Thermostabilisation, Expression, purification et cristallisation du Serotonin Human Transporter Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

Résumé

Ce manuscrit décrit comment dépister les thermostabilizing mutations, purifier le transporteur de la sérotonine humaine, générer des anticorps de haute affinité, et cristalliser le complexe transporteur-anticorps sérotonine lié à l'antidépresseur drogue S -citalopram. Ce protocole peut être adapté à l'étude d'autres transporteurs membranaires complexes, des récepteurs et des canaux.

Résumé

Le transporteur de la sérotonine est un transporteur de sodium et de chlorure couplés que "pompes" sérotonine extracellulaire dans les cellules. S -citalopram est un médicament utilisé pour traiter la dépression et l' anxiété en se liant au transporteur de la sérotonine à haute affinité, bloquant la recapture de la sérotonine. Nous rapportons ici une procédure efficace et un ensemble d'outils pour stabiliser, express, purifier et cristalliser les complexes de transporteur-anticorps liés à la sérotonine S -citalopram et d' autres antidépresseurs. Les mutations qui stabilisent le transporteur de la sérotonine ont été identifiés à l' aide d' un essai de liaison S -citalopram. Serotonin transporteur exprimé en baculovirus transduites HEK293S GnTI ^- cellules, a été reconstitué en protéoliposomes et utilisé pour produire des anticorps de haute affinité. Nous avons développé une stratégie pour découvrir des anticorps qui sont utiles pour les études structurelles. Une approche simple pour l'expression de fragments d'anticorps dans des cellules Sf9 a également été établi.Complexes Transporter-anticorps purifiés à l' aide de cette procédure sont bien comportés et facilement cristallisent, produisant des complexes avec S -citalopram qui diffractent les rayons X à 3-4 Å de résolution. Les stratégies développées ici peuvent être utilisées pour déterminer la structure des autres protéines membranaires difficiles.

Introduction

Le transporteur de la serotonine (SERT) est une protéine membranaire intégrale qui facilite le transport de la sérotonine à travers les membranes cellulaires ^1. SERT appartient à une famille de neurotransmetteur Sodium symporteurs (SSN) , qui comprend également la dopamine et la noradrénaline transporteurs ^2. SERT est la cible moléculaire des antidépresseurs et anti-anxiété médicaments largement prescrits qui agissent pour inhiber de manière compétitive le transport de la sérotonine ^3. SERT exploite le cotransport énergétiquement favorable de sodium pour éliminer neurotransmetteur de la fente synaptique. Une caractérisation exhaustive du système sérotoninergique a montré que les changements dans le métabolisme de la sérotonine semblent influencer pratiquement tous les processus neurologiques y compris l' humeur, le sommeil, la douleur, la cognition et l' agression comportements ^4. Fonction SERT peut être modifiée par l'utilisation d'antidépresseurs et sélective recaptage de la sérotonine (ISRS) tels que S -citalopram, ainsi que par psychostimulants et les médicaments de dépendance tels que l' amphétamine et de 3,4-méthylènedioxy N -methylamphetamine ou "ecstasy" ^1,2.

ISRS sont extrêmement importantes pour le traitement des troubles de l'humeur, mais la base structurelle précise pour leur action est pas bien comprise. WT SERT est instable dans des micelles de détergent, entravant ainsi les progrès vers un (3D) structure tridimensionnelle de ^5,6 SERT. Récemment, nous avons développé des variantes de SERT qui sont solidement stable dans une large gamme de détergents et conservent l' activité ⁶ liaison ISRS. Ces variants ont été sélectionnés SERT thermostables utilisant un essai de stabilité thermique à base de proximité à scintillation. Nous décrivons ici un procédé pour la production d'anticorps à haute affinité qui peuvent se lier SERT et la purification et la cristallisation du SERT thermostable, dans un complexe avec l' anticorps et S -citalopram.

Ce protocole suppose que le SERT et 8B6 gènes ont été successfully cloné dans les vecteurs BacMam ⁷ et expression d' insecte, respectivement. Pour générer des anticorps, ADNc codant pour les résidus 73-616 du WT SERT a été cloné dans le vecteur BacMam avec un Strep II tag C-terminal (SERT _IC). Pour l'écran de thermostabilité, les résidus de 73-616 avec SERT C-terminal GFP, Strep II, et 10-His (SERT _TC) a été utilisé. Mutations ponctuelles individuelles ont été générés en arrière - plan _TC SERT. Pour le protocole de cristallisation, la protéine de fusion SERT-GFP a été utilisé avec deux lits Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) ₂ GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] et 10-His, portant les mutants thermostables, Y110A, I291A, et T439S et les mutations des cysteines de surface C554A, C580A et C622A (SERT _CC). Des séquences de clivage par la thrombine (LVPRGS) ont également été insérés dans le _CC SERT après Q76 et T618 pour permettre le retrait de l'extrémité N- et C-terminales. Le plasmide codant pour le 8B6 Fab a été conçu pour exprimer à la fois la lourde et légèrechaînes de l'anticorps avec gp67 sécrétion des séquences sous le contrôle de deux promoteurs de polyhédrine séparés. L'extrémité C-terminale de la chaîne lourde de l'anticorps 8B6 a été marqué avec un-His 8 tag et un site de clivage de thrombine a été inséré entre la chaîne lourde et la balise.

Protocole

1. Transfection de Adhérent HEK293S GnTI ^- Cellules pour écran Thermostabilité

1. Préparer la poly-D-lysine (PDL) doté d'un revêtement de plaques à 96 puits. Effectuer tous les travaux dans une hotte à flux laminaire stérile.
   1. Filtrer une solution à 25 pg / ml de page (PDL), le poids moléculaire 70,000-150,000 Da, en utilisant un filtre stérile de 0,2 pm. Ajouter 50 ul de PDL à chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à 96 puits (TC), assurant ainsi le fond est uniformément revêtue et incuber à température ambiante pendant 30 min.
   2. solution Aspirer PDL et laver avec 200 pi d'eau stérile.
   3. Laisser la plaque sécher à l'air pendant 2 h avant le stockage à 4 ° C. des plaques revêtues PDL peuvent être stockés à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
2. Trypsinisation des cellules adhérentes HEK293S.
   1. Cultiver HEK293S à 80% de confluence dans une boîte de 10 cm maintenue à 37 ° C avec 8% de CO _2. Une seule boîte de 10 cm devrait avoir environ 10 millions de cellules HEK293S. Ne pas utiliser des cellules après 30 passages!
   2. Aspirer le milieu et on lave avec 5 ml de tampon phosphate salin (PBS). Ajouter 1 ml de solution de trypsine-EDTA (0,25% de trypsine, 0,02% d'EDTA) aux cellules et on incube pendant 2 min à 37 ° C.
   3. Ajouter 10 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et de remettre les cellules par pipetage de haut en bas plusieurs fois à l'aide d'une pipette sérologique.
   4. Pipette 10 pi de cellules et mélanger avec 10 pi de solution de bleu trypan (0,4%). Déterminer la densité des cellules en utilisant un hémocytomètre et un microscope optique. Ne pas compter les cellules qui sont colorées bleu comme ils sont morts. Faire en sorte que la viabilité des cellules est supérieure à 90%.
3. Remettre en suspension à fond trypsinisées HEK293S GnTI ^- les cellules dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS à une densité de 0,5 x 10 ⁶ cellules / mL dans un réservoir de pipette jetable. Environ 5 millions de cellules HEK293S seront nécessaires pour chaque plaque. Un total de 24 constructions peuvent être transfectées sur chaque plaque à l'aide de cette protocole.
4. À l'aide d'une pipette multicanaux, ajouter 100 pi de cellules à chaque puits d'une plaque revêtue PDL. Resuspendre les cellules dans le réservoir après le remplissage de la pipette chaque plaque pour assurer une distribution uniforme des cellules. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° avec 8% de CO _2. Après 24 h, les cellules devraient atteindre environ 80% de confluence.
5. 1 h avant la transfection remplacer les médias. Préparer des complexes ADN-réactif de transfection pour la transfection.
   1. Pour chaque construction en arrière - plan SERT _TC à cribler, mélanger 450 ng d' ADN avec 45 pi de DMEM sans sérum et mélanger. Ajouter 1,6 ul du réactif de transfection à 45 pi de DMEM sans sérum et mélanger.
   2. Immédiatement ajouter la solution diluée de réactif de transfection à la solution d'ADN et mélanger. Ne pas mélanger les solutions dans l'ordre inverse. Attendez de 10 - 15 min et ajouter 20 pi de mélange réactif / transfection d'ADN à 4 puits.
6. Une fois que tous les puits ont été transfectées, mélanger la plaque en basculant doucement unnd avant et revenir à la 37 ° C incubateur.
7. Après 16 - 24 h remplacent les médias avec DMEM contenant du sérum et de butyrate de sodium à 10 mM.
8. Environ 48 h après la transfection supprimer les médias et soit procéder immédiatement à thermostabilité écran ou congeler les cellules à -80 ° C pour être utilisé plus tard. Les cellules peuvent être stockées à -80 ° C pendant plusieurs semaines.

Écran Thermostabilité basé à proximité 2. Scintillation avec S -citalopram

1. Incuber les cellules avec le -citalopram de 200 nM dans 25 pi de TBS (Tris Buffered Saline - Tris 20 mM, pH 8, NaCl 100 mM) pendant 5 min à température ambiante.
2. Solubiliser les cellules en ajoutant 25 pi d'mM n-dodécyl-β-D-maltopyranoside 8 (C12M), 1 mM de cholestéryle hemmisuccinate (SCH), cocktail inhibiteur de protease (fluorure de phénylméthanesulfonyle 2 mM (PMSF), 0,1 mg / ml d'aprotinine, 4 g / ml de pepstatine A, et 4 ug / ml de leupeptine) dans du TBS, et incubation pendant 1 h à température ambiante.
3. Ajouter 50 pi de TBS wie 20 nM ^[3 H] citalopram (81,7 Ci / mmol), 0,1% de sérum albumine bovine, et 2 mg / mL His-tag affinité scintillation de proximité (SPA) perles à trois puits pour chaque construction. Pour le dernier puits ajouter la même liste, mais solution compléter avec 100 uM sertraline pour déterminer la liaison non spécifique. Veiller à ce que les perles His-tag affinité SPA sont bien mélangés lors de l'ajout à la plaque de 96 puits.
4. Mesurer la liaison ^[3 H] citalopram en utilisant un 96 puits compteur à scintillation à température ambiante avec un temps de comptage 1 min par puits. Continuer plaques de comptage jusqu'à ce que le compte total Plateau (après environ 36 h).
5. plaques thermiques pour 15 min dans un bloc de chauffage avec un couvercle chauffé à 33 ° C. Mesurer la liaison à nouveau après le chauffage ^[3 H] citalopram comme décrit dans 2.4.
6. Répétez l'étape 02.04 à 02.05 et de modifier l'étape de chauffage à 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C et 51 ° C. Régler la température de chauffage en fonction de la température de fusion apparente (Tm)de la protéine cible et la stabilité thermique de la construction la plus stable. Continuer à chauffer les plaques jusqu'à ce que toutes les constructions ont une faible numération spécifiques.
7. Analyser les données pour déterminer les valeurs Tm.
   1. Déterminer le total des comptes moyens par minute (CPM) de chaque construction pour les puits qui ne contiennent pas sertraline en faisant la moyenne des 3 puits réplicats. Déterminer le CPM non spécifique en faisant la moyenne du CPM de chaque puits contenant sertraline dans une seule plaque.
   2. Calculer CPM spécifique en soustrayant le CPM non spécifique de la CPM totale.
   3. Calculer la Tm par un ajustement non linéaire à une fonction sigmoïde de Boltzmann. Constructs avec une faible CPM spécifique à la température ambiante (<10% du WT) ne disposent généralement pas des valeurs précises Tm. Les mutations de la plupart des constructions thermostables peuvent être combinés ensemble et criblés pour additifs augmente en thermostabilité.

3. Expression du Transporter Serotonin humain dans HEK293S GnTI ^{- Cellules}

1. Transformer des cellules DH10Bac chimiquement compétentes avec 1 ng de plasmide.
   1. Ajouter le plasmide à 50 ul de cellules DH10Bac et laisser incuber sur de la glace pendant 30 minutes.
   2. choc thermique des cellules DH10Bac à 42 ° C pendant 30 sec. Ajouter 200 ul de milieu SOC et incuber à 37 ° C pendant 4 heures sous agitation.
   3. Plaque toutes les bactéries sur une plaque de milieu Luria Broth (LB) contenant 50 pg / ml de kanamycine, 7 ng / ml de gentamicine, 10 pg / ml de tetracycline, 100 ug / ml de 5-bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside, et 40 pg / ml isopropyl β-D-thiogalactopyranoside 1 (IPTG).
2. Isolât lacZ ^- colonies (colonies blanches) cultivées à 37 ° C pendant 2 jours sur des plaques d'agar LB.
3. Cultiver plusieurs colonies O / N à 37 ° C dans 5 ml de LB contenant des antibiotiques et d'isoler l'ADN bacmid.
   1. Isoler les bactéries à 1000 xg dans une centrifugeuse pendant 5 min. surnageant Jeter. Remettre en suspension les bactéries avec 200 pi de miniprep run tampon de esuspension.
   2. Lyser les bactéries par addition de 200 ul de tampon de lyse miniprep et en inversant doucement le tube 10 fois. Ajouter 200 pi de tampon de neutralisation.
   3. Éliminer la fraction insoluble par centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min dans une centrifugeuse. Ajouter 1 ml d'isopropanol surnageant et réfrigérer à -20 ° C pendant 20 min pour précipiter l'ADN.
   4. Spin à 14.000 xg pendant 15 min dans une centrifugeuse et éliminer le surnageant.
   5. Laver culot d'ADN avec 70% EtOH et tourner à nouveau à 14 000 xg pendant 15 min. surnageant Jeter. Air ADN sec jusqu'à ce que tous les EtOH a évaporée et remettre en suspension dans 50 ul d'eau.
      REMARQUE: Bacmid ADN doit être transfecté dans des cellules Sf9 immédiatement pour obtenir les meilleurs résultats, mais peut également être conservé à -20 ° C pendant plusieurs semaines.
4. Transfecter Bacmid ADN dans 1x10 ⁶ cellules adhérentes Sf9 cultivées dans une chambre humidifiée à 27 ° C dans un plat à 6 puits. Effectuer toutes les manipulations de culture cellulaire dans une hotte à flux laminaire stérile.
   1. Supprimer les médias à partir de cellules et ajouter 2 ml de milieu Sf9 frais. Ajouter 5 ug d'ADN de bacmide à 100 ul de milieux Sf9 (solution A).
   2. Ajouter 8 ul d'un Sf9 réactif de transfection lipide cationique-100 ul de milieux Sf9 (solution B). Incuber tube contenant la solution B pendant 5 min.
   3. Mélanger le tube contenant la solution A avec la solution B et on incube à température ambiante pendant 30 minutes et ajouter la totalité de la solution pour les cellules Sf9.
   4. Au bout de 96 heures, la récolte du surnageant (virus P1) en faisant passer à travers un filtre de 0,2 um. Le virus P1 peut être stocké pendant plusieurs mois à 4 ° C dans l'obscurité et réutilisée pour rendre le virus P2 selon les besoins.
5. Ajouter 100 ul de virus P1 à 1 L de cellules Sf9 à une densité de 1 x 10 ⁶ cellules / ml dans des milieux Sf9. Infect cellules pendant 96 h, de plus en plus à 27 ° C sur un agitateur à 100 tours par minute.
6. Centrifuger les cellules dans une centrifugeuse à 4000 g pendant 15 min et le surnageant de filtre contenant des particules de virus à travers un filtre de 0,2 um. Jeter les culots cellulaires. Détermdensité virale ine en utilisant un dosage de plaque virale ou d'un compteur de virus. La densité de virus doit être des particules> 1 x 10 ⁸ de virus par millilitre. le virus P2 peut être stocké à 4 ° C dans l'obscurité et utilisé pendant plusieurs mois.
7. Infectent 10 L de HEK293S GnTI ^{- 7} cellules de culture en suspension à 37 ° C avec 8% de CO ₂ et 85% d' humidité sur un agitateur à 130 tpm dans 293 supports d'expression supplémenté avec 2% de FBS à une multiplicité d'infection (MOI) de 2 et une densité de 3 x 10 ⁶ cellules / ml, typiquement de 30 - 50 ml de virus P2 par 800 ml de cellules dans un flacon de 2 L dérouté.
   NOTE: Il est recommandé de ne pas utiliser plus de 80 ml de virus P2 depuis le HEK293S GnTI ^- cellules vont croître lentement et peut devenir non viable en raison d'un changement de pH. Sf9 médias est plus acide que les médias 293 d'expression.
8. 12-16 h post-infection, ajouter le butyrate de sodium à une concentration de 10 mM d'un stock 1 M. 48 - 60 h post-infection, les cellules de récolte par centrifugation à4000 g pendant 15 min. Retirer le surnageant.
9. Resuspendre les cellules dans 150 ml de TBS, 2 uM S -citalopram ou d' autres inhibiteurs de la SERT et conserver à -80 ° C jusqu'au moment de la purification.

4. Affinity Purification de la Serotonin Transporter de l'immunisation et Cristallisation

1. Décongeler les cellules de 10 L de la culture dans l'eau chaude (environ 30 ° C) et resuspendre en passant rapidement à travers une pipette de 10 ml jusqu'à homogénéité.
2. Préparer une solution de détergent pour la solubilisation (150 ml): 80 mM de Tris, pH 8, NaCl 150 mM contenant 40 mM C12M mM, CHS 5 et cocktail inhibiteur de protease.
3. Ajouter toutes les cellules dans un bêcher avec un barreau d'agitation et d'ajouter toute la solution de détergent pour les cellules tout en agitant. Solubiliser à 4 ° C pendant 1 h sous agitation.
4. Spin lysat à 8000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Jeter culot et surnageant décanter dans des tubes d'ultracentrifugation propres. Spin à 100.000 xg pendant 1 h dans un ultracentrifuge. Jeter pastille et filtre surnageant à travers un filtre de 0,2 um.
5. Passer au- dessus de lysat ml de Strep résine 10 d'affinité dans une colonne à l' aide d' une pompe péristaltique équilibrée dans un tampon de lavage: 1 mM C12M mM , CHS 0,2, 5% de glycerol, 25 uM de lipide (1-palmitoyl-2-oléoyl - sn -glycero- 3-phosphocholine, 1-palmitoyl-2-oléoyl - sn - glycéro-3-phosphoéthanolamine et de 1-palmitoyl-2-oléoyl - sn - glycéro-3-phosphoglycérol à un rapport molaire de 1: 1: 1) et 1 iM de la -citalopram ou ISRS dans TBS.
6. Raccorder la colonne d'affinité Strep à un système liquide rapide des protéines Chromatographie (FPLC) et colonne de lavage à 2 mL / min avec 66 ml (volumes 6.6 de colonne) de tampon de lavage. Éluer la protéine purifiée dans le même tampon additionné de 5 mM desthiobiotine à 0,5 ml / min en utilisant 33 ml (3,3 volumes de colonne) de tampon. Prélever 1 ml fractions; les fractions de pic seront ~ 10 mL. La protéine purifiée peut être conservée à 4 ° C pendant 2 à 3 d, si désiré.
   NOTE: Le rendement total sera de 3 -4 mg de _CC et SERT 1 mg de SERT _IC. Une absorbance de 2 UA à 280 nm est égale à 1 mg / ml SERT.

5. Reconstitution du transporteur dans des liposomes pour la vaccination

1. Préparer des liposomes contenant asolectine: cholestérol: lipide A: cerveau lipide polaire (rapport molaire 60: 17: 3: 20). Dissoudre les lipides dans 1 ml de chloroforme et on ajoute 40 mg de lipide total à 100 ml en verre ballon à fond rond à un rapport molaire indiqué.
   1. Evaporer le chloroforme pendant au moins 1 h sous vide avec le ballon à fond rond tournant dans l'eau chaude, environ 30 ° C.
   2. Réhydrater les lipides en ajoutant 10 mL de TBS. Incuber dans un tampon pendant 10 min.
   3. Congeler le lipide en plaçant le ballon dans _N2 liquide.
   4. Dégel. Immergez fond sphérique du flacon dans un bécher rempli d'eau chaude, d'environ 30 ° C. Traitement par ultrasons dans un bain de sonication pendant 5 min.
   5. Vortex et répétez les étapes 5.1.3 - 5.1.4 10 fois ou jusqu'à ce que le lipideest complètement remis en suspension à partir du fond et forme une suspension trouble.
   6. Extruder le mélange lipidique ensemble deux fois par 200 filtres nm. Le lipide apparaît sous la forme d'une suspension laiteuse avant l'extrusion; par la suite, il sera translucide. Ne pas ajouter le mélange lipidique entier à l'extrudeuse à la fois comme il peut se boucher, ce qui entraîne la perte de l'échantillon.
   7. Spin lipides à 100.000 xg pendant 20 minutes et remettre en suspension dans 0,5 à 1 ml de TBS à une concentration de 40 mg / mL.
2. Concentré purifié SERT _IC 250 - 500 ul en utilisant un concentrateur de protéine de 100 kDa MWCO centrifuge à 2 - 4 mg / ml et on sature les liposomes avec 5 mM C12M. Ajouter SERT purifiée au détergent: mélange lipidique dans 1 ml de volume final.
3. Enlever C12M par 3 additions successives de 80 mg / résine d'absorption hydrophobe mL. Pour les 2 premières additions, incuber avec de la résine avec rotation pendant 2 h à 4 ° C. Éliminer la résine par passage à travers de la laine de verre. Effectuer l'incubation finale avec de la résinependant la nuit.
4. Concentrez-protéoliposomes par centrifugation à 100 000 xg pendant 20 min. Jeter le surnageant du culot et remettre en suspension dans 250 - 500 pi de TBS.
5. Ajouter 10 pM concentration finale de S -citalopram à la protéine reconstituée après le retrait final de résine.
6. Solubiliser 2,5 ul des protéoliposomes dans un tampon SDS-PAGE chargement (Tris 62,5 mM, pH 6,8, 10% de glycérol, 2% SDS, 0,01% de bleu de bromophénol, 100 mM de DTT) et sur un gel SDS-PAGE à 200 V pour 1 h pour veiller à ce que le SERT a été reconstitué avec succès. Protéoliposomes peuvent être conservés à -80 ° C en aliquotes pour un stockage à long terme et décongelées sur de la glace avant chaque immunisation.

6. Le dépistage des anticorps reconnaissant des épitopes 3D

1. Écran lignées cellulaires d'hybridome par Western blot. Les anticorps qui reconnaissent par western blot SERT se lient probablement des épitopes linéaires et ne seront probablement pas utiles pour les études structurelles.
   1. Mélanger 1 ug de purified SERT _IC ou SERT _CC et exécuter sur un 4 - gel SDS-PAGE 15% à 200 V pendant 1 h.
   2. Transférer à une membrane de nitrocellulose à 200 mA pendant 30 minutes en utilisant un tampon Towbin (Tris 25 mM, glycine 192 mM, 20% (v / v) de methanol, 0,1% de SDS). La membrane peut être séchée et stockée indéfiniment à la température ambiante.
   3. Membrane remouillage avec 10% de methanol, et on lave avec du PBS (phosphate 10 mM, pH 7,4, NaCl 137 mM, KCl 2.7).
   4. Poulie à 5% de lait en poudre dans du PBS pendant 30 min à température ambiante.
   5. Laver avec du PBS et on incube avec 1 pg / ml d'anticorps dans du PBS avec 0,1% de lait.
   6. Laver abondamment avec du PBS contenant 0,1% de Tween-20.
   7. Laisser incuber avec un anticorps de chèvre anti-souris conjuguée à un colorant IR dilué 1: 10 000 dans du PBS avec 0,1% de Tween 20 et 0,1% de lait.
   8. Laver abondamment et numériser en utilisant un système d'imagerie.
2. Mélanger le surnageant d' hybridome contenant des anticorps négatifs occidentaux avec 100 nM de protéine SERT _CC en utilisant un rapport molaire de 1: 2 (SERT: mAb) dans 200 pi TBS avec 1 mM C12M, mM CHS 0,2 et 1 uM S -citalopram. Centrifugeuse à 100.000 xg pendant 20 min. Analyser surnageant contenant des complexes SERT-mAb et d' analyser par Fluorescence-détection d' exclusion stérique (FSEC) ^8. Jeter le culot.
   1. Exécuter 100 pl de surnageant sur une colonne d'exclusion stérique à raison de 0,5 ml / min en utilisant un système de Chromatographie liquide haute performance (HPLC) munie d'un détecteur de fluorescence (excitation: 480 nm, émission: 510 nm) en utilisant un tampon d'essai contenant du TBS, 0,4 mM lauryl néopentylglycol maltose et 1 pM de S -citalopram. Les anticorps qui forment des complexes causeront la protéine GFP-fusion pour éluer plus tôt que le transporteur libre de la colonne d'exclusion de taille.
   2. Diluer complexes à 10, 1, 0,1 nM dans 200 ul TBS avec 1 mM C12M, mM CHS 0,2 et 1 uM S -citalopram et relancez FSEC. Les anticorps qui peuvent encore décaler le pic de transporteur à faibles concentrations nanomolaires sontliants de haute affinité et de bons candidats pour des études structurales.
3. Retester liaison par FSEC en présence de 1 mM de sérotonine. Des anticorps qui reconnaissent spécifiquement la conformation liée SSRI ne se lient pas en présence du substrat. Des anticorps qui reconnaissent un epitope 3D qui ne change pas à la suite de la conformation se lient indépendamment du ligand présent.
4. Mélanger les combinaisons de paires différentes d'anticorps et de tester la liaison par FSEC. Les anticorps qui reconnaissent des épitopes distincts causeront SERT pour éluer plus tôt lorsqu'ils sont combinés ensemble par rapport à la liaison d'un anticorps unique.
5. Pour les études structurales initiales, sélectionnez les anticorps les plus élevés d'affinité qui reconnaissent les épitopes 3D.

7. Expression des anticorps Fragment dans les cellules Sf9

1. des domaines variables et constants clone de Fab par PCR dans le système d'expression d'insecte pour l'expression dans des cellules Sf9 en utilisant des protocoles standards.
2. Transfecter 1 x 10 ⁶ cellules Sf9 avec 5 ug de Bacmid l' ADN codant pour les chaînes légères et lourdes de l'8B6 Fab 8-His avec une séquence de sécrétion GP67 (conformément à la section 3.4).
3. P1 récolte du virus 96 h après transfection et ajouter 500 ul de virus P1 à 1 L de cellules Sf9 à une densité de 1 x 10 ⁶ cellules / ml dans un flacon de 2 litres pour rendre le virus P2. Infect cellules pendant 96 h à 27 ° C.
4. virus récolte P2 (conformément à la section 3.6).
5. 6 L infectent des cellules Sf9 à une densité de 2-3 x 10 ⁶ cellules / ml avec une MOI de 2 avec le virus P2, typiquement de 40 - 50 ml par flacon avec 1 L de cellules Sf9 dans chaque flacon de 2 litres.
6. cellules de récolte environ 96 h de l'infection. Ajouter 50 ml de tampon phosphate pH 8 à une concentration finale de 50 mM pour des cellules et centrifugation à 4000 xg pendant 20 min. Jeter le culot cellulaire et le filtre surnageant à travers une cellule à écoulement tangentiel de 0,2 um filtre. Recueillir le surnageant et conserver à 4 ° C pendant 2 - 3 jours si on le souhaite.

8. La purification de fragments d'anticorps à partir du surnageant des cellules Sf9

1. Concentrez surnageant Sf9 en utilisant un 30 kDa de poids moléculaire Cut Off (MWCO) Cellule de flux tangentiel à environ 400-800 ml.
2. Ajouter l'imidazole, pH 8 à une concentration finale de 10 mM et de 10 ml de résine d'affinité His-tag. Incorporer dans un bêcher pendant 1 h à 4 ° C.
3. Collecter His-tag résine d'affinité par centrifugation à 2000 xg pendant 5 min. surnageant Jeter.
4. Emballez résine d'affinité His-tag dans une colonne et se connecter à un FPLC.
5. Laver His-tag résine d'affinité à 2 mL / min avec 66 ml (volumes 6.6 de colonne) de 50 mM de phosphate pH 8, NaCl 150 mM, imidazole 25 mM.
6. Éluer 8B6 Fab dans 33 ml de phosphate 50 mM, pH 8, NaCl 150 mM, imidazole 250 mM. Prélever 1 ml fractions.
7. Diluer purifié par affinité Fab avec un volume de 10 fois de l'acétate 20 mM glacé, pH 5.
8. Fab lier à une colonne d'échange de cations de 1 ml en utilisant une pompe péristaltique à 1 mL / min.
9. Fab séparée en utilisant un 30 mL de lingradient d'oreille de NaCl (0-500 mM) dans 20 mM d'acétate à pH 5,5 en utilisant une FPLC. Fab éluera en un seul pic à ~ 300 mM de NaCl.
10. Analyser sur un gel SDS-PAGE 12,5% en utilisant un tampon d'échantillon contenant du DTT 100 mM. Les chaînes lourdes et légères de la 8B6 Fab se déroulera à 27 et 25 kDa, respectivement, sur un gel SDS-PAGE réducteur.
11. fractions de piscine contenant Fab et se concentrent au moins 10 à 15 mg / ml en utilisant un concentrateur kDa MWCO protéine 30 dans un seau centrifuge oscillant à 3000 x g.
12. Ajuster le pH à 8 par addition de Tris 1 M pH 8 à une concentration finale de 50 mM et stocker Fab purifiés à long terme à 4 ° C. Le rendement total sera de 25 - 30 mg. Une absorbance de 1,4 UA à 280 nm est égale à 1 mg / ml de Fab 8B6.

9. Formation des Complexes et séparation Transporter-anticorps par chromatographie d'exclusion stérique

1. Pour la cristallisation, purifier le SERT _CC par chromatographie d'affinité Strep dans C12M comme décrit précédemment (section 4).
2. Digest avec de la thrombine pour supprimer des tags (1: 100 p / p) et EndoH (1:10 p / p) O / N à la température ambiante. On concentre à 250-300 ul en utilisant une protéine kDa MWCO de centrifugeuse concentrateur 100 à une concentration en protéine de 10 mg / ml.
3. Mélanger le SERT concentré avec Fab à un rapport molaire de 1: 1,2, dans un volume inférieur à 500 ul. Centrifuger à 100 000 xg à 4 ° C pendant 20 min. Recueillir le surnageant contenant le complexe SERT-Fab. granulés Jeter.
4. Séparé par Chromatographie d'exclusion stérique (SEC) en utilisant une FPLC sur une colonne d'exclusion de taille équilibrée dans du TBS supplémenté avec 40 mM de n-octyl-β-D-maltoside (C8M) mM, CHS 0,5, 5% de glycerol, 25 uM de lipide (le même que à l' étape 4.5) et 1 uM de S -citalopram à 0,5 mL / min.
5. Collecter des fractions de 0,5 ml et d'analyser le 4 - 15% gels SDS-PAGE, ainsi que par la fluorescence du tryptophane par SEC. GFP étiqueté SERT se déroulera à environ 80 kDa sur un gel SDS-PAGE. Après le retrait des extrémités et des sucres liés à N il fonctionnera comme une protéine de 45 kDa.
6. Determine qui combinent les fractions de mise en commun des seules les fractions qui sont monodisperses à en juger par l'analyse des fractions par fluorescence du tryptophane SEC (Excitation: 280, émission: 335 nm).
7. Magasin purifié complexe SERT-8B6 à 4 ° C pendant 1 semaine.

10. Cristallisation de Transporter-anticorps Complexes de Drop Hanging

1. Avant la cristallisation, on concentre les fractions pics lors de la séparation du complexe SEC SERT-8B6 à 2 mg / ml en utilisant une protéine kDa MWCO de centrifugeuse concentrateur 100. Une absorbance de 2 UA à 280 nm est égale à 1 mg / ml.
2. Ajouter supplémentaires Fab dans un rapport de 1: 0,05 complexe: gratuit Fab. Ajouter 10 uM S libre -Citalopram.
3. Centrifuger à 100 000 xg à 4 ° C pendant 20 min. Collecter surnageant contenant le complexe SERT-Fab. granulés Jeter.
4. Mettre en place un écran de 24 puits goutte suspendue à 4 ° C selon le tableau 1. Cultiver des cristaux de qualité de diffraction sur des solutions de réservoircontenant 100 mM de Tris-NaOH, pH 8,5, 25 - 125 mM de KCl, 32,5 à 34% de PEG 400 et 0,5% d'acide 6-aminohexanoïque.
   REMARQUE: Utilisez Tris ajusté avec NaOH à pH 8,5 comme tampon. Ne pas utiliser une base Tris ajusté avec HCl. L'écran peut être préparé dans des tubes de 2 ml et utilisé jusqu'à la fin. Prenez soin de la pipette avec précision PEG 400 à l'aide d'une pipette à déplacement positif car il est extrêmement visqueux!
   1. Introduire à la pipette 500 ul de chaque solution de réservoir dans un profil bas plaque de 24 puits avec du scellant appliqué à chaque puits. Pipette 1,5, 1,75 et 2 pl du complexe SERT-8B6 sur un 18 mm verre siliconé lamelle. 1 ul d'une solution réservoir au-dessus de l'échantillon de protéine.
      NOTE: La plaque a été acheté avec du mastic déjà appliqué sur le rebord des puits.
   2. Appliquer couvercle coulissant sur le puits 24 avec les gouttes face à la solution de réservoir et sceller immédiatement en appuyant sur lamelle sur mastic pré-appliqué à chaque puits.
   3. Continuez jusqu'à ce que tous les 24 puits ont été mis en place.
   4. Laissez la plaque finie dans une pièce bien isolée à 4 ° C. Ne pas déranger les plaques pendant au moins 3 jours
      NOTE: monocristaux apparaîtront dans un délai d'environ 3 jours et atteindre 100-175 pm après 14 jours.
5. Cristaux de récolte en cryoloops et directement clignotera-cool dans un liquide N ₂ avant la collecte des données de diffraction des rayons X.
6. Si nécessaire, trouver des conditions de cristallisation supplémentaires par une large sélection avec des gouttes suspendues. Utiliser trois gouttes avec des protéines: les rapports de précipitants 2: 1, 1,5: 1, 1: 1. Si un robot est disponible, puis mis en place 100-150 nL gouttes de plus de 70 pi de solution de réservoir dans une plaque de 96 puits. cristaux 3D plus grands peuvent être cultivées dans 24 puits.
7. Note sur la base de l'apparition de la goutte: 0, claire; 1, de la poussière; 2, précipité granulaire; 3, la séparation des phases; 4 microcristalline; 5, les aiguilles; 6, plaques; 7, les cristaux 3D.
8. Mettre en place la cristallisation par pendaison méthodes de chute dans 24 puits comme décrit ci-dessus autour de cond nouvellement identifiéitions.

Résultats

Une bibliothèque de mutants à point unique dans l'arrière - plan a été créé _TC SERT à l' écran pour thermostabilizing mutations. mutants individuels ont été générés en utilisant la mutagenèse standard. Le protocole de criblage utilise des transitoirement transfectées cellules HEK293S et un écran de thermostabilité basé à proximité de scintillation à l' identité rapidement des mutations utiles pour la cristallisation , comme indiqué sur la figure 1A. Valeurs Traçage Tm par rapport lié ^[3 H] citalopram à TA révèle des constructions avec des niveaux appropriés de haute thermostabilité et d' expression pour la purification de la protéine (figure 1B). Trois mutants (Y110A, I291A, et T439S) ont été combinés pour produire une construction très stable (figure 1C). Thermostabilité est également corrélée à une augmentation de la stabilité dans les détergents courts nécessaires à la cristallisation du complexe SERT-Fab à chaîne.

L'expression à grande échelle de SERT humain à l'aide de baculovirus-transduced HEK293S GnTI ^- cellules peut prendre moins de 2 semaines et peut produire des quantités de milligramme, comme illustré sur la figure 2A. Utilisation de la protéine _CC SERT-GFP étiqueté permet de SERT être commodément suivie pendant l' expression et la purification par fluorescence (figure 2B). Notre stratégie de purification impliqué 1) solubilisation du SERT lié à S -citalopram de HEK293S GnTI ^- cellules en C12M en présence du SHC comme un lipide stabilisant; 2) la liaison du SERT à une matrice d'affinité streptocoque; 3) l'élimination des contaminants protéines par lavage extensif; et 4) l' élution de la SERT fonctionnelle avec un tampon contenant de la desthiobiotine (figure 2C). La protéine éluée est essentiellement exempte d'autres protéines détectables par coloration au bleu de Coomassie et monodispersé comme jugé par FSEC (figure 2D, E).

Une stratégie similaire a été prise pour purifier SERT avec une étiquette Strep II qui a été utilisé pour reconstitution et l' immunisation (figure 3A, B). L'incorporation de SERT en protéoliposomes augmente la demi-vie sérique et la stabilité du SERT et améliore la probabilité d'isoler des anticorps à haute affinité. En outre, l' inclusion du lipide A, un composant de la paroi cellulaire bactérienne, sert d'adjuvant puissant ^9. Les liposomes multilamellaires ont été préparées par l'addition d'un tampon à un mélange lipidique séché dans des tubes en verre et remis en suspension dans un tampon. Extrusion des liposomes à travers des filtres de 200 nm de taille de pores monodispersés produit des suspensions de liposomes unilamellaires. Les liposomes sont ensuite saturées avec un détergent, suivi par l'addition d'un détergent dans le SERT purifié. Enfin, le détergent est éliminé par addition de résine d'absorption hydrophobe, le lipide: mélange de détergent. ligand supplémentaire doit être ajouté à l'échantillon reconstitué pour sélectionner des anticorps qui reconnaissent la conformation liée antidépresseur. La présence de SERT dans les protéoliposomes doit être confirmée parsolubilisation d' un petit échantillon avec un colorant SDS-PAGE chargement ou C12M et fonctionne sur SDS-PAGE et FSEC (figure 3C, D).

des lignées cellulaires d'hybridomes exprimant des anticorps SERT peuvent être criblés pour des liants de haute affinité qui reconnaissent des épitopes 3D. Ces propriétés sont cruciales pour le succès éventuel de cristallisation, que l'anticorps doit rester fermement lié à une région structurée pour promouvoir le cristal d'emballage homogènes, des domaines bien ordonnés. Dans la première étape, des anticorps qui reconnaissent des régions non structurées sont identifiées. Le SERT est dénaturé et transféré sur une membrane de nitrocellulose; anticorps qui se lient SERT dénaturé seront ouest-positifs et susceptibles de reconnaître des épitopes linéaires. Dans la figure 4A, nous montrons 2 exemples d'anticorps qui sont western-positif et probablement pas utile pour promouvoir la cristallogenèse. Sur la figure 4B, les anticorps western-négatives restantes sont incubées avec 100 nM de SERT-GFP et séparés parFSEC. Les anticorps qui se lient SERT se déplacera le pic de la GFP-positive à une position antérieure. Les complexes SERT-anticorps peuvent être diluées en outre dans un détergent pour déterminer si elles peuvent se lier avec une affinité nanomolaire, suivie d'une analyse par FSEC. Addition des résultats de la sérotonine dans les changements conformationnels dans le transporteur et donc les anticorps peut être retamisé pour déterminer si elles peuvent reconnaître spécifiquement la conformation ISRS lié. Sur la figure 4C, les anticorps sont présentés pour lier le SERT en présence de sérotonine, indiquant que l'épitope (s) ne change pas par rapport au substrat SSRI état lié. Enfin, sur la figure 4D combinaisons d'anticorps sont testés pour leur capacité à se lier à des épitopes distincts, ce qui entraîne un nouveau décalage vers la gauche. Ici, le 15B8 ou 8A11 anticorps reconnaissent un épitope qui est différent de 8B6.

L'anticorps 8B6 a été choisi pour une analyse structurale basée sur le dépistage préliminaire de cristal avec de la papaïne treated Fab. Les gènes de la 8B6 Fab ont été clonés dans un vecteur d'expression de cellules d'insecte. Fab peut être exprimé et sécrété à partir de cellules Sf9 croissance en suspension. 8B6 le Fab peut être purifié à partir de cellules Sf9 surnageant par His-tag d' affinité (Figure 5A, B) et la Chromatographie d'échange de cations (Figure 5C, D) , résultant en une protéine qui apparaît exempte de contaminants sur des gels de SDS-PAGE. Sur la figure 5E, le recombinant 8B6 Fab est montré pour se lier SERT et est utilisé dans des expériences biochimiques et biophysiques ultérieures.

L'affinité purifiée SERT _CC est digéré par la thrombine et EndoH et mélangé avec 8B6 Fab pour former un complexe en présence de S -citalopram. Le complexe de transporteur-anticorps est ensuite séparé par SEC C8M (figure 6A) et les fractions de pic contiennent à la fois du SERT et Fab , comme indiqué par SDS-PAGE (figure 6B). L'utilisation de C8M est crucial pour la formation de cristaux probablement parce quele détergent à chaîne courte permet une meilleure garniture entre les molécules dans le réseau cristallin. FSEC est utilisé pour déterminer les fractions doivent être mises en commun pour la cristallisation (Figure 6C); Les fractions qui ne sont pas monodisperses et / ou contiennent de grandes quantités de SERT libre ou Fab ne doivent pas être combinés.

En forme de prisme de cristaux de SERT-anticorps peuvent être cultivés en présence de S -citalopram en utilisant ce protocole en suspendant la diffusion de vapeur à goutte (figure 7A). Les cristaux résultants diffractent les rayons X à une résolution de 3,15 Å ¹⁰ (figure 7B).

Figure 1: Scintillation Proximity-base Thermostabilité Assay A.. Vue d' ensemble du protocole de criblage de thermostabilité en présence de ^[3 H] citalopram. B. Maximum lié ^[3 H] citalopram par rapport à la température de fusion apparent (Tm). Les lignes pointillées représentent des valeurs pour le transporteur WT. Les 3 mutants les plus thermostables sont étiquetés. Zone grise représente les mutants qui ont moins de 10% de ^[3 H] citalopram par rapport à WT et les valeurs Tm ainsi inexactes liaison en raison d'un faible rapport signal à bruit. C. Les courbes de Thermostabilité pour WT SERT _TC et les 3 premiers mutants. Les barres d'erreur représentent l' écart - type (SD). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Vue d'ensemble des Mammifères hétérologue Protein Expression A.. Aperçu schématisé de BacMam génération de virus et l' expression de SERT en HEK293S GnTI ^-. Cellules B. ILK293S GnTI ^- cellules exprimant le SERT _CC (GFP fluorescence) C.. Profil d'élution de SERT _CC sur une résine d'affinité Strep. Trace verte représente la concentration de desthiobiotine, 0 - 100% (0-5 mM) D.. Analyse d'affinité purifiée _CC SERT sur un 4 - gel 15% SDS-PAGE E.. FSEC d'affinité _CC SERT purifiée détectée par fluorescence de la GFP (Excitation: 480 nm; émission: 510 nm). Le pic d' élution à 15 ml est SERT (#) et 18 ml est GFP libre (*). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Représentant Affinity Purification et Reconstitution du SERT _IC A.. Aperçu schématique de la production d'anticorps. B. Profil d'élution observé à 280 nm de la purification par affinité de SERT _IC sur une résine d'affinité Strep. Trace verte représente la concentration de desthiobiotine, 0 - 100%. (0-5 mM) C. Analyse d'affinité purifiée et reconstituée SERT sur un 4 - gel 15% SDS-PAGE D.. FSEC du SERT solubilisé après reconstitution. La fluorescence des résidus tryptophane a été utilisé pour détecter le SERT (Excitation: 280 nm; émission: 335 nm). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4:. Analyse des représentatifs SERT anticorps A. Le dépistage d'anticorps par western blot. Environ 1 pg de SERT _CC avec ou sans GFP a été appliquée à un 4-15% SDS-gel PAGE et transférés sur une membrane de nitrocellulose. La liaison a été détectée en utilisant un anticorps de chèvre anti-souris conjugué à de colorant IR. 2G4 et 10f2 sont ouest positive. B. La liaison des anticorps à 100 nM et la détection GFP SERT marqués par FSEC détectée en utilisant la fluorescence de la GFP. C. La liaison de fragments d' anticorps sélectionnés à 100 nM GFP-étiqueté SERT en présence de 1 mM de sérotonine. D. La liaison de 8A11 ou 15B8 Fabs à SeRT-8B6 Fab. Pics mineurs éluant à 18 ml sont GFP gratuitement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5: Purification Représentant du 8B6 Fab à partir de cellules Sf9 A.. Profil d'élution observé à 280 nm de la purification du Fab par 8B6 His-tag d'affinité chromatograp hy. Trace verte représente la concentration d'imidazole, 0 - 50% (0-250 mM) B.. Non réductrices et réductrices gel SDS-PAGE après étiquette His purification par affinité. Protéine qui passe près de 50 kDa est Fab non réduite (#) et des espèces mineures à 25 kDa est réduite Fab (*). C. Profil d'élution observé à 280 nm de la purification du Fab 8B6 par échange de cations, l'affichage d'un pic unique symétrique, ce qui est élué sous un gradient linéaire de chlorure de sodium. Trace verte représente la concentration de NaCl, 0 - 100%. (0-500 mM) D. L' analyse du 8B6 Fab sur un gel SDS-PAGE à 12,5% , après purification par échange de cations. E. La liaison du 8B6 Fab 10 nM GFP-tagged SERT, détecté par fluorescence de la GFP. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 6: Gel Représentant Filtration Chromatographie du Complexe-8B6 SERT en présence de S -citalopram A.. Gel profil filtration d'élution purifié complexe SERT-8B6. pic principal éluant à 11,5 ml est le complexe SERT-8B6. Haute à 15 - 17 ml contient GFP et Fab B.. L'analyse du complexe SERT-8B6 purifié sur une 4 - gel de SDS-PAGE à 15%. Les positions de SERT et les chaînes lourdes et légères des Fab sont représentés par un tiret. C. FSEC des fractions de tailles séparées. complexes SERT-8B6 ont été détectés en utilisant la fluorescence du tryptophane. Fraction 17 contient une plus grande quantité de SERT qui n'a pas complexe avec Fab. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7: Cristallisation du complexe SERT-8B6 Bound to S -citalopram A.. la microscopie optique de cristaux parallélépipédiques du complexe SERT-8B6 après 2 semaines de croissance. La barre d'échelle est égal à 200 um. B. cristaux SERT-8B6 diffractent les rayons X à 3,15 Å. anneau bleu représente 3,15 Å. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1:. Un écran de cristallisation pour le complexe SERT-8B6 Bound to S -citalopram S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Détermination de la structure des protéines de la membrane par des techniques biophysiques reste un défi de taille pour de nombreux transporteurs médicalement significatifs, des récepteurs et des canaux ^11. Ici , nous partageons l' expertise détaillée élaborée pour la détermination de la structure du transporteur de la sérotonine humaine lié à S -citalopram. Nous prévoyons que ces méthodes seront utiles pour déterminer les structures de SERT dans d'autres états conformationnels ainsi que des structures d'autres protéines membranaires difficiles. En outre, les techniques biochimiques décrites ici peuvent également être utilisés pour fonction de SERT purifiée dans un détergent et un environnement quasi-native lipidique étudier.

SERT cristallisation articulée sur le développement de plusieurs outils et techniques. Tout d' abord, l' amélioration de transporteur thermostabilité produites variantes SERT qui ont été bien comportés dans divers micelles de détergent après l' extraction du transporteur à partir de membranes ^6. En second lieu, l'utilisationdu ligand S -citalopram haute affinité à travers la purification et la cristallisation améliorée davantage la stabilité et de l' hétérogénéité conformationnelle réduite. En troisième lieu , la mise au point du système d'expression de BacMam ⁷ a permis de produire de grandes quantités de SERT dans une courte période de 2 semaines, ce qui facilite à la fois l' immunisation et la cristallisation. Enfin, le développement de stratégies pour sélectionner des anticorps de haute affinité qui reconnaissent les épitopes 3D ont permis la découverte de l'anticorps 8B6 qui favorise l'emballage bien ordonnée de complexes anticorps-SERT en cristaux.

Il existe un certain nombre d'étapes critiques et des réactifs ainsi que les problèmes courants qui se produisent souvent à travers le protocole. Tout d'abord, la génération de virus à titre élevé SERT P2 peut être problématique. Ajout de faibles concentrations de virus P1 pour générer le virus de la P2 comme décrit dans ce protocole atténue généralement ce problème, et dans les cas où le titre du virus de la P2 est faible, le virus P3 peut être using virus à une MOI de 0,0001. Les virus ayant un titre inférieur à 1 x 10 ⁸ particules virales / ml ne doivent pas être utilisés et seront presque toujours à des rendements faibles en protéines. Pour l' expression, HEK293S GnTI ^- cellules ont été choisis car ils manquent N -acetylglucosaminyltransferase I activité et ne peuvent donc pas synthétiser N -glycans complexes, au lieu produisant seulement N -glycans haute mannose. Clive EndoH N glycosylation lié en des glycanes riches en mannose sur deux sites en boucle extracellulaire 2 (EL2), laissant une N - acétylglucosamine attaché à asparagine. La digestion des sucres N lié en entropie réduit EL2 de surface qui est probablement important pour la cristallisation. Pour la production d'anticorps, le SERT _{circuit intégré} doit être utilisé pour l' immunisation. GFP est hautement immunogène ¹² et ne doit pas être utilisé comme une balise de fusion pour générer des anticorps car il est difficile de supprimer complètement par SEC. N- flexible et C-terminale du SERT sont pas non plusinclus dans le produit d'assemblage afin d'éviter des anticorps contre ces régions. Les souris peuvent être immunisées avec 30 ug de protéine reconstituée; continuer à immuniser des souris jusqu'à ce que les concentrations sériques élevés d'anticorps peuvent être détectés et produire des cellules d'hybridome ¹³ comme décrit. Une construction thermostabilisés est habituellement le meilleur choix pour la vaccination; si le transporteur est bien élevé et conserve une activité biologique après purification, ce qui est souvent suffisante pour produire des anticorps. L'anticorps 8B6 a été soulevée contre WT SERT. Pour la cristallisation, seules les fractions de pic provenant de la SEC contenant un complexe monodispersé comme jugé par FSEC doivent être combinées et concentrées. cristaux SERT-8B6 poussent dans une gamme étroite de conditions et il y a un certain nombre de mesures qui devraient être prises pour résoudre les problèmes spécifiquement liés à la croissance des cristaux de SERT. base Tris ajusté avec HCl ne doit pas être utilisé dans la solution réservoir, étant donné que ce tampon ne supporte pas la croissance cristalline; il est donc critical à utiliser au lieu Tris ajusté avec NaOH. cristaux de SERT se développent dans une gamme étroite de concentrations de PEG 400, donc si les cristaux ne se développent pas ou si de nombreux petits cristaux sont observés, même une petite augmentation ou une diminution de la concentration du PEG 400 seraient avisés. En outre, l'acide 6-aminohexanoïque additif a également été utilisé dans l'écran optimisé pour améliorer la nucléation. Le ratio de la chute de la protéine: La solution de puits est aussi un facteur déterminant pour la croissance cristalline. Baisse des ratios de 1,5 à 2: 1 sont recommandées, avec des rapports plus proches de 2 drop: 1 supportant généralement la croissance des cristaux plus gros 3 dimensions. Enfin, l'utilisation d'une faible profil des plaques 24 puits est également cruciale pour la croissance cristalline, vraisemblablement en raison de la modification de la vitesse de diffusion de vapeur.

Une approche alternative à la méthode de SPA a été développé à l' écran pour les mutants qui stabilisent le transporteur de la sérotonine de rat dans une conformation de cocaïne liée à l' aide d' un dosage ⁵ de liaison filtre. En revanche, les ba SPAsed dosage permet d'étapes de chauffage successives suivantes par la détermination de la fraction du SERT qui reste lié au ligand. Ainsi, cela permet la détermination rapide de la température de fusion à partir d'un petit nombre d'échantillons. La méthode SPA repose sur la disponibilité d'un ligand de haute affinité et radiomarqués si aucun ligand sont connus qui se lient avec une affinité sous-micromolaire alors une approche alternative sera nécessaire. De nombreuses autres méthodes sont couramment utilisées pour mesurer la stabilité des protéines telles que la liaison de colorants fluorescents et calorimétrie ¹⁴ , mais sont à faible débit et sont incapables de mesurer directement la fonction ou nécessitent de grandes quantités de protéines. Si la méthode de SPA ne peut pas être utilisé, une approche à haut débit alternative est un Thermostabilité dosage à base de FSEC ¹⁵ (FSEC-TS), où l'échantillon est chauffé suivie d' une séparation de la fraction du transporteur restant. FSEC-TS est une approche utile pour accéder à un comportement chromatographique et de l'état oligomérique et est apoutil complémentaire uissance qui peut être utilisé aux côtés de la méthode SPA.

Une comparaison des différents systèmes d'expression de protéines commune a également été trouvé pour favoriser l'utilisation de cellules de mammifères pour l' expression de ¹⁶ et sans surprise SERT cela est probablement le cas pour de nombreuses protéines d'origine mammifère. Les méthodes que nous avons utilisées pour l'expression ont été adaptés pour le SERT, mais sont susceptibles facilement adaptables. Des conditions qui favorisent des niveaux élevés d'expression doivent être soigneusement identifiés en faisant varier le temps de l'expression, la température, la concentration virale et la présence d'inhibiteurs d'histone désacétylase tels que le butyrate de sodium.

Nous privilégions généralement la purification d'affinité dans un détergent à longue chaîne légère, comme C12M ensemble avec le SHC avant la reconstitution de conserver la liaison du ligand à haute affinité. La reconstitution à l'aide d'absorption hydrophobe est une technique douce que nous avons trouvé être efficace pour d'autres transporteurs et récepteurs. Si cen'a pas été couronnée de succès, l' élimination des détergents à des concentrations micellaires critiques élevées par dialyse, la dilution, ou SEC peut être utilisé ¹⁷ pourvu de l'antigène est suffisamment stable dans les détergents. Dans les cas où aucun anticorps appropriés sont trouvés, on trouve presque toujours la question est due à la perte de fonction ou de dénaturation de l'antigène et dans de tels cas, nous avons réalisé avec succès de nouveaux vaccins en accordant une attention particulière à la biochimie des protéines. Enfin, les ligands et les anticorps qui se lient avec de haute affinité devraient constituer la base d'une expérience de cristallisation rationnellement planifiée et en tirant profit d'une variante thermostable, on peut cribler une plus large gamme de conditions en faisant varier les propriétés des différents détergents. En outre, la cristallisation dans une mésophase lipidique ¹⁸ ou en utilisant bicelles ¹⁹ doivent toujours être considérés comme une alternative à la cristallisation dans les micelles.

Ces principes et méthodes peuvent être utilisées avec certains modification pour de nombreuses autres protéines transmembranaires qui sont difficiles à exprimer et purifier les autres hôtes d'expression, et sera particulièrement utile pour la détermination de la structure des cibles de médicaments de haute affinité.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DH10Bac	Invitrogen	10361-012
Kanamycin	Fisher	BP906-5
Gentamicin	Fisher	BP918-1
Tetracycline	Sigma	T-7660
Bluo-gal	Invitrogen	15519-028	5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside
Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside	Anatrace	I1003	IPTG
Miniprep kit	Qiagen	27106
Cellfectin II	Invitrogen	10362-100	Sf9 transfection reagent
Sf9	ATCC	CRL-1711
Sf-900 III SFM media	Life Technologies	12658-027
HEK-293S GnTI-	ATCC	CRL-3022
Freestyle 293 media	Life Technologies	12338-018	293 expression media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	0984018DJ
Sodium butyrate	Sigma	303410
S-citalopram	Sigma	E4786	Anagrade
n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside	Anatrace	D310
Cholesteryl hemmisuccinate	Sigma	C6013
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850457P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine	Avanti Polar Lipids	850757P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol	Avanti Polar Lipids	840457P
Leupeptin	Sigma	L2884
Pepstatin A	Sigma	P5318
Aprotinin	Sigma	A1153
PMSF	Sigma	P7626
Desthiobiotin	Iba Life Sciences	2-1000-05
Asolectin	Sigma	11145
Cholesterol	Sigma	C-8667
Lipid A	Sigma	L5399
Brain polar lipid	Avanti Polar Lipids	141101C
Biobeads	Biorad	152-3920	Hydrophobic absorption resin
Goat anti-mouse IRDye 680RD	Odyssey	926-68070	Used as secondary antibody for western blotting
Lauryl maltose neopentyl glycol	Anatrace	NG310	Anagrade
Serotonin	Sigma	H9523
pFastBac 8B6			Available from authors
pEG Bacmam SERT Strep II			SERTIC, Available from authors
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His			SERTTC, Available from authors
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His			SERTCC, Available from authors
Imidazole	Sigma	56749
n-Octyl β-D-maltoside	Anatrace	O310	Anagrade
Thrombin	Haematologic Technologies	HCT-0020
EndoH	New England Biolabs	P0702
Trizma-HCl	Sigma	T5941	Tris is used for preparation of crystallization reservoirs
PEG 400	Sigma	91893
6-aminohexanoic acid	Sigma	7260
Trypsin-EDTA	Fisher	MT25052CV
Isoplate-96 TC	PerkinElmer	6005070
PolyJet	SignaGen	SL100688	Polymer transfection reagent for mamalian cells
Copper HIS-Tag YSI SPA Beads	PerkinElmer	RPNQ0096	His-tag affinity SPA beads
Citalopram, [N-Methyl-3H]	PerkinElmer	NET1039250UC
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023	heating block for thermostability assay
ThermoTop	Eppendorf	5308000003
SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates	Eppendorf	5306000006
0.2 µm syringe filter	Olympus Plastics	25-243
1 L filter system	Corning	430517
2 L flat bottom tissue culture flask	Genemate	F-5909-2000
2 L baffled tissue culture flask	Genemate	F-5909-2000B
CO2 incubator	Thermo Scientific	3950
Forma Orbital Shaker	Thermo Scientific	416
Strep-Tactin resin	Iba Life Sciences	2-1208-025	Strep affinity resin
Extruder	Northern Lipids
Li-Cor imaging system	Odyssey		western blot imaging system
XK16 column	GE Healthcare	28-9889-37	column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton
100 kDa MWCO protein concentrator	Millipore	UFC910096
30 kDa MWCO protein concentrator	Millipore	UFC903024
Äkta FPLC	GE Healthcare	UPC-900
HPLC	Shimadzu	51476
Superose 6 (10/300) column	GE Healthcare	17-5172-01	Used for FSEC
Tangential flow apparatus	Pall Filtron
0.2 µm filter tangential flow cell	Pall Filtron	PSM20C11
30 kDa MWCO tangential flow concentrator	Pall Filtron	OS030T12
Talon resin	Clonetech	635504	His-tag affinity resin used for Fab purification
1 mL HiTrap SP column	GE Healthcare	17115101	Cation exchanger used for Fab purification
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17-5175-01	Used for SEC separation of SERT-8B6
24-well VDXm plate	Hampton Research	HR3-306
18 mm coverslips	Hampton Research	HR3-239
Virocyt virus counter	Virocyt	2100
MicroBeta Trilux	PerkinElmer	1450	96-well scintillation counter
HiTrap SP column	GE Healthcare	17115101
Sertraline	Sigma	S6319