ זכוכית 20 מ"ל עם מכסה.
3. לעבד את המדגם עבור התייבשות, חדירה והטבעה לתוך שרף (למשל, LX-112) עם שינויים סידוריים של הפתרונים הבאים לפי צלחת גם 6. הזז את פיסת agarose תא גלול באמצעות מלקחיים.
   1. לטבול את המדגם באתנול 25% ב RT במשך 15 דקות.
   2. לטבול את המדגם באתנול 50% ב RT במשך 15 דקות.
   3. לטבול את המדגם ב 75% אתנול ב RT במשך 15 דקות.
   4. לטבול את המדגם באתנול 95% ב RT במשך 15 דקות.
   5. לטבול את המדגם באתנול 100% ב RT במשך 15 דקות, פעמיים.
   6. לטבול את המדגם באתנול: שרף (3: 1) ב RT במשך 30 דקות.
   7. לטבול את המדגם באתנול: שרף (1: 1) ב RT במשך 30 דקות.
   8. לטבול את המדגם באתנול: שרף (1: 3) ב RT במשך 30 דקות.
   9. לטבול את המדגם שרף טהור ב RT במשך 60 דקות, פעמיים.
4. מעבירים את המדגם לתחתית תבנית גומי בצורת קצה הפירמידה באמצעות מלקחיים בזהירות ולהוסיף שרף טהור יותר על גבי המדגם למלא את התבנית. דגירת המדגם ב 60 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות עבור פילמור שרף.
5. סר הפירמידה שרפה polymerized מהתבניות על ידי סיבוב עובש הגומי. אשכול שחור קטן של תאים צריך להיות גלוי בפירמידת שרף polymerized, כפי שתואר קודם לכן ^7. צרף הפירמידה שרף polymerized על גליל הרכבה באמצעות cyanoacrylate.

ילדה = "jove_title"> 3. חתך במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים

1. חתוך את בלוק הפירמידה עם סכין גילוח וסכין יהלומים לאחר הרכבת הבלוק על-microtome אולטרה. ליצור צורה טרפזית רחבה קצרה עם החלק העליון והחלק התחתון של מקבילי בלוק זה לזה, ועם צדדים זוויתי באופן שווה. צורה זו של הפירמידה מסייעת עבור חתך סדרתי.
2. יתר על כן, לקצץ את הבלוק סביב התא גלול עם סכין היהלום ולהסיר את חלקי הפלסטיק סביב יצירת agarose תא הגלולה.
3. חותכים 1 מיקרומטר חלקים באמצעות-microtome אולטרה. הזז את 1 מיקרומטר חלקים מהסירה למים לשקופית זכוכית באמצעות כלי עפעף ו כלי לולאת מתכת כפי שדווח בעבר ^7. העברת חלקים בשקופיות ומגלשות העברת הצלחת החמה (37 מעלות צלזיוס) במשך ייבוש.
4. הוסף טיפה של תמיסת toluidine הכחולה בסעיפים באמצעות מזרק מצויד 0.22 מיקרומטר מסנן דגירה במשך 3 דקות. יש לשטוף את השקופיות במים מזוקקים let בסעיפים לייבוש. בדוק עם מיקרוסקופ אור כדי לזהות את המיקום של התאים.
5. חותכים סעיפים דקים (70 - 100 ננומטר) באמצעות סכין יהלום. זז 2 - 3 חלקים על רשתות 200-רשת מהסירה למים בכלי זכוכית פטרי באמצעות כלי עפעף.
6. מעביר את צלחת זכוכית פטרי המכילה רשתות עם קטעים על צלחת חמה ב 30 מעלות צלזיוס לייבוש חלקים למשך 30 דקות.
7. כתם הרשתות עם טיפות של אצטט uranyl 1% ב RT במשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים 6 - 8 פעמים. הכתם עם ריינולדס להוביל ציטראט, ב RT במשך 5 דקות ולשטוף במים מזוקקים 6 - 8 פעמים. מעביר את צלחת זכוכית פטרי המכילה את הרשתות על צלחת חמה ב 37 מעלות צלזיוס לייבוש חלקות.
8. לנתח את החלקים עם מיקרוסקופ אלקטרונים, ב 80 kV ^7.

תוצאות

פרוטוקול יעיל ועקבי להכנת מדגם לבצע ניתוח TEM ממספר נמוך של תאים מתואר. מכתים שלאחר קיבוע עם אוונס כחול העברת התאים צינור 0.5 מ"ל microcentrifuge עזר להמחיש את התא גלולה זעירה ^7. Osmification עם אוסמיום ארבע-חמצני ב agarose הביא לגילוי קל של התא גלולה כהה במהלך ה?...

Discussion

שיטה זו מאפשרת ניתוח TEM על מספרים סלולריים נמוכים, באמצעות אוונס מכתים כחול agarose ההטבעה למקם תא גלול זעיר במהלך ההתייבשות, הטבעת השרף ו חתך תהליכים. חשוב לציין, היא שומרת צבירי תאים יחד ושומרת על אולטרה-מבנה התא, אשר רצוי לבחון מספר תאי כימות של נתונים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln	Electron microscopy Sciences	15713	CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.
Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln	Electron microscopy Sciences	16350	CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.
Cacodyladate buffer	Electron microscopy Sciences	12300	Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 °C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.
Evans Blue	Sigma	E-2129
Low melting agarose	Sigma Aldrich	A-5030
Osmium tetraoxide	Electron microscopy Sciences	19130	1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.
LX-112 Embedding Kits (LADD®)
DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)	LADD	21340	Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30
NMA (Nadic methyl anhydride)	LADD	21350
Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)	LADD	21310	CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.
DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)	LADD	21370
Reynolds lead citrate (EM Stain II)	Leica		CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.
Uranyl acetate (EM Stain I)	Leica	8072820	CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	ATCC	30-2005	composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx
Pyramid tip mold	Ted Pella	10585
mounting cylinders	Ted Pella	10580
Ultra-microtome	(Leica EM UC7)
200 mesh grids (nikil)	Electron microscopy Sciences	G-200 Ni
Electron Microscope	Hitachi model H-7650
Image capture engine software	AMT-600
35 mm plastic Petri dishes	Fisher scientific
Quick Bond Super glue Cyanoacrylate	Electron microscopy Sciences	72588
Razor blades
Glass scintillation vials	Fisher scientific	03-337-14
Glass slides
Eyelash tool
Metal Loop tool