Un enfoque alternativo para la preparación de muestras con bajo número de celular para el análisis TEM

Resumen

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Resumen

microscopía electrónica de transmisión (TEM) proporciona detalles de la organización celular y ultraestructura. Sin embargo, el análisis de TEM de las poblaciones de células raras, especialmente células en suspensión, tales como células madre hematopoyéticas (HSC), sigue siendo limitada debido a la exigencia de un número de células de alta durante la preparación de la muestra. Hay algunos enfoques Cytospin o monocapa para el análisis TEM de las muestras de los escasos, pero estos enfoques no pueden conseguir datos cuantitativos significativos a partir del número limitado de células. Aquí, se describe un enfoque alternativo y novedoso para la preparación de muestras en los estudios TEM para poblaciones de células raras que permite el análisis cuantitativo.

Un número relativamente bajo de células, es decir, 10.000 HSC, se utilizó con éxito para el análisis de TEM en comparación con los millones de células utilizadas normalmente para estudios de TEM. En particular, la tinción de azul de Evans se realizó después de paraformaldehído-glutaraldehído fijación (PFA-GA) para visualizar la pequeña pel celulardejar, lo que facilitó la incorporación de agarosa. No se observaron agrupaciones de numerosas células en cortes ultrafinos. Las células tenían una morfología bien conservada, y los detalles ultra-estructurales de la mitocondria complejos y varios de Golgi eran visibles. Este protocolo eficiente, fácil y reproducible permite la preparación de muestras de un número bajo de células y se puede utilizar para el análisis TEM cualitativa y cuantitativa sobre las poblaciones de células raras de muestras biológicas limitados.

Introducción

Detalles-Ultra estructurales y sub-orgánulos de células se han puesto de manifiesto principalmente por microscopía electrónica de transmisión (TEM) estudios de tejidos o sedimentos celulares ^1,2. piezas sólidas de tejidos se pueden utilizar fácilmente para estudios de microscopía electrónica. Sin embargo, los análisis de TEM ^1,3 en las células en suspensión siguen siendo difíciles y requieren altos números de células, es decir, millones de células. Debido a esto, los análisis ultra-estructurales de las poblaciones de células raras en suspensión, por ejemplo, células madre hematopoyéticas (HSC), no son evaluados fácilmente. Múltiples intentos para el análisis de TEM de las muestras de los escasos utilizando cytospin o monocapa enfoques no pueden conseguir datos cuantitativos significativa del número limitado de células. Por lo tanto, el requisito de un número alto de células limita el uso de esta potente herramienta para entender los detalles ultraestructurales subcelulares de las poblaciones de células raras.

Una limitación clave para los estudios TEM con un número limitado de célulass en suspensión es la localización de las células para el procesamiento y, por tanto, los estudios de TEM de las células limitadas con particular tamaños pequeños siguen siendo difíciles. Varios enfoques alternativos se han adoptado para hacer frente a esta limitación: la BSA / bisacrilamida (BSA-BA) polimerización mediada por la suspensión celular, la tinción de las células con un tinte para que sean visibles en un soporte de película delgada incluyendo cubreobjetos, y análisis TEM de las preparaciones de citospina ^4-6. Sin embargo, se logró un éxito muy limitado, como se encontraron muy pocas células en secciones después de ultra-seccionamiento. El desafío clave de identificación de células dispersas persiste debido a la monocapa de células se mantiene prácticamente invisible en el gel solidificado para seccionar. Además, la preparación de citospina de células puede alterar su organización celular debido a la propagación de células y la fragilidad de la estructura celular. Por lo tanto, estos inconvenientes inherentes justifican un enfoque novedoso para llevar a cabo estudios de TEM de las poblaciones de células raras con másconsistencia. Para superar este problema, hemos descrito un método nuevo y preparación de la muestra alternativa para los estudios de TEM de las poblaciones de células raras ^7.

Aquí, se presenta un protocolo de preparación de muestras eficiente para llevar a cabo TEM de las muestras biológicas con escasos resultados cualitativos y cuantitativos consistentes. Evans tinción con azul se llevó a cabo después de la fijación para localizar un pequeño sedimento celular a partir de células de bajo número, es decir, 10.000 médula ósea madre hematopoyéticas y células progenitoras que de otro modo habrían permanecido invisible, y el sedimento se incrusta en agarosa antes de procesos de deshidratación y de la resina de inclusión. Este método agrupa las células juntos y permite el análisis eficaz de la ultraestructura y organización subcelular de las células madre hematopoyéticas (identificado como Lin ^- Sca-1 ⁺ c-Kit ⁺ Flt3 ^- CD34 ^-; HSC), una rara 0,2 - población de células 0,5% en la médula ósea. Este pro experimentaltocol puede ser útil para llevar a cabo estudios de ultra-estructurales y obtener resultados cuantitativos en muchas poblaciones raras pero altamente importantes.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el comité institucional de los animales en la Fundación de Investigación Infantil de Cincinnati. Para este estudio, se aislaron células madre hematopoyéticas de la médula ósea de ratones C57BL / 6 ratones endogámicos de entre 2 - 4 meses. Clasificación de células mediante FACS después de la tinción de BM con diferentes fabricantes de superficie incluyendo Lineage, c-Kit, Sca-1, Flt3 y CD34 se utilizó para la purificación de HSC basado en Flt3 Lin- Sca-1 ⁺ c-Kit ^{+ -} estrategia gating ^- CD34 como protocolo estándar descrito antes de las ^8.

PRECAUCIÓN: Varios productos químicos altamente tóxicos se utilizan durante este procedimiento. Estos son tóxicos por inhalación y contacto con la piel. Por favor, use guantes y ropa de protección. Trabajar en campana de humos mientras se trabaja con estos productos químicos.

1. células, la fijación, tinción y Pre-incrustación

1. Ordenar 10.000 células madre hematopoyéticas (utilizando Lin ^- Sca-1 ^{+ c-Kit + Flt3 - CD34 - gating estrategia; población LT-HSC) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 600 l de modificación de Dulbecco de Iscove Medio (IMDM) con suero bovino fetal al 10% usando FACS.}
2. Centrifugar las CMH ordenados a 1.000 xg durante 10 min en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando una centrífuga con cubos que oscila hacia afuera. Retire medio por aspiración suave y dejar 200 l de medio en los tubos en cada paso. En esta etapa, el sedimento celular permanece invisible en el tubo.
3. Fijar las células mediante la adición de 0,2 ml de solución de fijación 2x a temperatura ambiente (RT) durante 1 hora ^1,9.
   1. Hacer la solución de fijación fresca antes de su uso. En 1x, la solución se compone de 3% de paraformaldehído y 2,5% de glutaraldehído en tampón de cacodilato 0,1 M.
4. Centrifugar las células a 1000 xg durante 10 minutos a 30 ° C utilizando una centrífuga con cubos basculante.
5. Lavar las células con 600 l de tampón de 0,1 M de cacodilatousando centrifugación y dejar tampón de 200 l en el tubo después de la centrifugación.
6. Tinción de las células fijadas mediante la adición de 200 l de solución / ml 2 mg de azul de Evans en tampón cacodilato y se incuba durante 20 min a TA. Las células serán de color azul.
7. Lavar las células 3 veces con 600 l de tampón de cacodilato 0,1 M usando centrifugación y dejar tampón de 200 l en el tubo cada vez.
8. Vuelva a suspender las células en tampón de 200 l y transferir la suspensión celular a un tubo de 0,5 ml. Centrifugar a 1000 xg durante 10 min utilizando una centrífuga de mesa. Eliminar el tampón suavemente sin alterar el sedimento celular pequeña ahora visible, y dejar tampón de 50 l en el tubo.
9. Añadir 200 mg bajo punto de fusión de agarosa para 5 ml de tampón de cacodilato 0,1 M en el tubo de 15 ml de una solución de agarosa al 4%. Fundir la agarosa mediante la transferencia del tubo de agua hirviendo en una botella de vidrio de 100 ml y mantener tibia hasta que se usaron.
10. Añadir 200 l de 4% de agarosa de baja fusión disolvieron en 0,1 M cacodylatampón TE a la suspensión celular en un tubo de 0,5 ml e inmediatamente se centrifuga a 1000 xg durante 10 min a 30 ° C usando una centrífuga de mesa.
11. Después de confirmar que las células sedimentaron en el fondo del tubo de 0,5 ml en la agarosa semisólida después de la centrifugación, transferir inmediatamente el tubo a 4 ° C o de hielo durante 20 min para solidificar la agarosa. Este paso es muy crítico, ya que un pequeño sedimento celular visible en este paso resulta en un buen grupo de células bajo el microscopio electrónico.
12. Transferir con cuidado la agarosa solidificada que contiene el sedimento celular del tubo de plástico a un plato de 35 mm de Petri que contenía tampón utilizando un G ^3,10 27 aguja.
13. Recortar los agarosa solidificada que contiene el sedimento celular en una sola pieza de aproximadamente 1 - 2 mm con un bisturí. La transferencia de la pieza de agarosa que contiene el sedimento celular a un nuevo tubo de 1,5 ml.
14. Lavar 2 - 3 veces con 600 l de tampón cacodilato 0,1 M mediante la adición y la eliminación de buffer usando la pipeta sin centrifugación. Utilice esta pieza de agarosa que contiene el sedimento celular para el siguiente paso. En este paso, la muestra se puede almacenar a 4 ° C durante la noche antes de pasar al siguiente paso.

2. Osmification, deshidratación, incrustación

1. Eliminar el tampón de cacodilato desde el tubo de 1,5 ml con el sedimento celular que contiene agarosa usando una pipeta. Añadir 1,0 ml de 1% tetraóxido de osmio _(OsO4) de solución en una campana de humos, y se incuba durante 1 hora a 4 ° C.
2. Lavar tres veces con 600 l de tampón de cacodilato 0,1 M y transferir la muestra a un vial de centelleo de vidrio de 20 ml con una tapa.
3. Procesar la muestra para la deshidratación, la infiltración y la incrustación en resina (por ejemplo, LX-112) con los cambios de serie de las siguientes soluciones en una placa de 6 pocillos. Mover la pieza de agarosa por células de pellets con unas pinzas.
   1. Sumergir la muestra en 25% de etanol a temperatura ambiente durante 15 min.
   2. Sumergir la muestra en 50% de etanol a temperatura ambiente durante 15 min.
   3. Sumergir la muestra en el 75%etanol a TA durante 15 min.
   4. Sumergir la muestra en 95% de etanol a temperatura ambiente durante 15 min.
   5. Sumergir la muestra en 100% de etanol a temperatura ambiente durante 15 min, dos veces.
   6. Sumergir la muestra en etanol: resina (3: 1) a TA durante 30 min.
   7. Sumergir la muestra en etanol: resina (1: 1) a TA durante 30 min.
   8. Sumergir la muestra en etanol: resina (1: 3) a TA durante 30 min.
   9. Sumergir la muestra en resina pura a temperatura ambiente durante 60 min, dos veces.
4. Transferir la muestra a la parte inferior de la punta de la pirámide molde de goma en forma de uso de fórceps con cuidado y añadir la resina más pura en la parte superior de la muestra para llenar el molde. Incubar la muestra a 60 ° C durante 72 hr para la polimerización de la resina.
5. Retire la pirámide resina polimerizada de los moldes girando el molde de goma. Un pequeño grupo de células negro debe ser visible en la pirámide de resina polimerizada, como se ha descrito anteriormente ^7. Coloque la pirámide de resina polimerizada en el cilindro de montaje con cianoacrilato.

3. Seccionamiento y Microscopía Electrónica de Transmisión

1. Recorte el bloque de pirámide con una hoja de afeitar y un cuchillo de diamante después de montar el bloque en un ultra-micrótomo. Hacer una forma trapezoidal ancha corta con la parte superior y la parte inferior del bloque en paralelo entre sí, y con los lados de manera uniforme en ángulo. Esta forma de la pirámide ayuda de cortes seriados.
2. Además, recortar el bloque de todo el sedimento celular con el bisturí de diamante y quitar las secciones de plástico alrededor de la pieza de agarosa al sedimento celular.
3. Cortar 1 micras secciones usando un ultra-micrótomo. Mover las secciones 1 m desde el barco del agua a un portaobjetos de vidrio utilizando una herramienta de pestañas y una herramienta de lazo de metal como se informó anteriormente ^7. secciones de transferencia de diapositivas y diapositivas de transferencia a la placa caliente (37 ° C) para el secado.
4. Añadir una gota de solución de azul de toluidina a las secciones utilizando una jeringa equipada con 0,22 micras filtro y se incuba durante 3 min. Enjuague los portaobjetos con agua destilada y ly las secciones se sequen. Consulte con un microscopio de luz para identificar la posición de las células.
5. Los cortes de secciones ultrafinas (70 - 100 nm) utilizando un cuchillo de diamante. Mueve 2 - 3 secciones en las redes de malla 200 de la embarcación del agua a un plato de Petri de vidrio usando una herramienta de pestañas.
6. Transferir el cristal placa de Petri que contiene cuadrículas con secciones de una placa caliente a 30 ° C para secar las secciones durante 30 minutos.
7. Tinción de las rejillas con gotas de acetato de uranilo al 1% a temperatura ambiente durante 10 min y luego enjuague en agua destilada 6 - 8 veces. Mancha con citrato de plomo de Reynolds, a TA durante 5 min y enjuague en agua destilada 6 - 8 veces. Transferir el cristal placa de Petri que contiene las cuadrículas en una placa caliente a 37 ° C para secar las secciones.
8. Analizar las secciones con un microscopio electrónico, a 80 kV ^7.

Resultados

Un protocolo eficiente y consistente para la preparación de muestras para realizar análisis de TEM se describe de bajo número de células. Tinción posterior a la fijación con azul de Evans y la transferencia de las células a un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml ayudó a visualizar el pequeño sedimento celular ^7. Osmification con tetraóxido de osmio en agarosa condujo a una fácil detección del sedimento celular oscuro durante la deshidratación y la incrustación.

Discusión

Este método permite el análisis TEM de bajo número de células, mediante el uso de la tinción de azul de Evans y la incrustación de agarosa para localizar un pequeño sedimento celular durante la deshidratación, la incrustación de resina y los procesos de corte. Es importante destacar, que mantiene juntos los grupos de células y preserva la ultra-estructura de la célula, que es deseable para examinar células múltiples para la cuantificación de datos.

En estudios TEM, a menudo se ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln	Electron microscopy Sciences	15713	CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.
Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln	Electron microscopy Sciences	16350	CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.
Cacodyladate buffer	Electron microscopy Sciences	12300	Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 °C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.
Evans Blue	Sigma	E-2129
Low melting agarose	Sigma Aldrich	A-5030
Osmium tetraoxide	Electron microscopy Sciences	19130	1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.
LX-112 Embedding Kits (LADD®)
DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)	LADD	21340	Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30
NMA (Nadic methyl anhydride)	LADD	21350
Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)	LADD	21310	CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.
DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)	LADD	21370
Reynolds lead citrate (EM Stain II)	Leica		CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.
Uranyl acetate (EM Stain I)	Leica	8072820	CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	ATCC	30-2005	composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx
Pyramid tip mold	Ted Pella	10585
mounting cylinders	Ted Pella	10580
Ultra-microtome	(Leica EM UC7)
200 mesh grids (nikil)	Electron microscopy Sciences	G-200 Ni
Electron Microscope	Hitachi model H-7650
Image capture engine software	AMT-600
35 mm plastic Petri dishes	Fisher scientific
Quick Bond Super glue Cyanoacrylate	Electron microscopy Sciences	72588
Razor blades
Glass scintillation vials	Fisher scientific	03-337-14
Glass slides
Eyelash tool
Metal Loop tool