Une approche alternative pour la préparation de l'échantillon avec une faible Nombre de cellules d'analyse TEM

Résumé

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Résumé

microscopie électronique à transmission (MET) fournit des détails sur l'organisation cellulaire et ultrastructure. Cependant, l'analyse TEM des populations de cellules rares, en particulier les cellules en suspension telles que des cellules souches hématopoïétiques (CSH), reste limitée en raison de l'exigence d'un grand nombre de cellules lors de la préparation de l'échantillon. Il y a quelques cytocentrifugation ou monocouche approches pour l'analyse TEM à partir d'échantillons rares, mais ces approches ne parviennent pas à obtenir des données quantitatives significatives du nombre limité de cellules. Ici, une approche alternative et novatrice pour la préparation d'échantillons dans les études TEM est décrit pour les populations de cellules rares qui permet une analyse quantitative.

Un certain nombre de cellules relativement faible, à savoir, 10.000 CSH, a été utilisé avec succès pour l' analyse TEM par rapport aux millions de cellules généralement utilisées pour les études de TEM. En particulier, Evans coloration au bleu a été réalisée après paraformaldéhyde-glutaraldéhyde (PFA-GA) fixation de visualiser le pel cellulaire minusculelaisser, ce qui a facilité l'intégration dans l'agarose. Clusters de nombreuses cellules ont été observées dans les sections ultra-minces. Les cellules ont une morphologie bien conservé, et les détails ultra-structure des mitochondries complexes et plusieurs Golgi étaient visibles. Ce protocole efficace, simple et reproductible, permet la préparation d'échantillons à partir d'un numéro de cellule faible et peut être utilisé pour l'analyse TEM qualitative et quantitative sur les populations de cellules rares à partir d'échantillons biologiques sont limitées.

Introduction

Détails ultra-structuraux et sous-organelles de cellules ont principalement été révélée par microscopie électronique à transmission (MET) des études de tissus ou des culots cellulaires ^1,2. des morceaux solides de tissus peuvent être facilement utilisés pour des études de microscopie électronique. Cependant, TEM analyse ^1,3 sur des cellules en suspension restent difficiles et nécessitent le nombre de cellules élevées, à savoir, des millions de cellules. De ce fait , les analyses structurelles des ultra-populations de cellules rares en suspension, par exemple, des cellules souches hématopoïétiques (CSH), ne sont pas facilement évalués. Plusieurs tentatives d'analyse TEM à partir d'échantillons rares en utilisant cytocentrifugation ou monocouche approches ne parviennent pas à obtenir des données quantitatives significatives du nombre limité de cellules. Ainsi, l'exigence d'un nombre élevé de cellules limite l'utilisation de cet outil puissant pour comprendre les détails ultrastructuraux subcellulaire des populations de cellules rares.

Une limitation clé pour les études TEM avec un nombre limité de celluless en suspension est la localisation des cellules de traitement et donc, les études TEM provenant de cellules limitées avec en particulier les petites tailles restent difficiles. Plusieurs approches alternatives ont été adoptées pour contrer cette limitation: la BSA / bisacrylamide (BSA-BA) de polymérisation médiée de la suspension cellulaire, la coloration des cellules avec un colorant pour les rendre visibles sur un support de film mince comprenant des lamelles, et TEM analyse à partir de préparations de cytocentrifugation ^4-6. Cependant, le succès très limité a été atteint, que très peu de cellules ont été trouvées dans les sections après ultra-tronçonnage. Le principal défi de l'identification des cellules rares persiste parce que la monocouche cellulaire reste la plupart du temps invisible dans le gel solidifié pour sectionner. En outre, la préparation Cytospin de cellules peut modifier leur organisation cellulaire en raison de l'étalement cellulaire et la fragilité de la structure cellulaire. Par conséquent, ces inconvénients inhérents justifient une nouvelle approche pour réaliser des études de TEM à partir de populations de cellules rares avec pluscohérence. Pour surmonter ce problème, nous avons décrit un procédé nouveau et de préparation d'échantillons alternative pour les études TEM de populations de cellules rares ^7.

Nous rapportons ici un protocole de préparation d'échantillon efficace pour effectuer TEM à partir d'échantillons biologiques rares avec des résultats qualitatifs et quantitatifs cohérents. Evans coloration au bleu a été réalisée après la fixation de localiser un culot cellulaire minuscule à partir de cellules de faible nombre, à savoir, 10.000 moelle osseuse souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices qui, autrement , sont restés invisibles, et le culot a été incorporé dans l' agarose avant que les processus de déshydratation et de résine enrobage. Cette méthode pôles de cellules ensemble et permet une analyse efficace de l'ultrastructure et de l' organisation subcellulaire des cellules souches hématopoïétiques (identifié comme Lin ^- Sca-1 ⁺ c-Kit ⁺ Flt3 ^- CD34 ^-; HSC), rare 0,2 - population de cellules à 0,5% dans la moelle osseuse. Cette pro expérimentaletocol peut être utile pour réaliser des études ultra-structurelles et obtenir des résultats quantitatifs sur de nombreuses populations rares mais très importants.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le comité d'animaux dans les institutions à la recherche de la Fondation du Cincinnati Children. Pour cette étude, des cellules souches hématopoïétiques ont été isolées de la moelle osseuse de souris C57BL / 6 consanguines âgées de 2 - 4 mois. Cellule de tri en utilisant FACS après coloration des BM avec différents fabricants de surface , y compris Lineage, c-Kit, Sca-1, Flt3 et CD34 a été utilisé pour la purification de HSC basée sur Lin- Sca-1 ⁺ c-Kit ⁺ Flt3 ^- CD34 ^- gating stratégie comme protocole standard décrit avant ^8.

ATTENTION: Plusieurs produits chimiques hautement toxiques sont utilisés au cours de cette procédure. Ceux-ci sont toxiques par inhalation et par contact avec la peau. S'il vous plaît porter des gants et des vêtements de protection. Travailler dans une hotte tout en travaillant avec ces produits chimiques.

1. Les cellules, fixation, coloration et pré-encastrement

1. Trier 10.000 cellules souches hématopoïétiques ( à l' aide de Lin ^- Sca-1 ^{+ c-Kit + Flt3 - CD34 - gating stratégie; Population LT-HSC) dans un tube de 1,5 ml contenant 600 pi de milieu de Dulbecco modifié par Iscove (IMDM) avec 10% de sérum fœtal bovin en utilisant FACS.}
2. Isoler CSH triés à 1000 xg pendant 10 min dans un tube de 1,5 ml à l'aide d'une centrifugeuse avec des seaux de swing-out. Retirez milieu par aspiration douce et laisser 200 milieu ul dans les tubes à chaque étape. A ce stade, le culot cellulaire reste invisible dans le tube.
3. Fixer les cellules par addition de 0,2 ml d' une solution fixative 2x à température ambiante (TA) pendant 1 heure ^1,9.
   1. Faire la solution de fixateur frais avant utilisation. 1x, la solution est composée de 3% de paraformaldehyde et 2,5% de glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate 0,1 M.
4. Centrifuger les cellules à 1000 g pendant 10 min à 30 ° C en utilisant une centrifugeuse avec des seaux swing-out.
5. Laver les cellules avec 600 pi de tampon cacodylate 0,1 Mpar centrifugation et laisser un tampon de 200 pi dans le tube après centrifugation.
6. Colorer les cellules fixées par addition de 200 ul d'une solution de Bleu Evans / ml 2 mg dans du tampon cacodylate et laisser incuber pendant 20 min à température ambiante. Les cellules seront de couleur bleue.
7. Laver les cellules 3 fois avec 600 pi de tampon cacodylate 0,1 M en utilisant la centrifugation et laisser un tampon de 200 pi dans le tube à chaque fois.
8. Remettre en suspension les cellules dans un tampon de 200 ul et transférer la suspension cellulaire à un tube de 0,5 ml. Centrifuger à 1000 xg pendant 10 min en utilisant une centrifugeuse de dessus de table. Retirer le tampon doucement sans déranger le petit culot cellulaire maintenant visible, et de laisser un tampon de 50 pi dans le tube.
9. Ajouter 200 mg d'agarose à bas point de fusion 5 ml de tampon cacodylate 0,1 M dans le tube de 15 ml d'une solution d'agarose à 4%. Faire fondre l'agarose en transférant le tube à l'eau bouillante dans une bouteille en verre de 100 ml et maintenir tiède jusqu'à utilisation.
10. Ajouter 200 pi de 4% de fusion bas dissous agarose dans 0,1 M cacodylaun tampon TE à la suspension cellulaire dans un tube de 0,5 ml et immédiatement centrifuger à 1000 g pendant 10 min à 30 ° C en utilisant une centrifugeuse de table.
11. Après avoir vérifié que les cellules sédimentées au fond du tube de 0,5 ml dans de l'agarose semi-solide après centrifugation, on transfère immédiatement le tube à 4 ° C ou sur la glace pendant 20 minutes pour solidifier la gélose. Cette étape est très critique, car un petit culot cellulaire visible à cette étape aboutit à un bon groupe de cellules au microscope électronique.
12. Soigneusement transférer l'agarose solidifié contenant le culot cellulaire du tube à un plastique plat de 35 mm de Petri contenant un tampon en utilisant une aiguille G ^3,10 27.
13. Rogner les agarose solidifiées contenant le culot cellulaire dans une pièce d'environ 1 - 2 mm avec un scalpel. Transférer le morceau d'agarose contenant le culot cellulaire dans un nouveau tube de 1,5 ml.
14. Laver 2 - 3 fois en utilisant 600 pi de tampon cacodylate 0,1 M en ajoutant et en enlevant le tampon en utilisant la pipette sans centrifugation. En utilisant ce morceau d'agarose contenant le culot cellulaire pour l'étape suivante. A cette étape, l'échantillon peut être conservé à 4 ° C pendant une nuit avant de passer à l'étape suivante.

2. Osmification, Déshydratation, Embedding

1. Retirer le tampon cacodylate à partir du tube de 1,5 ml avec le culot cellulaire contenant de l'agarose à l'aide d'une pipette. Ajouter 1,0 ml de 1% tétraoxyde d' osmium (OSO ₄₎ solution dans une hotte, et incuber pendant 1 heure à 4 ° C.
2. Laver trois fois avec 600 pi de tampon cacodylate 0,1 M et transférer l'échantillon à 20 ml à scintillation en verre du flacon avec un bouchon.
3. Traiter l'échantillon pour la déshydratation, l' infiltration et l' incorporation dans la résine (par exemple, LX-112) avec modifications en série des solutions suivantes dans une plaque à 6 puits. Déplacer la pièce d'agarose cellule-pastille en utilisant une pince.
   1. Immerger l'échantillon dans 25% d'éthanol à température ambiante pendant 15 min.
   2. Immerger l'échantillon dans 50% d'éthanol à température ambiante pendant 15 min.
   3. Immerger l'échantillon dans 75%l'éthanol, à la température ambiante pendant 15 min.
   4. Immerger l'échantillon dans l'éthanol à 95% à température ambiante pendant 15 min.
   5. Immerger l'échantillon dans 100% d'éthanol à la température ambiante pendant 15 minutes, deux fois.
   6. Immerger l'échantillon dans un mélange éthanol: résine (3: 1) à température ambiante pendant 30 min.
   7. Immerger l'échantillon dans un mélange éthanol: résine (1: 1) à température ambiante pendant 30 min.
   8. Immerger l'échantillon dans un mélange éthanol: résine (1: 3) à la température ambiante pendant 30 min.
   9. Immerger l'échantillon dans la résine pure à la température ambiante pendant 60 minutes, deux fois.
4. Transférer l'échantillon vers le bas de la pointe de la pyramide moule en caoutchouc en forme soigneusement à l'aide de pinces et d'ajouter une résine plus pure sur le dessus de l'échantillon pour remplir le moule. Incuber l'échantillon à 60 ° C pendant 72 h pour la polymérisation de la résine.
5. Retirer la pyramide de résine polymérisée à partir des moules en tordant le moule en caoutchouc. Une petite grappe noire de cellules doit être visible dans la pyramide de résine polymérisée, comme décrit précédemment ^7. Fixer la pyramide de résine polymérisée sur le cylindre de montage en utilisant cyanoacrylate.

3. Sectionnement et microscopie électronique à transmission

1. Couper le bloc de pyramide avec une lame de rasoir et un couteau de diamant après le montage du bloc sur un ultra-microtome. Faire une forme trapézoïdale large courte avec le haut et le bas du bloc parallèle à l'autre, et avec des côtés uniformément inclinées. Cette forme de la pyramide aide pour la coupe de série.
2. En outre, couper le bloc autour du culot cellulaire avec le couteau de diamant et enlever les sections en plastique autour de la pièce d'agarose de culot cellulaire.
3. Couper 1 um sections à l'aide d'un ultra-microtome. Déplacez les 1 um sections du bateau de l' eau sur une lame de verre à l' aide d' un outil de cils et un outil de boucle métallique comme indiqué précédemment ^7. sections de transfert sur des diapositives et des diapositives de transfert à la plaque chaude (37 ° C) pour le séchage.
4. Ajouter une goutte de solution de bleu de toluidine, les sections à l'aide d'une seringue équipée de filtre de 0,22 um et laisser incuber pendant 3 min. Rincer les lames avec de l'eau distillée et let les sections sèches. Vérifier au microscope optique pour identifier la position des cellules.
5. Couper des sections ultra-minces (70-100 nm) à l'aide d'un couteau de diamant. Déplacer 2 - 3 sections sur des grilles de 200 mailles du bateau de l'eau à une boîte de Pétri en verre en utilisant un outil de cil.
6. Transférer la boîte de Pétri en verre contenant des grilles avec des sections sur une plaque chaude à 30 ° C pour sécher les sections pendant 30 min.
7. Colorer les grilles avec des gouttes de 1% d'acétate d'uranyle à température ambiante pendant 10 minutes, puis rincer à l'eau distillée 6 - 8 fois. Colorer avec Reynolds citrate de plomb, à la température ambiante pendant 5 minutes et rincer à l'eau distillée 6 - 8 fois. Transférer la boîte de Pétri en verre contenant les grilles à une plaque chaude à 37 ° C pour sécher les sections.
8. Analyser les sections avec un microscope électronique à 80 kV ^7.

Résultats

Un protocole efficace et cohérent pour la préparation d'échantillons pour effectuer l'analyse TEM de faible nombre de cellules est décrit. Post-fixation coloration avec Evans bleu et le transfert de cellules dans un tube de 0,5 ml de microcentrifugation a aidé à visualiser le petit culot cellulaire ^7. Osmification avec le tétraoxyde d'osmium dans de l'agarose a conduit à une détection aisée de la pastille de cellule sombre lors de la déshydratation e...

Discussion

Cette méthode permet une analyse TEM sur un faible nombre de cellules, en utilisant Evans coloration bleu et agarose enrobage pour localiser une pastille de cellules minuscules lors de la déshydratation, enrobage de résine et les processus sectionner. Surtout, il maintient ensemble des agrégats de cellules et la cellule conserve l'ultra-structure, qui est souhaitable d'examiner de multiples cellules pour la quantification des données.

Dans les études TEM, une boulette cellulair...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln	Electron microscopy Sciences	15713	CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.
Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln	Electron microscopy Sciences	16350	CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.
Cacodyladate buffer	Electron microscopy Sciences	12300	Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 °C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.
Evans Blue	Sigma	E-2129
Low melting agarose	Sigma Aldrich	A-5030
Osmium tetraoxide	Electron microscopy Sciences	19130	1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.
LX-112 Embedding Kits (LADD®)
DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)	LADD	21340	Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30
NMA (Nadic methyl anhydride)	LADD	21350
Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)	LADD	21310	CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.
DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)	LADD	21370
Reynolds lead citrate (EM Stain II)	Leica		CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.
Uranyl acetate (EM Stain I)	Leica	8072820	CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	ATCC	30-2005	composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx
Pyramid tip mold	Ted Pella	10585
mounting cylinders	Ted Pella	10580
Ultra-microtome	(Leica EM UC7)
200 mesh grids (nikil)	Electron microscopy Sciences	G-200 Ni
Electron Microscope	Hitachi model H-7650
Image capture engine software	AMT-600
35 mm plastic Petri dishes	Fisher scientific
Quick Bond Super glue Cyanoacrylate	Electron microscopy Sciences	72588
Razor blades
Glass scintillation vials	Fisher scientific	03-337-14
Glass slides
Eyelash tool
Metal Loop tool