Thermostabilization والتعبير وتنقية، وتبلور من السيروتونين الناقل الإنسان ملزمة ل<em&gt; S</em&gt; -citalopram

Summary

توضح هذه المخطوطة كيفية كشف عن thermostabilizing الطفرات، وتنقية نقل السيروتونين البشري، وتوليد الأجسام المضادة تقارب عالية، وبلورة السيروتونين نقل الأجسام المضادة مجمع منضمة إلى اكتئاب المخدرات S -citalopram. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة النقل الأخرى الصعبة الغشاء، المستقبلات، وقنوات.

Abstract

ونقل السيروتونين هو الصوديوم وكلوريد جانب نقل أن "مضخات" السيروتونين خارج الخلية إلى داخل الخلايا. S -citalopram هو دواء يستخدم لعلاج الاكتئاب والقلق عن طريق ملزمة لنقل السيروتونين مع عالية تقارب، ومنع امتصاص السيروتونين. نحن هنا نورد إجراء فعال ومجموعة من الأدوات لتحقيق الاستقرار، صريحة، تنقية، وبلورة مجمعات للنقل الأجسام المضادة السيروتونين ملزمة لS -citalopram ومضادات الاكتئاب الأخرى. وقد تم تحديد الطفرات التي استقرار نقل السيروتونين باستخدام -citalopram S فحص ملزمة. السيروتونين الناقل أعرب في HEK293S GnTI transduced الفيروسة العصوية ^- الخلايا، أعيد تشكيل في proteoliposomes وتستخدم لزيادة الأجسام المضادة عالية تقارب. وضعنا استراتيجية لاكتشاف الأجسام المضادة التي هي مفيدة للدراسات الهيكلية. كما تم إنشاء نهج واضحة للتعبير عن شظايا الأجسام المضادة في خلايا Sf9.مجمعات للنقل الأجسام المضادة تنقيتها باستخدام هذا الإجراء هي تصرفت بشكل جيد وتتبلور بسهولة، وتنتج المجمعات مع S -citalopram أن حيد الضوء والأشعة السينية إلى 3-4 قرار Å. الاستراتيجيات التي وضعت هنا يمكن استخدامها لتحديد بنية البروتينات غشاء الصعبة الأخرى.

Introduction

ونقل السيروتونين (سرت) هو بروتين الغشاء لا يتجزأ التي تسهل نقل السيروتونين عبر الأغشية الخلوية ^1. سرت ينتمي إلى عائلة العصبي الصوديوم Symporters (NSSs) التي تضم أيضا الدوبامين والنورادرينالين النقل ^2. سرت هو الهدف الجزيئي للاكتئاب والمضادة للقلق الأدوية التي توصف على نطاق واسع والتي تعمل على كبح تنافسية نقل السيروتونين ^3. سرت يستغل من cotransport مواتية بقوة من الصوديوم لإزالة العصبي من الشق متشابك. وقد أظهرت توصيف واسع النطاق للنظام هرمون السيروتونين أن التغيرات في عملية الأيض السيروتونين يبدو أن التأثير تقريبا كل العمليات العصبية بما في ذلك المزاج، والنوم، والألم، والإدراك، والعدوان السلوكيات ^4. وظيفة سرت يمكن تعديلها من خلال استخدام مضادات الاكتئاب وامتصاص السيروتونين الانتقائية مثبطات (اس اس اراي) مثل S -citalopram، فضلا عن psychostimulaاليلة وعقاقير الإدمان مثل الأمفيتامين و3،4-methylenedioxy- N -methylamphetamine أو "النشوة" ^1،2.

اس اس اراي هي مهمة جدا لعلاج اضطرابات المزاج، ولكن الأساس الهيكلي الدقيق لعملها ليست مفهومة جيدا. WT سرت غير مستقر في المذيلات المنظفات، مما يعوق التقدم نحو (3D) ثلاثي الأبعاد هيكل من سرت ^5،6. مؤخرا، قمنا بتطوير أنواع من سرت التي هي بقوة مستقرة في مجموعة واسعة من المنظفات والاحتفاظ SSRI النشاط ⁶ ملزمة. وقد تم اختيار هذه المتغيرات سرت بالحرارة باستخدام فحص للحرارة على أساس القرب-التلألؤ. نحن هنا وصف الإجراء لتوليد الأجسام المضادة عالية تقارب التي يمكن أن تربط سرت، وتنقية وبلورة سرت بالحرارة، في مجمع مع الأجسام المضادة وS -citalopram.

يفترض هذا البروتوكول أن سرت و8B6 الجينات كانت ناجحاالمستنسخة ذ في ناقلات BacMam ⁷ و الحشرات التعبير، على التوالي. لتوليد الأجسام المضادة، كدنا] بقايا ترميز 73-616 من WT سرت تم استنساخ في ناقلات BacMam مع C-محطة بكتيريا الثاني العلامة (سرت _IC). للعرض على الشاشة للحرارة، وبقايا سرت 73-616 مع GFP C-المحطة، بكتيريا الثاني، و 10 صاحب العلامات (سرت _TC) تم استخدام. تم إنشاء الطفرات نقطة الفردية في الخلفية سرت _TC. لبروتوكول التبلور، تم استخدام البروتين الانصهار سرت-GFP مع التوأم بكتيريا [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) ₂ GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] و 10 صاحب العلامات، تحمل طفرات بالحرارة، Y110A، I291A، وT439S والطفرات من cysteines سطح C554A، C580A وC622A _(CC سرت). تم إدراج تسلسل الثرومبين الانقسام (LVPRGS) أيضا في _CC سرت بعد Q76 وT618 للسماح إزالة N- وC-ترميني. تم هندستها البلازميد ترميز 8B6 فاب للتعبير عن كل من الثقيلة والخفيفةسلاسل من الأجسام المضادة مع تسلسل إفراز GP67 تحت سيطرة اثنين من المروجين polyhedrin منفصل. تم وضع علامة على C-محطة من سلسلة كبيرة من الأجسام المضادة 8B6 مع 8-صاحب العلامة وتم إدراج موقع الثرومبين الانقسام بين السلسلة الثقيلة والعلامة.

Protocol

1. ترنسفكأيشن من تمسكا HEK293S GnTI ^- خلايا للشاشة للحرارة

1. إعداد بولي-D-ليسين (PDL) المغلفة لوحات 96-جيدا. أداء جميع الأعمال في غطاء تدفق الصفحي العقيمة.
   1. تصفية / مل من محلول 25 ميكروغرام من (PDL)، الوزن الجزيئي 70،000-150،000 دا، وذلك باستخدام 0.2 ميكرون تصفية العقيمة. إضافة 50 ميكرولتر من PDL إلى كل بئر من لوحة 96-جيدا زراعة الأنسجة (TC)، بما يضمن المغلفة أسفل بالتساوي، واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة.
   2. حل نضح PDL ويغسل مع 200 ميكرولتر من الماء المعقم.
   3. السماح لوحة في الهواء الجاف لمدة 2 ساعة قبل تخزين عند 4 درجات مئوية. ويمكن تخزين PDL لوحات المغلفة في 4 درجة مئوية لعدة أسابيع.
2. Trypsinization الخلايا HEK293S ملتصقة.
   1. تنمو HEK293S إلى 80٪ confluency في صحن 10 سم حافظت على 37 درجة مئوية مع 8٪ CO _2. وينبغي أن يكون واحد طبق 10 سم ما يقرب من 10 مليون خلية HEK293S. لا تستخدم الخلايا بعد 30 الممرات!
   2. وسائل الاعلام نضح ويغسل مع 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إضافة 1 مل من محلول التربسين-EDTA (0.25٪ التربسين، 0.02٪ EDTA) إلى الخلايا واحتضان لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   3. إضافة 10 مل من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) وResuspend الخلايا بواسطة pipetting مرارا صعودا وهبوطا باستخدام ماصة المصلية.
   4. ماصة 10 ميكرولتر من الخلايا وخلط مع 10 ميكرولتر من التريبان حل الأزرق (0.4٪). تحديد كثافة الخلايا باستخدام عدادة الكريات والمجهر الضوئي. لا تعول الخلايا التي يتم الملون الأزرق لأنها قد لقوا حتفهم. ضمان بقاء الخلية أعلى من 90٪.
3. بدقة و resuspend trypsinized HEK293S GnTI ^- الخلايا في DMEM تستكمل مع FBS 10٪ لكثافة 0.5 × 10 ⁶ خلية / مل في خزان ماصة للتصرف. وستكون هناك حاجة ما يقرب من 5 مليون خلية HEK293S لكل لوحة. ما مجموعه 24 يبني يمكن transfected على كل لوحة باستخدام هذه العلاقات العامةotocol.
4. باستخدام ماصة الأقنية، إضافة 100 ميكرولتر من خلايا لكل بئر من لوحة PDL المغلفة. Resuspend الخلايا في الخزان ماصة بعد ملء كل لوحة لضمان توزيع عادل للخلايا. احتضان الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 8٪ CO _2. بعد 24 ساعة، يجب أن خلايا تصل إلى ما يقرب من 80٪ confluency.
5. 1 ساعة قبل ترنسفكأيشن استبدال وسائل الإعلام. إعداد المجمعات كاشف الحمض النووي ترنسفكأيشن لترنسفكأيشن.
   1. لكل بناء في الخلفية سرت _TC ليتم عرضه، مزيج 450 الحمض النووي نانوغرام مع 45 ميكرولتر من DMEM المصل خالية وتخلط. إضافة 1.6 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن إلى 45 ميكرولتر من DMEM المصل خالية وتخلط.
   2. على الفور إضافة المخفف الحل ترنسفكأيشن الكاشف إلى حل الحمض النووي والمزيج. لا تخلط الحلول في ترتيب عكسي. انتظر 10-15 دقيقة، وإضافة 20 ميكرولتر من خليط ترنسفكأيشن الكاشف / الحمض النووي ل4 آبار.
6. مرة واحدة وقد تم transfected جميع الآبار، مزيج وحة من قبل هزاز بلطف الى الوراءالثانية ذهابا والعودة إلى الحاضنة 37 درجة مئوية.
7. بعد 16-24 ساعة تحل محل وسائل الاعلام مع DMEM المحتوية على مصل و 10 ملي الزبدات الصوديوم.
8. ما يقرب من 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن إزالة وسائل الإعلام وإما الشروع فورا مع صمود للحرارة الشاشة أو تجميد الخلايا في -80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق. ويمكن تخزين الخلايا عند -80 درجة مئوية لعدة أسابيع.

شاشة للحرارة على أساس القرب 2. التلألؤ مع S -citalopram

1. احتضان الخلايا مع -citalopram 200 نانومتر S في 25 ميكرولتر من TBS (تريس مخزنة المالحة - 20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8، 100 مم كلوريد الصوديوم) لمدة 5 دقائق على RT.
2. إذابة الخلايا عن طريق إضافة 25 ميكرولتر من 8 ملي ن دوديسيل-β-D-maltopyranoside (C12M)، 1 ملم الكوليسترول hemmisuccinate (كلية العلوم الصحية)، كوكتيل مثبط البروتياز (2 مم phenylmethanesulfonyl فلوريد (PMSF)، 0.1 ملغ / مل أبروتينين، 4 ز / مل pepstatin A، و 4 ميكروغرام / مل leupeptin) في TBS، واحتضان لمدة 1 ساعة على RT.
3. إضافة 50 ميكرولتر من TBS وايال 20 نانومتر ^[3 H] سيتالوبرام (81.7 تسى / ملمول)، 0.1٪ زلال المصل البقري، و 2 ملغ / مل صاحب العلامة تقارب التلألؤ قرب فحص (SPA) حبات لثلاثة آبار لكل بناء. لآخر أيضا إضافة نفس الحل المدرجة ولكن تكملة مع 100 سيرترالين ميكرومتر لتحديد ملزمة انوعي. تأكد من أن حبات صاحب العلامة تقارب SPA مختلطة تماما عند إضافة إلى لوحة 96-جيدا.
4. قياس ^[3 H] سيتالوبرام ملزمة باستخدام عداد التلألؤ 96-جيدا في RT مع وقت العد 1 دقيقة لكل بئر. مواصلة لوحات العد حتى هضبة العد الكلي (بعد حوالي 36 ساعة).
5. لوحات الحرارة لمدة 15 دقيقة في كتلة التدفئة مع غطاء ساخنة عند 33 درجة مئوية. قياس ^[3 H] سيتالوبرام ملزمة مرة أخرى بعد التسخين كما هو موضح في 2.4.
6. كرر الخطوة 2،4-2،5 وتغيير الخطوة التدفئة إلى 36 درجة مئوية، 39 درجة مئوية، 45 درجة مئوية، 48 درجة مئوية و 51 درجة مئوية. ضبط درجة حرارة التدفئة اعتمادا على درجة حرارة انصهار واضح (تيم)من البروتين الهدف وصمود للحرارة للبناء الأكثر استقرارا. مواصلة للحرارة لوحات حتى كل من يبني لها تهمة محددة منخفضة.
7. تحليل البيانات لتحديد القيم تيم.
   1. تحديد متوسط ​​مجموع التهم لكل دقيقة (CPM) من كل بناء للآبار التي لا تحتوي على سيرترالين عن طريق حساب متوسط ​​الآبار تكرار 3. تحديد الاجتماع التحضيري للمؤتمر غير محددة عن طريق حساب متوسط ​​التكلفة لكل ألف ظهور كل سيرترالين تحتوي على بئر في لوحة واحدة.
   2. حساب CPM محددة من خلال طرح الاجتماع التحضيري للمؤتمر غير محددة من إجمالي الاجتماع التحضيري للمؤتمر.
   3. حساب TM من نوبة غير الخطية إلى وظيفة السيني بولتزمان. يبني مع انخفاض الاجتماع التحضيري للمؤتمر محددة في RT (<10٪ من وزن) عموما لم يكن لديك قيم تيم دقيقة. الطفرات من معظم البنى بالحرارة ويمكن الجمع بين معا وفرزها لزيادة مضافة في صمود للحرارة.

3. التعبير عن الناقل السيروتونين الإنسان في HEK293S GnTI ^{- خلايا}

1. تحويل خلايا DH10Bac المختصة كيميائيا مع 1 نانوغرام البلازميد.
   1. إضافة البلازميد 50 ميكرولتر من خلايا DH10Bac واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
   2. خلايا DH10Bac الصدمة الحرارية في درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. إضافة 200 ميكرولتر من المتوسطة SOC واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات مع اهتزاز.
   3. لوحة كل من البكتيريا على طبق من ذهب لوريا مرق (LB) التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين، 7 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، 10 ميكروغرام / مل التتراسيكلين، 100 ميكروغرام / مل 5-برومو-3-indolyl β-D-galactopyranoside، و 40 ميكروغرام / مل الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
2. عزل lacZ ^- المستعمرات (المستعمرات البيضاء) نمت عند 37 درجة مئوية لمدة 2 د على لوحات أجار LB.
3. تنمو عدة مستعمرات O / N عند 37 درجة مئوية في 5 مل من LB تحتوي على مضادات حيوية وعزل الحمض النووي bacmid.
   1. تدور باستمرار البكتيريا في 1000 x ج في أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق. طاف تجاهل. بكتيريا و resuspend مع 200 ميكرولتر من miniprep صعازلة esuspension.
   2. البكتيريا ليز بإضافة 200 ميكرولتر من تحلل العازلة miniprep وعكس أنبوب بلطف 10 مرات. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة التعادل.
   3. إزالة جزء غير قابل للذوبان عن طريق الدوران في 14000 x ج لمدة 10 دقيقة في أجهزة الطرد المركزي. إضافة 1 مل من الأيزوبروبانول لطاف والبرد في -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لترسيب الحمض النووي.
   4. تدور في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة في أجهزة الطرد المركزي وتجاهل طاف.
   5. بيليه غسل ​​الحمض النووي مع 70٪ ETOH وتدور مرة أخرى في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة. طاف تجاهل. تبخرت الهواء الجاف الحمض النووي حتى كل ETOH وresuspend في 50 ميكرولتر من الماء.
      ملاحظة: يجب transfected Bacmid الحمض النووي في خلايا Sf9 على الفور حصول على أفضل النتائج ولكن يمكن أيضا أن يتم تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
4. bacmid Transfect الحمض النووي في الخلايا 1x10 ⁶ من ملتصقة Sf9 نمت في غرفة ترطيب في 27 درجة مئوية في صحن 6 جيدا. تنفيذ كافة التلاعب زراعة الخلايا في غطاء تدفق الصفحي العقيمة.
   <لى> إزالة وسائل الاعلام من الخلايا وإضافة 2 مل من وسائل الاعلام Sf9 جديدة. إضافة 5 ميكروغرام من الحمض النووي bacmid إلى 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام Sf9 (الحل A).
   1. إضافة 8 ميكرولتر من Sf9 ترنسفكأيشن كاشف الموجبة الدهون إلى 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام Sf9 (الحل B). احتضان الأنبوب الذي يحتوي الحل B لمدة 5 دقائق.
   2. مزيج الأنبوب الذي يحتوي الحل ومع الحل B واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة وإضافة كل من الحل لخلايا Sf9.
   3. بعد 96 ساعة، وطاف الحصاد (P1 فيروس) عن طريق تمرير من خلال مرشح 0.2 ميكرون. قد يتم تخزين الفيروس P1 لعدة أشهر في 4 درجات مئوية في الظلام وإعادة استخدامها لجعل الفيروس P2 حسب الحاجة.
5. إضافة 100 ميكرولتر من فيروس P1 إلى 1 لتر من خلايا Sf9 في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 ⁶ خلية / مل في وسائل الإعلام Sf9. تصيب الخلايا لمدة 96 ساعة، وتزايد في 27 درجة مئوية على شاكر في 100 دورة في الدقيقة.
6. تدور باستمرار خلايا في جهاز للطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 15 دقيقة، وطاف فلتر تحتوي على جزيئات الفيروس من خلال مرشح 0.2 ميكرون. تجاهل بيليه الخلية. Determكثافة الفيروسية المعهد الوطني للإحصاء باستخدام فحص اللوحة فيروسية أو عداد الفيروس. يجب أن تكون كثافة الفيروس الجسيمات> 1 × 10 ⁸ فيروس في كل ملليلتر. P2 الفيروس يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام، وتستخدم لعدة أشهر.
7. إصابة 10 لتر من HEK293S GnTI ^- خلايا ⁷ نموا في تعليق عند 37 درجة مئوية مع CO ₂ و 85٪ الرطوبة 8٪ على شاكر في 130 دورة في الدقيقة 293 وسائل الإعلام التعبير تستكمل مع 2٪ FBS في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 2 وكثافة 3 × 10 ⁶ خلية / مل، وعادة 30-50 مل من فيروس P2 في 800 مل من الخلايا في 2 لتر حير قارورة.
   ملاحظة: لا ينصح لاستخدام أكثر من 80 مل من فيروس P2 منذ HEK293S GnTI ^- الخلايا سوف تنمو ببطء ويمكن أن تصبح غير قابلة للحياة نتيجة لتغير في درجة الحموضة. Sf9 وسائل الاعلام هو أكثر حمضية من وسائل الإعلام 293 التعبير.
8. 12-16 ساعة بعد الإصابة، إضافة الزبدات الصوديوم إلى تركيز من 10 ملم من مخزون 1 م. 48-60 ساعة بعد الإصابة، وخلايا الحصاد بواسطة الطرد المركزي في4000 x ج لمدة 15 دقيقة. إزالة طاف.
9. Resuspend الخلايا في 150 مل من TBS، 2 ميكرومتر S -citalopram أو غيرها من مثبطات سرت ومخزن في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للتنقية.

4. تنقية تقارب من السيروتونين الناقل للتحصين وبلورة

1. ذوبان الجليد الخلايا من 10 لتر للثقافة في الماء الدافئ (حوالي 30 درجة مئوية) و resuspend عن طريق تمرير بسرعة من خلال ماصة 10 مل حتى متجانسة.
2. إعداد محلول تنظيف للذوبان (150 مل): 80 مم تريس، ودرجة الحموضة 8، 150 مم كلوريد الصوديوم التي تحتوي على 40 ملي C12M، 5 ملي كلية العلوم الصحية، ومثبط البروتياز كوكتيل.
3. إضافة كافة الخلايا إلى دورق مع بقضيب وإضافة كل من محلول تنظيف للخلايا مع التحريك. إذابة عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع التحريك.
4. تدور المحللة في 8000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل بيليه وطاف صب في أنابيب نابذة نظيفة. تدور في 100000 x ج لمدة 1 ساعة في ultracentrifuge. تجاهل بيليه ومرشح طاف من خلال مرشح 0.2 ميكرون.
5. تمرير المحللة أكثر من 10 مل من بكتيريا الراتنج تقارب معبأة في عمود باستخدام مضخة تحوي معايرتها في غسل العازلة: 1 ملم C12M، 0.2 ملي كلية العلوم الصحية، و 5٪ الجلسرين، 25 ميكرومتر الدهون (1-بالميتويل-2-oleoyl- التعطيل -glycero- 3-phosphocholine، 1-بالميتويل-2-oleoyl- التعطيل -glycero-3-phosphoethanolamine، و1-بالميتويل-2-oleoyl- التعطيل -glycero-3-phosphoglycerol في نسبة المولي 1: 1: 1)، و1 ميكرومتر S -citalopram أو SSRI في TBS.
6. ربط بكتيريا عمود النسب إلى السائل نظام البروتين سريع اللوني (FPLC) ويغسل عمود في 2 مل / دقيقة مع 66 مل (مجلدات 6.6 عمود) من غسل العازلة. أزل البروتين النقي في نفس عازلة تستكمل مع 5 ملي desthiobiotin عند 0.5 مل / دقيقة باستخدام 33 مل (مجلدات 3.3 عمود) من العازلة. جمع 1 كسور مل. سوف الكسور الذروة يكون ~ 10 مل. يمكن تخزين البروتين النقي في 4 درجة مئوية لمدة 2-3 د إذا رغبت في ذلك.
   ملاحظة: مجموع العائد تكون 3 -4 ملغ من _CC سرت و 1 ملغ من سرت _IC. والامتصاصية من 2 الاتحاد الافريقي في 280 نانومتر يساوي 1 ملغ / مل سرت.

5. إعادة تشكيل الناقل إلى الليبوزومات للتحصين

1. إعداد الجسيمات الشحمية التي تحتوي على asolectin: الكولسترول: الدهون A: الدماغ القطبي الدهون (60 نسبة المولي: 17: 3: 20). حل الدهون في 1 مل من الكلوروفورم وإضافة 40 ملغم من إجمالي الدهون إلى 100 مل زجاج قارورة أسفل جولة في نسبة المولي المشار إليها.
   1. تتبخر الكلوروفورم لا يقل عن 1 ساعة تحت فراغ مع الجزء السفلي قارورة الجولة الدورية في المياه الدافئة، ما يقرب من 30 درجة مئوية.
   2. ترطيب الدهون بإضافة 10 مل من TBS. احتضان العازلة لمدة 10 دقيقة.
   3. تجميد الدهون عن طريق وضع القارورة في السائل N _2.
   4. ذوبان. تزج أسفل كروية القارورة في كوب مملوء بالماء الدافئ، ما يقرب من 30 درجة مئوية. يصوتن في sonicator الحمام لمدة 5 دقائق.
   5. دوامة وتكرار الخطوات 5.1.3 - 5.1.4 10 مرات أو حتى الدهونهو معلق تماما من القاع ويشكل تعليق غائم.
   6. قذف خليط الدهن بأكمله مرتين خلال 200 مرشحات نانومتر. ستظهر الدهون وتعليق حليبي قبل قذف. بعد ذلك سيتم شفافة ذلك. لا تقم بإضافة خليط الدهن بأكمله إلى الطارد في آن واحد لأنها يمكن أن تنسد، مما أدى إلى فقدان العينة.
   7. تدور الدهون في 100000 x ج لمدة 20 دقيقة و resuspend في 0،5-1 مليلتر من TBS بتركيز 40 ملغ / مل.
2. التركيز النقي سرت _IC إلى 250-500 ميكرولتر باستخدام البروتين المكثف 100 كيلو دالتون MWCO أجهزة الطرد المركزي إلى 2-4 ملغ / مل وتشبع الجسيمات الشحمية مع 5 ملي C12M. إضافة سرت النقاء إلى المنظفات: خليط الدهون في 1 مل الحجم النهائي.
3. إزالة C12M بنسبة 3 إضافات متتالية من 80 ملغ / مل الراتنج امتصاص مسعور. لإضافات 2 الأولى، واحتضان مع الراتنج مع دوران لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية. إزالة الراتنج التي تمر عبر الصوف الزجاجي. أداء حضانة النهائية مع الراتنجبين عشية وضحاها.
4. التركيز proteoliposomes بواسطة الطرد المركزي في 100000 x ج لمدة 20 دقيقة. تجاهل بيليه طاف و resuspend في 250-500 ميكرولتر من TBS.
5. إضافة 10 ميكرومتر تركيز النهائي من S -citalopram للبروتين تشكيلها بعد إزالة النهائية من الراتنج.
6. إذابة 2.5 ميكرولتر من proteoliposomes في المخزن SDS-PAGE تحميل (62.5 ملي تريس، ودرجة الحموضة 6.8، 10٪ الجلسرين، 2٪ SDS، 0.01٪ برموفينول الأزرق، و 100 ملي DTT) وتعمل على هلام SDS-PAGE في 200 V ل1 وقد أعاد ساعة للتأكد من أن سرت بنجاح. ويمكن تخزين Proteoliposomes في -80 درجة مئوية في قسامات للتخزين على المدى الطويل وإذابة على الجليد قبل كل التحصين.

6. للكشف عن الأجسام المضادة إدراكا الحواتم 3D

1. خطوط الخلايا هجين الشاشة من خلال لطخة غربية. الأجسام المضادة التي تعترف سرت من قبل لطخة غربية على الأرجح ربط الحواتم خطية وعلى الأرجح لن تكون مفيدة للدراسات الهيكلية.
   1. مزيج 1 ميكروغرام من purifiإد سرت _IC أو _CC سرت وتعمل على 4-15٪ هلام SDS-PAGE في 200 V لمدة 1 ساعة.
   2. نقل إلى غشاء النيتروسليلوز في 200 مللي أمبير لمدة 30 دقيقة باستخدام عازلة Towbin (25 ملي تريس، 192 ملي الجلايسين، 20٪ (ت / ت) الميثانول، 0.1٪ SDS). الغشاء يمكن أن تجفف وتخزن إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة.
   3. غشاء Rewet مع 10٪ الميثانول، ويغسل مع برنامج تلفزيوني (10 ملي الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4 و 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل).
   4. منع مع الحليب المجفف بنسبة 5٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في RT.
   5. يغسل مع برنامج تلفزيوني واحتضان مع 1 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني مع الحليب بنسبة 0.1٪.
   6. غسل نطاق واسع مع برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.1٪ توين-20.
   7. احتضان مع الأجسام المضادة الماعز المضادة للماوس مترافق إلى صبغة الأشعة تحت الحمراء المخفف 1: 10،000 في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ توين 20 و الحليب بنسبة 0.1٪.
   8. غسل نطاق واسع والمسح الضوئي باستخدام نظام التصوير.
2. مزيج هجين طاف التي تحتوي على أجسام مضادة السلبية الغربية مع 100 نيوتن متر من البروتين سرت _CC باستخدام نسبة المولي 1: 2 (SERT: ماب) في 200 ميكرولتر TBS مع 1 ملم C12M، 0.2 ملي كلية العلوم الصحية، و 1 ميكرومتر S -citalopram. أجهزة الطرد المركزي في 100000 x ج لمدة 20 دقيقة. تحليل طاف تحتوي على مجمعات للسرت MAB وتحليل من قبل الإسفار للكشف عن حجم الاستبعاد اللوني (FSEC) ^8. تجاهل بيليه.
   1. تشغيل 100 ميكرولتر من طاف على عمود حجم الإقصاء عند 0.5 مل / دقيقة باستخدام عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) نظام مجهزة للكشف عن مضان (الإثارة: 480 نانومتر، والانبعاث: 510 نانومتر) باستخدام عازلة تشغيل تحتوي على TBS، 0.4 ملم لوريل غليكول neopentyl مالتوز، و1 ميكرومتر S -citalopram. والأجسام المضادة التي تشكل مجمعات يسبب البروتين GFP الانصهار إلى أزل في وقت سابق من نقل مجانية من عمود الحجم الاستبعاد.
   2. تمييع المجمعات إلى 10، 1، 0.1 نانومتر في 200 ميكرولتر TBS مع 1 ملم C12M، 0.2 ملي كلية العلوم الصحية، و 1 ميكرومتر S -citalopram والإعادة FSEC. الأجسام المضادة التي لا تزال تحول ذروة نقل بتركيزات منخفضة nanomolar هيتجليد تقارب عالية وجيدة المرشحين للدراسات الهيكلية.
3. إعادة اختبار ملزمة من قبل FSEC في وجود 1 ملي السيروتونين. والأجسام المضادة التي تعترف تحديدا التشكل SSRI ملزمة لا يلزم في وجود الركيزة. والأجسام المضادة التي تعترف حاتمة 3D الذي لا يتغير نتيجة التشكل ربط بغض النظر عن يجند الحاضر.
4. خلط تركيبات مختلفة البشرى من الأجسام المضادة واختبار ملزمة من قبل FSEC. والأجسام المضادة التي تعترف الحواتم متميزة يسبب سرت إلى أزل في وقت سابق عند دمجها معا مقارنة ملزمة من الأجسام المضادة واحد.
5. للدراسات الهيكلية الأولية، وحدد أعلى الأجسام المضادة التي تعترف تقارب الحواتم 3D.

7. التعبير عن الأجسام المضادة جزء في خلايا Sf9

1. المجالات متغيرة وثابتة استنساخ من فاب بواسطة PCR في النظام التعبير الحشرات للتعبير في خلايا Sf9 باستخدام البروتوكولات القياسية.
2. Transfect 1 × 1 0 ⁶ خلايا Sf9 مع 5 ميكروغرام من الحمض النووي Bacmid ترميز الخفيفة والثقيلة سلاسل من 8B6 فاب 8-صاحب الكلمات الدلالية مع تسلسل إفراز GP67 (كما في القسم 3.4).
3. حصاد P1 فيروس 96 ساعة posttransfection وإضافة 500 ميكرولتر من فيروس P1 إلى 1 لتر من خلايا Sf9 في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 ⁶ خلية / مل في قارورة 2 لتر لجعل الفيروس P2. إصابة الخلايا لمدة 96 ساعة عند 27 درجة مئوية.
4. حصاد P2 فيروس (كما في القسم 3.6).
5. إصابة 6 L من خلايا Sf9 في مناطق ذات كثافة من 2-3 × 10 ⁶ خلية / مل مع وزارة الداخلية من 2 بفيروس P2، وعادة 40-50 مل لكل قارورة مع 1 لتر من خلايا Sf9 في كل قارورة 2 لتر.
6. حصاد الخلايا ما يقرب من 96 ساعة بعد العدوى. إضافة 50 مل من العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 8 بتركيز نهائي من 50 ملم إلى الخلايا وتدور في 4000 x ج لمدة 20 دقيقة. تجاهل بيليه الخلية ومرشح طاف من خلال خلية تدفق عرضية 0.2 ميكرون فلتر. جمع طاف وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام إذا رغبت في ذلك.

> 8. تنقية الجسم المضاد شظايا من Sf9 طاف

1. التركيز Sf9 طاف باستخدام 30 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قص إيقاف (MWCO) خلية تدفق عرضية إلى ما يقرب من 400-800 مل.
2. إضافة ايميدازول، ودرجة الحموضة 8 بتركيز نهائي من 10 ملم و 10 مل من راتنج تقارب صاحب العلامة. ضجة في كوب لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
3. جمع صاحب العلامة راتنج تقارب بواسطة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق. طاف تجاهل.
4. حزمة الراتنج تقارب صاحب العلامة في عمود واتصال FPLC.
5. يغسل صاحب العلامة راتنج تقارب في 2 مل / دقيقة مع 66 مل (مجلدات 6.6 عمود) من 50 ملي الفوسفات ودرجة الحموضة 8، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 25 ملي ايميدازول.
6. أزل 8B6 فاب في 33 مل من 50 ملي الفوسفات ودرجة الحموضة 8، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 250 ملي ايميدازول. جمع 1 كسور مل.
7. تمييع تقارب تنقية فاب بحجم 10 أضعاف من الجليد الباردة خلات 20 ملم، ودرجة الحموضة 5.
8. ربط فاب لمل عمود تبادل الأيونات الموجبة 1 باستخدام مضخة تحوي في 1 مل / دقيقة.
9. منفصل فاب باستخدام 30 مل لينالتدرج الأذن من كلوريد الصوديوم (0-500 ملم) في 20 ملي خلات درجة الحموضة 5.5 باستخدام FPLC. سوف فاب أزل باعتبارها ذروة واحدة في ~ 300 مم كلوريد الصوديوم.
10. تحليل على 12.5٪ هلام SDS-PAGE باستخدام عينة العازلة التي تحتوي على 100 ملي DTT. وقيوده الثقيلة والخفيفة من 8B6 فاب تشغيل في 27 و 25 كيلو دالتون، على التوالي، على الحد من هلام SDS-PAGE.
11. كسور بركة تحتوي على فاب والتركيز على ما لا يقل عن 10 - 15 ملغ / مل باستخدام 30 كيلو دالتون MWCO المكثف البروتين في الدلو المتأرجح أجهزة الطرد المركزي في 3000 ز س.
12. ضبط درجة الحموضة إلى 8 بإضافة 1 M تريس الرقم الهيدروجيني 8 إلى تركيز النهائي من 50 ملم ومخزن تنقية فاب على المدى الطويل في 4 درجات مئوية. وسيبلغ اجمالي العائد يكون 25 - 30 ملغ. والامتصاصية من 1،4 الاتحاد الافريقي في 280 نانومتر يساوي 1 ملغ / مل من 8B6 فاب.

9. تشكيل مجمعات، الناقل الأجسام المضادة والفصل حسب الحجم الاستبعاد اللوني

1. لتبلور، وتنقية _CC سرت من قبل بكتيريا تقارب اللوني في C12M كما هو موضح سابقا (القسم 4).
2. دايجست مع الثرومبين لإزالة العلامات (1: 100 ث / ث) وEndoH (01:10 ث / ث) O / N في RT. التركيز على 250-300 ميكرولتر باستخدام 100 كيلو دالتون MWCO البروتين الطرد المركزي المكثف إلى تركيز البروتين من 10 ملغ / مل.
3. مزيج سرت المركزة مع فاب في نسبة المولي 1: 1.2 في حجم أقل من 500 ميليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 100000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. جمع طاف تحتوي على مجمع سرت-فاب. بيليه تجاهل.
4. منفصلة من قبل اللوني الحجم الاستبعاد (SEC) باستخدام FPLC على عمود حجم الإقصاء معايرتها في TBS تستكمل مع 40 ملي ن الأوكتيل-β-D-مالتوزيد (C8M)، و 0.5 ملي كلية العلوم الصحية، و 5٪ الجلسرين، 25 ميكرومتر الدهون (نفس في الخطوة 4.5)، و 1 ميكرومتر S -citalopram عند 0.5 مل / دقيقة.
5. جمع 0.5 كسور مل وتحليل على 4-15٪ والمواد الهلامية SDS-PAGE فضلا عن مضان التربتوفان بواسطة المجلس الأعلى للتعليم. GFP الموسومة سوف سرت تشغيل في حوالي 80 كيلو دالتون على هلام SDS-PAGE. بعد إزالة ترميني والسكريات مرتبطة N سيتم تشغيله في بروتين 45 كيلو دالتون.
6. DETErmine التي الكسور إلى الجمع عن طريق تجميع فقط الكسور التي هي monodisperse والحكم عليها من خلال تحليل الكسور التي كتبها مضان التربتوفان المجلس الأعلى للتعليم (الإثارة: 280، الانبعاثات: 335 نانومتر).
7. متجر تنقية مجمع سرت-8B6 في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع.

10. بلورة مجمعات، الناقل الأجسام المضادة التي كتبها معلق قطرة

1. قبل تبلور، والتركيز الكسور الذروة من فصل المجلس الأعلى للتعليم لمجمع سرت-8B6 إلى 2 ملغ / مل باستخدام 100 كيلو دالتون MWCO البروتين الطرد المركزي المكثف. والامتصاصية من 2 الاتحاد الافريقي في 280 نانومتر يساوي 1 ملغ / مل.
2. إضافة إضافي فاب في نسبة 1: 0.05 مجمع: حر فاب. إضافة 10 ميكرومتر مجانا S -citalopram.
3. أجهزة الطرد المركزي في 100000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. جمع طاف يحتوي على مجمع سرت القوات المسلحة البوروندية. بيليه تجاهل.
4. انشاء انخفاض شنقا الشاشة 24-جيدا في 4 درجات مئوية وفقا للجدول 1. تنمو بلورات ذات جودة الحيود حول الحلول الخزانتحتوي على 100 ملي تريس، هيدروكسيد الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.5، 25-125 ملم بوكل، 32،5 حتي 34٪ PEG 400، و 0.5٪ حمض 6 aminohexanoic.
   ملاحظة: استخدام تريس تعديلها مع هيدروكسيد الصوديوم لدرجة الحموضة 8.5 كمنطقة عازلة. لا تستخدم قاعدة تريس تعديلها مع حمض الهيدروكلوريك. ويمكن إعداد شاشة في 2 مل أنابيب وتستخدم حتى الانتهاء. احرص على ماصة بدقة PEG 400 باستخدام ماصة الإزاحة الإيجابية كما هو لزج للغاية!
   1. ماصة 500 ميكرولتر من كل حل خزان في الانظار 24-جيدا لوحة مع تسرب تطبيقها على كل بئر. ماصة 1.5، 1.75، و 2 ميكرولتر من مجمع سرت-8B6 على مدة 18 ملم الزجاج siliconized وانزلاق الغطاء. ماصة 1 ميكرولتر من محلول المكمن على رأس عينة البروتين.
      ملاحظة: تم شراء لوحة مع تسرب تطبيقها بالفعل إلى حافة الآبار.
   2. تطبيق غطاء الشريحة إلى جانب 24 مع قطرات التي تواجه حل خزان وختم على الفور عن طريق الضغط على زلة تغطية على تسرب قبل تطبيقه على كل بئر.
   3. يستمر إلى أن يتم تعيين كافة الآبار 24 حتى.
   4. ترك لوحة الجاهزة في غرفة معزولة جيدا في 4 درجات مئوية. لا تخل لوحات لمدة 3 أيام على الأقل
      ملاحظة: سوف تظهر البلورات واحدة في حوالي 3 أيام، وتنمو إلى 100-175 ميكرون بعد 14 يوما.
5. بلورات الحصاد في cryoloops ومباشرة فلاش بارد في السائل N ₂ قبل جمع البيانات حيود الأشعة السينية.
6. إذا لزم الأمر، والعثور على شروط بلورة إضافية عن طريق فحص واسع مع شنقا قطرات. استخدام ثلاث قطرات من البروتين: نسب مرسب من 2: 1، 1.5: 1، 1: 1. إذا كان الروبوت هو متاح، ثم إعداد 100-150 NL يسقط أكثر من 70 ميكرولتر من محلول الخزان في لوحة 96-جيدا. أكبر بلورات 3D يمكن زراعتها في 24 بئرا.
7. يسجل على أساس مظهر من الانخفاض: 0، واضحة. 1 والغبار. 2، راسب الحبيبية. 3، مرحلة الانفصال. 4، الجريزوفولفين. 5، والإبر. 6، لوحات، 7، بلورات 3D.
8. إعداد بلورة شنقا أساليب انخفاض في 24 بئرا كما هو موضح أعلاه حول كوند التي تم تشخيصها حديثاitions.

النتائج

تم إنشاء مكتبة من المسوخ نقطة واحدة في الخلفية سرت _TC على الشاشة لthermostabilizing الطفرات. تم إنشاؤها المسوخ الفردية باستخدام الطفرات القياسية. بروتوكول فحص يستخدم transfected عابر الخلايا HEK293S وشاشة للحرارة على أساس القرب-التلألؤ لبسرعة هوية الطفرات مفيدة لبلورة كما هو مبين في الشكل 1A. القيم التآمر تيم مقابل ملزمة ^[3 H] سيتالوبرام في RT يكشف يبني مع صمود للحرارة العالية والتعبير مستويات مناسبة لتنقية البروتين (الشكل 1B). تم دمج ثلاث طفرات (Y110A، I291A، وT439S) لإنشاء بناء مستقر للغاية (الشكل 1C). ويرتبط صمود للحرارة أيضا مع زيادة الاستقرار في المنظفات سلسلة قصيرة اللازمة لبلورة مجمع سرت-فاب.

التعبير على نطاق واسع من سرت الإنسان باستخدام الفيروسة العصوية-TRansduced HEK293S GnTI ^- يمكن أن الخلايا تأخذ أقل من 2 أسابيع، ويمكن أن تنتج كميات مليغرام، كما هو موضح في الشكل 2A. استخدام البروتين سرت _CC-GFP الموسومة يسمح سرت الواجب اتباعها بشكل ملائم خلال التعبير وتنقية من قبل مضان (الشكل 2B). تضمنت استراتيجية تنقية لدينا 1) الإذابة من سرت متجهة إلى S -citalopram من HEK293S GnTI ^- الخلايا في C12M في وجود كلية العلوم الصحية كما الدهن استقرار. 2) ملزمة من سرت إلى تقارب مصفوفة بكتيريا. 3) إزالة البروتينات الملوث عن طريق الغسيل واسعة النطاق. و4) شطف من سرت وظيفية مع العازلة التي تحتوي على desthiobiotin (الشكل 2C). بروتين مزال هو حر إلى حد كبير من البروتينات التي يمكن اكتشافها أخرى Coomassie تلطيخ الأزرق وmonodisperse كما تقرره FSEC (الشكل 2D، E).

أجري استراتيجية مماثلة لتنقية سرت مع علامة بكتيريا الثاني الذي كان يستخدم لreconstitutioن والتحصين (الشكل 3A، B). إدماج سرت في proteoliposomes يعزز مصل نصف الحياة والاستقرار في سرت ويحسن من احتمال عزل الأجسام المضادة عالية تقارب. وعلاوة على ذلك، إدراج الدهون A، مكون من جدار الخلية البكتيرية، بمثابة مساعد قوية ^9. وبإضافة عازلة لخليط الدهن المجفف في أنابيب زجاجية أعدت الجسيمات الشحمية الصفاحات ومعلق في المخزن. قذف من الجسيمات الشحمية من خلال 200 نانومتر الفلاتر حجم المسام تنتج monodisperse تعليق liposomal unilamellar. ثم يتم المشبعة في الجسيمات الشحمية مع المنظفات تليها إضافة سرت النقاء في صناعة المنظفات. وأخيرا، يتم إزالة المنظفات بإضافة الراتنج امتصاص مسعور إلى الدهون: خليط مواد التنظيف. وينبغي أن يضاف يجند إضافي لعينة تشكيلها لتحديد الأجسام المضادة التي تعترف التشكل ملزمة المضادة للاكتئاب. وجود سرت في proteoliposomes ينبغي تأكيد من قبلالانحلال عينة صغيرة مع صبغ SDS-PAGE التحميل أو C12M وتعمل على SDS-PAGE وFSEC (الشكل 3C، D).

خطوط الخلايا هجين التعبير عن الأجسام المضادة سرت ويمكن فحص لدنة عالية تقارب التي تعترف الحواتم 3D. هذه الخصائص هي حاسمة لنجاح في نهاية المطاف التبلور، حيث أن الأجسام المضادة يجب أن تبقى ملتزمة بحزم إلى منطقة منظم لتعزيز التعبئة الكريستال متجانسة، المجالات امر جيد. في الخطوة الأولى، ويتم تحديد الأجسام المضادة التي تعترف المناطق غير المنظمة. سرت هو التشويه والتحريف ونشف على غشاء النيتروسليلوز. والأجسام المضادة التي تربط سرت التشويه والتحريف تكون إيجابية الغربي، ومن المرجح يعترف الحواتم الخطية. في الشكل 4A، وتبين لنا 2 أمثلة من الأجسام المضادة التي تكون إيجابية الغربية وعلى الأرجح ليس من المفيد تشجيع crystallogenesis. في الشكل 4B، يتم تحضين ما تبقى من الأجسام المضادة غرب سلبية مع 100 نيوتن متر سرت-GFP ومفصولةFSEC. الأجسام المضادة التي تربط سوف سرت تحويل ذروة GFP إيجابية إلى الموقف السابق. قد تضعف مجمعات للسرت الضد من ذلك في المنظفات لتحديد ما إذا كانت يمكن أن تربط مع تقارب nanomolar تليها التحليل FSEC. علاوة على ذلك النتائج السيروتونين في التغييرات متعلق بتكوين في نقل وبالتالي الأجسام المضادة يمكن rescreened لتحديد ما اذا كان بامكانهم التعرف على وجه التحديد التشكل متجهة الى SSRI. في الشكل 4C، وتظهر الأجسام المضادة لربط سرت في وجود مادة السيروتونين، وتبين أن حاتمة (ق) لا تتغير من SSRI إلى الركيزة الدولة ملزمة. وأخيرا، في الشكل 4D يتم اختبار مجموعات من الأجسام المضادة لقدرتها على ربط الحواتم متميزة، مما أدى إلى التحول اليساري آخر. هنا 15B8 أو 8A11 الأجسام المضادة الاعتراف حاتمة الذي يختلف عن 8B6.

وقد تم اختيار الأجسام المضادة 8B6 لمزيد من التحليل الهيكلي على أساس فحص الكريستال مبدئي مع trea غراءتيد فاب. تم استنساخ جينات 8B6 فاب إلى ناقلات التعبير خلية الحشرات. فاب يمكن التعبير عن ويفرز من خلايا Sf9 نموا في تعليق. و8B6 فاب يمكن تنقيته من Sf9 خلية طاف صاحب العلامة تقارب (الشكل 5A، B) وتبادل الأيونات الموجبة اللوني (الشكل 5C، D) مما أدى إلى البروتين الذي يبدو خاليا من الملوثات في المواد الهلامية SDS-PAGE. في الشكل 5E، يظهر فاب المؤتلف 8B6 لربط سرت، ويستخدم في التجارب الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية لاحقة.

يتم هضم تقارب تنقية سرت _CC مع الثرومبين وEndoH ومختلطة مع 8B6 فاب لتشكيل مجمع بحضور S -citalopram. ثم يتم فصل مجمع نقل الأجسام المضادة من قبل المجلس الأعلى للتعليم في C8M (الشكل 6A) والكسور ذروة يحتوي كلا سرت وفاب كما هو مبين من قبل SDS-PAGE (الشكل 6B). استخدام C8M هو أمر حاسم لتشكيل الكريستال ربما لالمنظفات قصيرة السلسلة يسمح التعبئة أفضل بين الجزيئات في شعرية الكريستال. يعمل FSEC لتحديد أي كسور يجب أن تكون مجمعة لبلورة (الشكل 6C)؛ الكسور التي لا monodisperse و / أو تحتوي على كميات كبيرة من سرت مجانية أو فاب لا ينبغي أن تكون مجتمعة.

منشور على شكل بلورات سرت الأجسام المضادة يمكن أن تنمو في وجود S -citalopram باستخدام هذا البروتوكول شنقا نشر انخفاض بخار (7A الشكل). البلورات الناتجة حيد الضوء والأشعة السينية لقرار من 3.15 Å ¹⁰ (7B الشكل).

الشكل 1: التلألؤ للحرارة الفحص والقرب المستندة. نظرة عامة على بروتوكول لفحص للحرارة في وجود ^[3 H] سيتالوبرام. ب. أقصى ملزمة ^[3 H] سيتالوبرام مقابل درجة حرارة انصهار واضحة (TM). تمثل الخطوط المنقطة القيم لنقل WT. وصفت المسوخ الأكثر بالحرارة 3. وتمثل منطقة رمادية المسوخ التي لديها أقل من 10٪ من سيتالوبرام ^[3 H] نسبة إلى WT والقيم تيم بالتالي غير دقيقة ملزم بسبب انخفاض إشارة إلى الضوضاء. C. منحنيات للحرارة لWT سرت _TC وأعلى 3 المسوخ. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (SD). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: نظرة عامة على الثدييات مغاير البروتين التعبير و. نظرة عامة Schematized توليد فيروس BacMam والتعبير من سرت في HEK293S GnTI ^- الخلايا البائية. سعادةK293S GnTI ^- خلايا معربا عن سرت _CC (GFP مضان) C. الملف الشخصي شطف من _CC سرت على راتنج تقارب بكتيريا. يمثل أثر الأخضر تركيز desthiobiotin، 0-100٪ (0-5 ملم) D. تحليل تقارب تنقية سرت _CC على 4 - جل 15٪ SDS-PAGE E. FSEC من تقارب _CC سرت النقاء الكشف عنها بواسطة GFP مضان (الإثارة: 480 نانومتر. الانبعاث: 510 نانومتر). ذروة يبلغ حجمه 15 مل هي سرت (#) و 18 مل هو GFP مجانا (*). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): الممثل الانجذاب تنقية وإعادة إعماره من سرت _IC و. نظرة عامة التخطيطي لتوليد الأجسام المضادة. <قوي> B. لاحظ التعريف شطف عند 280 نانومتر لتنقية تقارب من سرت _IC على راتنج تقارب بكتيريا. يمثل أثر الأخضر تركيز desthiobiotin، 0-100٪. (0-5 ملم) C. تحليل تقارب تنقية وإعادة تشكيل سرت على 4 - جل 15٪ SDS-PAGE D. FSEC من سرت بالفاعلات التالية إعادة. تم استخدام مضان من بقايا التربتوفان للكشف سرت (الإثارة: 280 نانومتر. الانبعاث: 335 نانومتر). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تحليل الممثل سرت الأجسام المضادة A. فحص الأجسام المضادة التي كتبها لطخة غربية. تم تطبيق ما يقرب من 1 ميكروغرام من _CC سرت مع أو بدون GFP إلى 4-15٪ SDS-هلام PAGE ونشف على غشاء النيتروسليلوز. تم الكشف عن ملزم باستخدام الأجسام المضادة الماعز المضادة للماوس مترافق إلى الأشعة تحت الحمراء صبغ. 2G4 و10F2 هي الغربي الإيجابي. ب. ملزمة من الأجسام المضادة إلى 100 نانومتر سرت الموسومة GFP والكشف عن طريق FSEC الكشف باستخدام GFP مضان. C. تجليد فابز المحدد إلى 100 نانومتر سرت GFP الموسومة في وجود 1 ملي السيروتونين. د. تجليد 8A11 أو 15B8 فابز إلى سرت-8B6 فاب. قمم صغيرة يبلغ حجمه في 18 مل هي GFP مجانا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5: تنقية التمثيلية لل8B6 فاب من خلايا Sf9 و. لاحظ التعريف شطف عند 280 نانومتر لتنقية 8B6 فاب صاحب العلامة تقارب chromatograp اتش واى. يمثل أثر الأخضر تركيز إميدازول 0-50٪ (0-250 ملم) ب. غير الحد والحد من هلام SDS-PAGE بعد تنقية تقارب صاحب العلامة. البروتين الذي يمتد نحو 50 كيلو دالتون غير قابلة للتخفيض فاب (#) والأنواع الثانوية في 25 يتم تقليل كيلو دالتون فاب (*). C. لاحظ التعريف شطف عند 280 نانومتر لتنقية 8B6 فاب عن طريق تبادل الأيونات الموجبة التي تظهر ذروة متناظرة واحدة التي elutes تحت الانحدار الخطي كلوريد الصوديوم. يمثل أثر الأخضر تركيز كلوريد الصوديوم، 0 - 100٪. (0-500 ملم) D. تحليل 8B6 فاب على 12.5٪ هلام SDS-PAGE التالية تنقية عن طريق تبادل الأيونات الموجبة. E. ملزمة لل8B6 فاب إلى 10 نانومتر سرت الموسومة GFP، الكشف عن استخدام مضان GFP. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ه 6 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg "/>
الشكل 6: ممثل جل الترشيح اللوني للمجمع سرت-8B6 في وجود S -citalopram و. جل الشخصي الترشيح شطف من تنقية مجمع سرت-8B6. ذروة الرئيسي يبلغ حجمه عند 11.5 مل هو مجمع سرت-8B6. الذروة في 15-17 مل تحتوي GFP وفاب B. تحليل مجمع سرت-8B6 النقي على 4-15٪ هلام SDS-PAGE. وتظهر مواقف سرت وقيوده الثقيلة والخفيفة من فاب من قبل شرطة. C. FSEC من الكسور مفصولة الحجم. تم الكشف عن المجمعات سرت-8B6 باستخدام مضان التربتوفان. جزء 17 يحتوي على كمية أكبر من سرت التي لم معقدة مع فاب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7: بلورة مجمع سرت-8B6 ملزمة لS -citalopram و. المجهر الضوئي من متوازي شكل بلورات من مجمع سرت-8B6 بعد 2 أسابيع من النمو. شريط مقياس يساوي 200 ميكرون. ب. بلورات سرت-8B6 حيد الضوء والأشعة السينية إلى 3.15 Å. وتمثل حلقة زرقاء 3.15 Å. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: شاشة بلورة لمجمع سرت-8B6 ملزمة لS -citalopram الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الجدول.

Discussion

يبقى تحديد بنية البروتين الغشاء من خلال تقنيات فيزيائية حيوية مهمة شاقة بالنسبة للعديد من شركات النقل الهامة طبيا، المستقبلات، وقنوات ^11. نحن هنا تبادل الخبرات مفصلة وضعت لتحديد هيكل نقل السيروتونين الإنسان ملزمة لS -citalopram. ونحن نتوقع أن هذه الطرق ستكون مفيدة لتحديد هياكل سرت في الدول بتكوين الأخرى، فضلا عن هياكل للبروتينات غشاء الصعبة الأخرى. وعلاوة على ذلك، التقنيات الحيوية الموصوفة هنا يمكن أيضا أن تستخدم لدراسة وظيفة من سرت النقاء في صناعة المنظفات والبيئة الدهون شبه مواطن.

سرت بلورة يتوقف على تطوير العديد من الأدوات والتقنيات. أولا، أنتجت تحسينات في صمود للحرارة نقل المتغيرات سرت التي كانت تصرف بشكل جيد في مختلف المذيلات المنظفات التالية استخراج نقل من الأغشية ^6. الثاني، واستخداممن -citalopram يجند S عالية تقارب في جميع أنحاء تنقية وبلورة مزيد من تحسين الاستقرار والحد من عدم التجانس بتكوين. ثالثا، تطوير نظام التعبير BacMam ⁷ سمح لإنتاج كميات كبيرة من سرت في فترة قصيرة من 2 أسابيع، مما يسهل على حد سواء التحصين والتبلور. وأخيرا، وضع استراتيجيات لتحديد الأجسام المضادة عالية تقارب التي تعترف 3D الحواتم يسمح لاكتشاف الأجسام المضادة 8B6 الذي يعزز التعبئة امر جيد للمجمعات للسرت الأجسام المضادة إلى بلورات.

وهناك عدد من الخطوات والكواشف الحيوية فضلا عن المشاكل الشائعة التي غالبا ما تحدث في جميع أنحاء البروتوكول. أولا، جيل من ارتفاع عيار سرت P2 الفيروس يمكن أن يكون مشكلة. مضيفا تركيزات منخفضة من الفيروس P1 لتوليد فيروس P2 كما هو موضح في هذا البروتوكول عادة ما يخفف من هذه المشكلة، وفي الحالات التي يكون فيها عيار الفيروس P2 منخفضة، P3 الفيروس يمكن أن تدلي النقيبز الفيروس في وزارة الداخلية من 0.0001. الفيروسات مع عيار أقل من 1 × 10 ⁸ جزيئات الفيروس / مل لا ينبغي ان تستخدم وسوف تؤدي دائما تقريبا في غلة البروتين منخفضة. للتعبير، HEK293S GnTI ^- تم اختيار الخلايا لأنها تفتقر إلى N -acetylglucosaminyltransferase أنا النشاط، وبالتالي لا يمكن توليف -glycans N مجمع، بدلا تنتج فقط عالية المانوز N -glycans. يشق EndoH N -linked بالغليكوزيل من glycans المانوز عالية في موقعين في حلقة خارج الخلية 2 (EL2)، مما أسفر عن -acetylglucosamine N تعلق على الهليونين. هضم N -linked السكريات تقلل الكون سطح EL2 التي من المرجح مهمة لبلورة. لتوليد الأجسام المضادة، وسرت _IC ينبغي أن تستخدم للتحصين. GFP هو مناعة عالية ^12، وينبغي ألا تستخدم كعلامة الانصهار لتوليد الأجسام المضادة لأنه من الصعب تماما لإزالة من قبل المجلس الأعلى للتعليم. كانت N- مرنة وC-محطة من سرت أيضا لاالمدرجة في بناء من أجل تجنب الأجسام المضادة ضد هذه المناطق. الفئران يمكن تحصين مع 30 ميكروغرام من البروتين أعيد تشكيلها. تواصل الفئران تحصين حتى يمكن الكشف عن تركيزات عالية من المصل من الأجسام المضادة وخلايا إنتاج هجين كما هو موضح ^13. وبناء thermostabilized عادة ما يكون الخيار الأفضل للتحصين. إذا كان الناقل هو حسن تصرف ويحتفظ النشاط البيولوجي التالية تنقية، وهذا غالبا ما يكون كافيا لرفع الأجسام المضادة. تم رفع الأجسام المضادة 8B6 ضد WT سرت. لتبلور، إلا أن الكسور الذروة من المجلس الأعلى للتعليم التي تحتوي على مجمع monodisperse كما تقرره FSEC ينبغي الجمع بين والمركزة. تنمو بلورات سرت-8B6 في نطاق ضيق من الظروف، وهناك عدد من الخطوات التي ينبغي اتخاذها لاستكشاف مشكلات تتعلق على وجه التحديد نمو سرت وضوح الشمس. تريس قاعدة تعديلها مع حمض الهيدروكلوريك لا ينبغي أن تستخدم في خزان حل، لأن هذا المخزن لا يدعم نمو البلورات. بالتالي فمن صرخةtical بدلا من ذلك استخدام تريس تعديلها مع هيدروكسيد الصوديوم. تنمو بلورات سرت في نطاق التركيز الضيق من PEG 400، حتى إذا بلورات لا تنمو أو إذا لوحظ العديد من بلورات صغيرة، وحتى زيادة طفيفة أو نقصان في تركيز PEG 400 سيتم نصح. وعلاوة على ذلك، تم استخدام حمض مضافة 6 aminohexanoic أيضا في الشاشة الأمثل لتحسين التنوي. نسبة انخفاض البروتين: حل جيد هو أيضا مفتاح تحديد عامل للنمو وضوح الشمس. إسقاط نسب 1،5-2: 1 ينصح، مع نسب انخفاض أقرب إلى 2: 1 دعم عادة نمو أكبر بلورات 3-الأبعاد. وأخيرا، واستخدام الانظار 24 لوحات جيدا أيضا حاسما نحو النمو وضوح الشمس، ويفترض بسبب تعديل معدل انتشار البخار.

وقد تم تطوير نهج بديل لطريقة SPA للكشف عن المسوخ التي استقرار نقل الفئران السيروتونين في التشكل محددة الكوكايين باستخدام فلتر فحص ⁵ ملزمة. على النقيض من ذلك، وبا SPAفحص سد يسمح لاتخاذ خطوات متتابعة التدفئة التالية تحديد جزء من سرت التي لا تزال ملزمة ليجند. وهكذا، وهذا أتاح الفرصة للتعرف السريع لدرجة حرارة انصهار من عدد قليل من العينات. يعتمد أسلوب SPA على توافر رديولبلد يجند عالية تقارب وإذا لم يعرف بروابط التي تربط مع تقارب submicromolar ثم سوف نهج بديل يكون ضروريا. وتستخدم العديد من الطرق الأخرى الشائعة لقياس استقرار البروتين مثل ملزم من الأصباغ الفلورية والكالوري ¹⁴ ولكنها منخفضة الإنتاجية وإما أن تكون غير قادر على قياس وظيفة مباشرة أو تتطلب كميات كبيرة من البروتين. إذا لا يمكن استخدام أسلوب SPA، النهج الإنتاجية العالية بديل واحد هو صمود للحرارة الفحص القائمة على FSEC ¹⁵ (FSEC-TS)، حيث يتم تسخين تليها العينة انفصال جزء من ما تبقى نقل. FSEC-TS هو نهج مفيد للوصول إلى السلوك الكروماتوغرافي والدولة بلازميدة قليلة القسيمات وغير ا ف بأداة مكملة owerful التي يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع طريقة SPA.

تم العثور على المقارنة بين مختلف النظم بروتين تعبير شائع أيضا إلى تفضيل استخدام خلايا الثدييات لسرت التعبير ¹⁶ و لا غرابة في هذا هو الحال بالنسبة للعديد من البروتينات من أصل الثدييات احتمالا. وقد جرى تصميم طرق التي لدينا وتستخدم للتعبير عن سرت ولكن هم على الأرجح أكثر قابلية للتكيف. الظروف التي تشجع على مستويات عالية من التعبير يجب أن توضع بعناية من خلال تغيير الوقت من التعبير، ودرجة الحرارة، وتركيز الفيروس، وجود مثبطات هيستون deacetylase مثل الزبدات الصوديوم.

ونحن نفضل عموما تنقية تقارب في المنظفات سلسلة طويلة خفيفة مثل C12M جنبا إلى جنب مع كلية العلوم الصحية قبل إعادة للاحتفاظ عالية تقارب يجند ملزمة. إعادة استخدام امتصاص مسعور هي تقنية خفيفة والتي وجدنا أن تكون فعالة لعدة شركات النقل ومستقبلات أخرى. اذا هذاغير ناجح، وإزالة المنظفات مع تركيزات عالية مذيلة الحرجة من غسيل الكلى، والتخفيف، أو المجلس الأعلى للتعليم ويمكن استخدام ¹⁷ المقدمة للمستضد مستقرة بما فيه الكفاية في مثل هذه المنظفات. في الحالات التي لم يتم العثور على أجسام مضادة مناسبة، ونحن دائما تقريبا تجد من المقرر أن فقدان وظيفة أو تمسخ للمستضد هذه القضية، وفي مثل هذه الحالات أجرينا بنجاح التطعيمات الجديدة مع إيلاء اهتمام خاص إلى الكيمياء الحيوية البروتين. وأخيرا، ينبغي بروابط والأجسام المضادة التي تربط مع عالية تقارب تشكل الأساس لتجربة بلورة المخطط لها بعقلانية ومن خلال الاستفادة من البديل بالحرارة، يمكن للمرء أن فحص مجموعة واسعة من الظروف من خلال تغيير خصائص المنظفات المختلفة. وعلاوة على ذلك، ينبغي النظر في التبلور في mesophase شحمي ¹⁸ أو باستخدام bicelles ¹⁹ دائما كبديل للتبلور في المذيلات.

هذه المبادئ والأساليب التي يمكن استخدامها مع بعض modifiالموجبة للعديد من البروتينات عبر الغشاء الأخرى التي يصعب التعبير وتنقية من المضيفين التعبير الأخرى، وسوف تكون مفيدة بشكل خاص لتحديد هيكل أهداف الأدوية عالية تقارب.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DH10Bac	Invitrogen	10361-012
Kanamycin	Fisher	BP906-5
Gentamicin	Fisher	BP918-1
Tetracycline	Sigma	T-7660
Bluo-gal	Invitrogen	15519-028	5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside
Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside	Anatrace	I1003	IPTG
Miniprep kit	Qiagen	27106
Cellfectin II	Invitrogen	10362-100	Sf9 transfection reagent
Sf9	ATCC	CRL-1711
Sf-900 III SFM media	Life Technologies	12658-027
HEK-293S GnTI-	ATCC	CRL-3022
Freestyle 293 media	Life Technologies	12338-018	293 expression media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	0984018DJ
Sodium butyrate	Sigma	303410
S-citalopram	Sigma	E4786	Anagrade
n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside	Anatrace	D310
Cholesteryl hemmisuccinate	Sigma	C6013
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850457P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine	Avanti Polar Lipids	850757P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol	Avanti Polar Lipids	840457P
Leupeptin	Sigma	L2884
Pepstatin A	Sigma	P5318
Aprotinin	Sigma	A1153
PMSF	Sigma	P7626
Desthiobiotin	Iba Life Sciences	2-1000-05
Asolectin	Sigma	11145
Cholesterol	Sigma	C-8667
Lipid A	Sigma	L5399
Brain polar lipid	Avanti Polar Lipids	141101C
Biobeads	Biorad	152-3920	Hydrophobic absorption resin
Goat anti-mouse IRDye 680RD	Odyssey	926-68070	Used as secondary antibody for western blotting
Lauryl maltose neopentyl glycol	Anatrace	NG310	Anagrade
Serotonin	Sigma	H9523
pFastBac 8B6			Available from authors
pEG Bacmam SERT Strep II			SERTIC, Available from authors
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His			SERTTC, Available from authors
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His			SERTCC, Available from authors
Imidazole	Sigma	56749
n-Octyl β-D-maltoside	Anatrace	O310	Anagrade
Thrombin	Haematologic Technologies	HCT-0020
EndoH	New England Biolabs	P0702
Trizma-HCl	Sigma	T5941	Tris is used for preparation of crystallization reservoirs
PEG 400	Sigma	91893
6-aminohexanoic acid	Sigma	7260
Trypsin-EDTA	Fisher	MT25052CV
Isoplate-96 TC	PerkinElmer	6005070
PolyJet	SignaGen	SL100688	Polymer transfection reagent for mamalian cells
Copper HIS-Tag YSI SPA Beads	PerkinElmer	RPNQ0096	His-tag affinity SPA beads
Citalopram, [N-Methyl-3H]	PerkinElmer	NET1039250UC
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023	heating block for thermostability assay
ThermoTop	Eppendorf	5308000003
SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates	Eppendorf	5306000006
0.2 µm syringe filter	Olympus Plastics	25-243
1 L filter system	Corning	430517
2 L flat bottom tissue culture flask	Genemate	F-5909-2000
2 L baffled tissue culture flask	Genemate	F-5909-2000B
CO2 incubator	Thermo Scientific	3950
Forma Orbital Shaker	Thermo Scientific	416
Strep-Tactin resin	Iba Life Sciences	2-1208-025	Strep affinity resin
Extruder	Northern Lipids
Li-Cor imaging system	Odyssey		western blot imaging system
XK16 column	GE Healthcare	28-9889-37	column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton
100 kDa MWCO protein concentrator	Millipore	UFC910096
30 kDa MWCO protein concentrator	Millipore	UFC903024
Äkta FPLC	GE Healthcare	UPC-900
HPLC	Shimadzu	51476
Superose 6 (10/300) column	GE Healthcare	17-5172-01	Used for FSEC
Tangential flow apparatus	Pall Filtron
0.2 µm filter tangential flow cell	Pall Filtron	PSM20C11
30 kDa MWCO tangential flow concentrator	Pall Filtron	OS030T12
Talon resin	Clonetech	635504	His-tag affinity resin used for Fab purification
1 mL HiTrap SP column	GE Healthcare	17115101	Cation exchanger used for Fab purification
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17-5175-01	Used for SEC separation of SERT-8B6
24-well VDXm plate	Hampton Research	HR3-306
18 mm coverslips	Hampton Research	HR3-239
Virocyt virus counter	Virocyt	2100
MicroBeta Trilux	PerkinElmer	1450	96-well scintillation counter
HiTrap SP column	GE Healthcare	17115101
Sertraline	Sigma	S6319