TEM analizi için düşük Hücre sayısı ile örnek hazırlanması için alternatif bir yaklaşım

Özet

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Özet

Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), hücresel organizasyon ve ultrastrüktürü ayrıntılı bilgi sağlar. Bununla birlikte, bu hematopoietik kök hücreler (HSC), nadir hücre popülasyonlarının, süspansiyon içinde, özellikle hücre TEM analizi, numune hazırlanması sırasında yüksek hücre sayısı şartı ile sınırlı kalmaktadır. Orada kıt örneklerden TEM analizi için birkaç sitospin veya tek katmanlı yaklaşımlar vardır, ancak bu yaklaşımların hücrelerin sınırlı sayıda önemli nicel veriler elde etmek için başarısız. Burada, TEM çalışmalarda numune hazırlanması için bir seçenek ve yeni bir yaklaşım kantitatif analiz sağlar nadir hücre popülasyonları için tarif edilmektedir.

Nispeten düşük bir hücre sayısı, yani, 10,000 HSC hücreleri, başarılı bir şekilde, tipik olarak, TEM çalışmaları için kullanılan hücrelerin, milyonlarca göre TEM analizi için kullanıldı. Özellikle, Evans mavisi boyama paraformaldehit-glutaraldehit sonra minik hücre PEL görselleştirmek için (PFA-GA) tespit yapıldıAgaroz gömme kolaylaştırdı, izin verin. Çok sayıda hücre kümeleri, ultra ince bölümler tespit edilmiştir. Hücreler iyi korunmuş morfolojiye vardı ve Golgi kompleksi ve çeşitli mitokondri ultra-yapısal ayrıntıları görünür. Bu, etkin olarak kolay ve tekrarlanabilir bir protokol, düşük hücre sayısı örnek hazırlama izin verir ve sınırlı biyolojik numunelerden nadir hücre popülasyonları üzerinde nitel ve nicel TEM analizi için kullanılabilir.

Giriş

Hücrelerin Ultra yapısal ve alt organel ayrıntıları ağırlıklı transmisyon elektron mikroskobu (TEM) doku veya hücre pelet ^1,2 dan çalışmalar tarafından ortaya konmuştur. dokuların katı parçaları kolayca elektron mikroskopisi çalışmaları için kullanılabilir. Ancak, TEM süspansiyon hücreleri üzerinde ^1,3 zorlu kalır ve yüksek hücre yani sayıları, hücrelerin milyonlarca gerektiren analiz eder. Bu nedenle, süspansiyonun nadir hücre popülasyonlarının ultra yapısal analizi, örneğin, hematopoietik kök hücreler (HSC), kolayca değerlendirilmemektedir. sitospin veya tek katmanlı yaklaşımları kullanarak kıt örneklerden TEM analizi için birden fazla girişimleri hücrelerin sınırlı sayıda önemli nicel veriler elde etmek için başarısız. Bu nedenle, yüksek hücre sayısı gereksinimi nadir hücre popülasyonlarının hücre içi ultrastrüktürel detaylarını anlamak için bu güçlü aracın kullanımını sınırlar.

Hücrenin sınırlı sayıda TEM çalışmalar için önemli bir sınırlamasısüspansiyondaki s işleme hücre lokalizasyonu ve bu nedenle, özellikle küçük boyutları ile sınırlıdır hücrelerden TEM çalışmaları zor olmaya devam etmektedir. Birkaç alternatif yaklaşımlar bu sınırlama karşı kabul edilmiştir: BSA / bisakrilamid (BSA-BA) hücre süspansiyonu aracılı polimerizasyon, lamelleri içeren ince bir film desteğine onları görünür hale getirmek için bir boya ile hücrelerin boyanması, ve TEM sitospin hazırlıkları ^4-6 analizleri. Çok az sayıda hücre ultra kesit sonra bölümlerde bulundu Ancak, çok sınırlı bir başarı elde edilmiştir. Hücre tek tabaka kesit için katılaşmış jel çoğunlukla görünmez kalır çünkü seyrek hücrelerin belirlenmesi önemli zorluk devam etmektedir. Ayrıca, hücrelerin Sitospin hazırlanması nedeniyle hücre yayılması ve hücre yapısının kırılganlık kendi hücresel organizasyonu değiştirebilir. Bu nedenle, bu doğal sakıncaları daha nadir hücre popülasyonlarının TEM çalışmaları yapmak için yeni bir yaklaşım garantitutarlılık. Bu sorunu aşmak için, nadir bir hücre popülasyonlarının ⁷ TEM çalışmalar için bir yeni ve alternatif örnek hazırlama yöntemi tanımlamaktadır.

Burada, tutarlı nitel ve nicel sonuçları ile kıt biyolojik örneklerden TEM gerçekleştirmek için etkili bir örnek hazırlama protokolü sunduk. Evans mavisi boyama, aksi takdirde görünmez kalacaktı düşük sayı hücreleri, yani 10.000 kemik iliği hematopoetik kök ve progenitör hücrelerden küçük bir hücre pelletini yerelleştirilmesine fiksasyon sonra yapıldı ve pelet dehidratasyon ve reçine gömme süreçlerine önce agaroz içine gömülü edildi. Bu yöntem bir arada hücreleri kümeleri ve ultrastrüktürü ve (Lin olarak tanımlanan ^- Sca-1 ⁺ c-Kit ⁺ Flt3 ^- CD34 ^-; HSC) hematopoetik kök hücrelerin hücre içi organizasyonun verimli analiz sağlar, nadir 0,2-0,5% hücre popülasyonu kemik iliğinde. Bu deneysel protokol ultra yapısal çalışmalar yapmak ve çok nadir ama çok önemli popülasyonları üzerindeki nicel sonuçlar elde etmek yararlı olabilir.

Protokol

Tüm deney prosedürleri Cincinnati Çocuk Araştırma Vakfı kurumsal hayvan komitesi tarafından onaylandı. 4 ay - Bu çalışma için, hematopoetik kök hücreler 2 yaşlı C57BL / 6 kendilenmiş farelerin kemik iliğinden izole edilmiştir. CD34 ^{- -} Ayırıcı stratejisi soy c-Kit, Sca-1 de dahil olmak üzere farklı yüzey makinesi BM'nin lekelemeden sonra FACS ile tasnif Celi, Flt3 ve CD34 Lin- Sca-1 ⁺ c-Kit ⁺ Flt3 göre HSC saflaştırılması için kullanılmıştır standart protokol önce ⁸ nitelendirdi.

DİKKAT: Çeşitli son derece zehirli kimyasallar bu işlem sırasında kullanılır. Bunlar Solunduğunda ve cilt ile temasında toksiktir. eldiven ve koruyucu giysiler giymek edin. Bu kimyasallar ile çalışırken davlumbaz çalışın.

1. Hücreler, Fiksasyon, Boyama ve Pre-gömme

1. Sca-1 ^- Lin kullanarak sırala 10.000 hematopoetik kök hücreler ( ^{+ c-Kit + Flt3 - CD34 - stratejisini yolluk; ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde LT-HSC popülasyonu) 600 ul FACS kullanılarak,% 10 fetal bovin serumu içeren Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı (IMDM).}
2. swing-out kova ile bir santrifüj kullanılarak 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde 10 dakika süreyle 1000 xg'de sıralı HKH'lerin aşağı doğru döndürün. yavaşça çekilerek Ortamı çıkarın ve her adımda tüplerinde 200 ul ortam bırakın. Bu aşamada, hücre peleti boru içinde görünmez kalır.
3. 1 saat ^1,9 oda sıcaklığında (RT) 2x sabitleyici çözeltisi, 0.2 ml hücreleri saptamak.
   1. Kullanmadan önce fiksatif çözüm taze olun. 1X çözelti, 0.1 M kakodilat tampon içinde% 3 paraformaldehit ve% 2.5 glutaraldehid oluşur.
4. Santrifüj swing-out kova ile bir santrifüj kullanılarak 30 ° C'de 10 dakika süreyle 1000 xg'de hücreleri.
5. 0.1 M kakodilat tampon 600 ul hücreleri yıkayınsantrifüj kullanılarak ve santrifüjlemeden sonra tüp içinde 200 ul tampon bırakın.
6. kakodilat tampon maddesi içinde Evans Mavisi 2 mg / ml solüsyon 200 ul ilave edilmesi suretiyle tespit hücreleri leke ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. Hücreler mavi renkli olacak.
7. 0.1 M kakodilat tampon kullanarak santrifüj 600 ul hücreleri 3 kere yıkayın ve tüp içinde her zaman 200 ul tampon bırakın.
8. 200 ul tampon hücreleri yeniden askıya ve 0.5 ml tüp hücre süspansiyonu aktarın. bir masa üstü santrifüj kullanılarak 10 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin. yavaşça şimdi görünür küçük hücre pelet bozmadan tamponu çıkarın ve tüp içinde 50 ul tampon bırakın.
9. % 4 agaroz çözeltisi 15 ml tüp içinde 0.1 M kakodilat tampon maddesi, 5 ml agaroz 200 mg düşük erime ekleyin. 100 ml'lik bir cam şişeye kaynar su tüpü aktararak agaroz eritin ve kullanılıncaya kadar ılık tutun.
10. % 4, erime noktası düşük, 200 ul 0.1 M agaroz cacodyla içinde çözüldü ekleHemen hücre 0.5 ml tüp içinde süspansiyon ve TE tamponu bir masa üstü santrifüj kullanılarak, 30 ° C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjlenir.
11. Hücreler santrifüj işleminden sonra, yarı-katı bir agaroz 0.5 mi tüpün altındaki topak olduğu doğrulandıktan sonra, hemen agaroz katılaşmaya 20 dakika boyunca 4 ° C'de tüp ya da buz aktarın. Bu adım elektron mikroskobu altında hücrelerin iyi bir kümede bu adımı sonuçlarına küçük görünür hücre pelet olarak, bir çok önemlidir.
12. Dikkatlice 27 G iğne ^3,10 kullanarak tampon içeren bir 35 mm plastik Petri kabı tüpten Hücre topaklarını içeren katılaşmış agaroz aktarın.
13. bir neşter ile 2 mm - yaklaşık 1 tek parça içine hücre pelet içeren katılaşmış agaroz Trim. yeni bir 1.5 ml'lik tübe Hücre topaklarını içeren agaroz parça aktarın.
14. ekleme ve santrifüj olmadan pipet kullanarak tampon kaldırarak 0.1 M kakodilat tampon 600 ul kullanarak 3 kez - 2 yıkayın. Bir sonraki adım için hücre pelet içeren bu agaroz parça kullanın. Bu adımda, numune bir gece boyunca bir sonraki adıma geçmeden önce 4 ° C'de saklanabilir.

2. Osmification, Dehidrasyon, Gömme

1. Hücre topağı bir pipet kullanılarak agaroz ihtiva eden 1.5 mi tüp kakodilat tamponu çıkarın. Bir çeker ocak içinde% 1 ozmiyum tetraoksit 1,0 ml (OsO ₄₎ çözeltisi ekleyin ve 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca inkübe edilir.
2. 0.1 M kakodilat tamponu, 600 | il ile üç kere yıkanır ve bir kap ile 20 mL'lik bir cam sintilasyon şişesine örnek aktarmak.
3. Dehidrasyon, infiltrasyon örnek işlenir ve reçine içine gömülü (örneğin, LX-112), bir 6 yuvalı plaka aşağıdaki çözümleri seri değişiklikleri. forseps kullanarak hücre pelet agaroz taşı.
   1. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında% 25 etanol içinde örnek bırakın.
   2. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında% 50 etanol içinde örnek bırakın.
   3. % 75 örnek daldırın15 dakika boyunca oda sıcaklığında etanol.
   4. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında% 95 etanol içinde örnek bırakın.
   5. iki kez, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında% 100 etanol içinde örnek bırakın.
   6. etanol örnek daldırın: reçine (3: 1), oda sıcaklığında 30 dakika karıştırıldı.
   7. etanol örnek daldırın: Reçine (1: 1), oda sıcaklığında 30 dakika karıştırıldı.
   8. etanol örnek daldırın: Reçine (1: 3), oda sıcaklığında 30 dakika karıştırıldı.
   9. iki kez, 60 dakika boyunca oda sıcaklığında saf reçine numune bırakın.
4. dikkatle forseps kullanılarak piramit şekilli uç lastik kalıp tabanına örnek aktarın ve kalıp doldurmaya numunesinin tepesine daha fazla saf reçine ilave edin. Reçine polimerizasyonu için 72 saat boyunca 60 ° C 'de örnek inkübe edin.
5. lastik kalıp bükerek kalıplardan polimerize reçine piramit çıkarın. Daha önce ⁷ açıklandığı gibi hücrelerin küçük siyah küme, polimerize reçine piramit görünür olmalıdır. siyanoakrilat kullanarak montaj silindir üzerinde polimerize reçine piramit takın.

3. Kesit ve Transmisyon Elektron Mikroskobu

1. Bir jilet ve ultra-mikrotom bloğu monte edildikten sonra bir elmas bıçak ile piramit bloğu Trim. üst ve birbirine bloğu paralel alt kısa bir geniş trapezoid şekli olun ve eşit açılı kenarları. Piramidin Bu şekil seri kesit için yardımcı olur.
2. Ayrıca, elmas bıçak ile hücre pelet etrafında blok kırpın ve hücre pelet agaroz parçası etrafında plastik bölümleri kaldırın.
3. ultra-mikrotom kullanılarak 1 um kesitler halinde kesilmiştir. Bir kirpik aracı ve daha önce ⁷ rapor gibi bir metal döngü aracını kullanarak bir bardak slayt su tekne 1 mikron bölümleri taşıyın. Kurutma için sıcak plaka (37 ° C) slaytlar ve transfer kızaklar üzerinde aktarma bölümleri.
4. 0.22 um bir filtre ile donatılmış ve 3 dakika boyunca inkübe bir şırınga kullanılarak bölümlere toluidin mavi bir çözelti damla ekleyin. distile su ve l ile slaytlar durulayınet bölümler kurulayın. Hücrelerin konumunu tanımlamak için bir ışık mikroskobu ile kontrol edin.
5. Bir elmas bıçak kullanarak - (100 nm 70) ultra-ince kesitler halinde kesilmiştir. Bir kirpik aracını kullanarak bir cam Petri kabı su tekne 200 mesh ızgaraları 3 bölümden - 2 taşıyın.
6. 30 dakika boyunca bölümler kuru, 30 ° C'de bir sıcak plaka bölümleri olan ızgaraları ihtiva eden cam bir Petri tabağına aktarın.
7. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 1 uranil asetat ile damla ızgaraları Leke ve damıtılmış su içinde 6 yıkayın - 8 defa. 8 kat - Reynolds ile Leke 6 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, sitrat, kurşun ve damıtılmış su içinde durulayın. bölümler kuru, 37 ° C'de bir sıcak plaka ızgaraları ihtiva eden cam bir Petri tabağına aktarın.
8. 80 kV ⁷ de, bir elektron mikroskobu ile bölümleri analiz edin.

Sonuçlar

Numune hazırlama için verimli ve tutarlı protokol hücrelerin sayısının düşük açıklanan TEM analizi gerçekleştirmek için. Evans mavisi ve 0.5 ml mikrosantrifüj tüp hücreleri transferi ile post-fiksasyon boyama minik hücre pelletini ⁷ görselleştirmek yardımcı oldu. Agaroz osmiyum tetraoksit ile Osmification dehidrasyon ve gömme sırasında koyu renkli hücre peleti kolay bir algılama yol açtı.

Tartışmalar

Bu yöntem, Evans mavisi boyama kullanarak ve agaroz dehidratasyon, reçine gömme sırasında küçük bir hücre pelletini lokalize gömme ve süreçleri kesit ile, düşük hücre sayıları TEM analizi sağlar. Daha da önemlisi, bu arada, hücre kümeleri korur ve verilerin ölçümü için çok sayıda hücreleri incelemek için arzu edilir, hücre ultra yapısını korur.

TEM çalışmalarda, milyonlarca hücreleri ihtiva eden bir hücre pelleti genellikle çok sayıda hücre veri eld...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln	Electron microscopy Sciences	15713	CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.
Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln	Electron microscopy Sciences	16350	CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.
Cacodyladate buffer	Electron microscopy Sciences	12300	Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 °C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.
Evans Blue	Sigma	E-2129
Low melting agarose	Sigma Aldrich	A-5030
Osmium tetraoxide	Electron microscopy Sciences	19130	1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.
LX-112 Embedding Kits (LADD®)
DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)	LADD	21340	Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30
NMA (Nadic methyl anhydride)	LADD	21350
Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)	LADD	21310	CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.
DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)	LADD	21370
Reynolds lead citrate (EM Stain II)	Leica		CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.
Uranyl acetate (EM Stain I)	Leica	8072820	CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	ATCC	30-2005	composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx
Pyramid tip mold	Ted Pella	10585
mounting cylinders	Ted Pella	10580
Ultra-microtome	(Leica EM UC7)
200 mesh grids (nikil)	Electron microscopy Sciences	G-200 Ni
Electron Microscope	Hitachi model H-7650
Image capture engine software	AMT-600
35 mm plastic Petri dishes	Fisher scientific
Quick Bond Super glue Cyanoacrylate	Electron microscopy Sciences	72588
Razor blades
Glass scintillation vials	Fisher scientific	03-337-14
Glass slides
Eyelash tool
Metal Loop tool