Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em&gt; S</em&gt; -citalopram

Özet

Bu el yazması, mutasyonlar termo için ekran insan serotonin taşıyıcı arındırmak, yüksek afiniteli antikorların üretilmesi ve antidepresan ilaç S -citalopramın bağlı serotonin taşıyıcı-antikor kompleksi kristalize açıklamaktadır. Bu protokol için diğer zor membran ileticileri, reseptör ve kanal çalışması için adapte edilebilir.

Özet

Serotonin taşıyıcı hücre içine ekstraselüler serotonin "pompaları" bir sodyum ve klorür-birleştiğinde taşıyıcı olduğunu. S -citalopram serotonin geri alımını engelleyerek, yüksek afinite ile serotonin taşıyıcısı bağlanarak depresyon ve anksiyete tedavisinde kullanılan bir ilaçtır. Burada verimli bir prosedür ve ekspres, stabilize arındırmak ve S -citalopramın ve diğer antidepresanlara bağlı serotonin taşıyıcı-antikor kompleksleri kristalize için bir dizi araç sunduk. Serotonin taşıyıcısını stabilize mutasyonlar bağlanma tahlili S -citalopram kullanılarak belirlendi. Bakulovirüs kalıt HEK293S GnTI ifade serotonin taşıyıcı ^- hücreleri, proteoliposomes halinde yeniden kurulmuş ve yüksek afıniteli antikorlar yükseltmek için kullanılmıştır. Biz yapısal çalışmalar için yararlı olan antikorları keşfetmek için bir strateji geliştirdik. Sf9 hücrelerinde antikor fragmanlarının ekspresyonu için basit bir yaklaşım, aynı zamanda tespit edilmiştir.Bu yordamı kullanarak arıtılmış Transporter-antikor kompleksleri uslu ve kolayca 3-4 Å çözünürlük X-ışınları yaymak S -citalopramın ile kompleks üreten, kristalize bulunmaktadır. Burada geliştirilen stratejiler diğer zorlu membran proteinlerinin yapısını belirlemek için kullanılabilir.

Giriş

Serotonin (SERT) hücre membranları ¹ arasında serotonin taşınmasını kolaylaştıran bir integral membran proteinidir. SERT ayrıca dopamin ve norepinefrin taşıyıcıları ² içeren nörotransmitter Sodyum Symporters (NSSs) bir aile aittir. SERT rekabetçi serotonin naklini ³ inhibe hareket yaygın olarak reçete antidepresan ve anti-anksiyete ilaçları moleküler hedeftir. SERT sinaptik gelen nörotransmitter çıkarmak için sodyum enerjik olumlu cotransport patlatır. Serotonerjik sistemin kapsamlı karakterizasyonu serotonin metabolizmasında değişiklikler neredeyse ruh hali, uyku, ağrı, kavrama dahil olmak üzere tüm nörolojik süreçleri etkilemek için görünür olduğunu göstermiştir ve saldırganlık ⁴ davranışları. SERT fonksiyonu S -citalopramın gibi antidepresanlar ve selektif serotonin gerialım inhibitörleri (SSRI) kullanımı yoluyla yanı sıra psychostimula tarafından değiştirilebilirNTS ve amfetamin ve 3,4-Metilendioksi N -methylamphetamine veya "ecstasy" ^1,2 olarak bağımlılık ilaçlar.

SSRI ruh hali bozukluklarının tedavisi için son derece önemli olan, ancak bunların eylem için değerli yapı temeli çok iyi anlaşılmamıştır. WT SERT Böylece SERT ^5,6 bir üç boyutlu (3D) bir yapı doğru ilerlemeyi engelleyen, deterjan miseller stabil değildir. Son zamanlarda, deterjan geniş bir sağlam kararlıdır ve aktivitesi ⁶ bağlanma SSRI korumak SERT varyantlarını geliştirdi. Bu termo SERT varyantları, bir sintilasyon yakınlık tabanlı termostabilite deneyi kullanılarak belirlenmiştir. Burada antikorun ve S -citalopramın ile kompleks olarak, SERT bağlanan yüksek afiniteli antikorların üretilmesi için bir işlem, ve ısıya dayanıklı SERT saflaştırılması ve kristalleşme açıklar.

Bu protokol SERT ve 8B6 genler başarılı olmuştur varsayary, sırasıyla, BacMam ⁷ ve böcek sentezleme vektörlerine klonlanmıştır. Antikorların üretilmesi için, bir cDNA kodlayan tortuları WT SERT'in 73-616 bir C-terminal Strep II etiketi (SERT _İS) BacMam vektörüne klonlanmıştır. Termostabilite ekran için, SERT artıkları C-terminali GFP ile 73-616, Strep II ve 10-His etiketleri (SERT _TC) kullanılmıştır. Bireysel nokta mutasyonları SERT _TC arka planda üretildi. Kristalleşme protokolü için, SERT-GFP füzyon proteini yüzey sisteinler C554A, C580A ve ısı ayarlı mutantlar, Y110A, I291A ve T439S ve mutasyonlar taşıyan Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) ₂ GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] ve 10-His etiketleri ile kullanılmıştır ve C622A (SERT _CC). Trombin parçalama dizileri (LVPRGS) de N- çıkarılması ve C-ucu sağlamak için S76 ve T618 sonra SERT _CC sokulmuştur. 8B6 Fab kodlayan plazmid ağır ve hafif hem de ifade etmek için olaniki ayrı polihedrin promoterlerin kontrolü altında GP67 salgılama sekansları ile antikor zincirleri. 8B6 antikorunun ağır zincirinin C-terminal 8 His etiketi ile etiketlenmiş ve bir trombin parçalanma alanı ağır zincir ve etiket arasına sokulmuştur.

Protokol

Yapışık HEK293S GnTI 1. Transfeksiyon ^- Termostabilite Ekranı için hücreler

1. Poli-D-Lisin (PDL) 96 oyuklu plakalar -kaplı hazırlayın. Steril bir laminer akış kaputu tüm çalışmaları gerçekleştirin.
   1. 0.2 um steril filtre kullanılarak, bir 25 ug / ml solüsyon (PDL), moleküler ağırlık 70,000-150,000 Da filtre. Alt eşit kaplanır sağlanması, 96-gözlü doku kültür (TC) plakanın her oyuğuna PDL 50 uL ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
   2. Aspire PDL çözeltisi ve steril su, 200 ul ile yıkayın.
   3. Veren plakası 4 ° C'de depolanmadan önce 2 saat boyunca kurumasını. PDL kaplı plakalar birkaç hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
2. Yapışkan HEK293S hücreleri, tripsinizasyon.
   1. % 8 _CO2 ile 37 ° C 'de muhafaza edilen bir 10 cm tabak içinde% 80 konfluansa kadar HEK293S büyütün. Tek bir 10 cm çanak yaklaşık 10 milyon HEK293S hücre olmalıdır. 30 pasajlar sonra hücrelerin kullanmayın!
   2. Aspire ortam ve fosfat tamponlu tuz 5 mL (PBS) ile yıkanır. hücrelere Tripsin-EDTA çözeltisi (% 0.25 tripsin,% 0.02 EDTA) 1 ml ilave edilir ve 37 ° C'de 2 dakika süreyle inkübe edin.
   3. art arda pipetleme ve serolojik bir pipet kullanarak aşağı% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile tekrar süspansiyon hücreleri ile desteklenmiş Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) 10 ml ekleyin.
   4. Pipet 10 hücre uL ve 10 uL tripan Mavi çözeltisi (% 0.4) ile karıştırın. Hemasitometre ve ışık mikroskobu kullanılarak hücre yoğunluğu belirlemek. Onlar öldü mavi lekeli hücreleri saymayın. Bu hücre canlılığı% 90'ın olduğundan emin olun.
3. İyice HEK293S GnTI tripsinize süspanse edin ^- DMEM hücre tek kullanımlık bir pipet rezervuar içinde 0.5 x 10 ⁶ hücre / mL yoğunluğunda% 10 FBS ile takviye edilmiştir. Yaklaşık 5.000.000 HEK293S hücreler her bir tabak için gerekli olacaktır. 24 yapıları toplam bu pr kullanarak her tabakta transfekte edilebilirotocol.
4. Bir çok kanallı pipet kullanarak, bir PDL kaplı plakanın her oyuğuna 100 ul hücre ilave edin. Her plaka doldurduktan sonra pipet rezervuar içinde süspanse edin hücreleri hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için. % 8 _CO2 ile 37 ° C inkübatör hücreleri inkübe edin. 24 saat sonra, hücreler, yaklaşık% 80 konfluent ulaşmalıdır.
5. Transfeksiyondan önce 1 saat ortamı değiştirin. Transfeksiyon için, DNA transfeksiyon reaktifi kompleksleri hazırlamak.
   1. Her bir taranabilir Sert _TC arka oluşturmak için, serumsuz DMEM 45 uL 450 ng DNA karışımı ve karıştırılır. serumsuz DMEM 45 ul transfeksiyon reaktifi 1.6 uL ilave et ve karıştır.
   2. Hemen DNA çözüm seyreltilmiş transfeksiyon reaktif çözümü eklenir ve karıştırılır. ters çözüm karışmaz. 15 dk ve 4 kuyu transfeksiyon reaktif / DNA karışımı 20 mcL - 10 bekleyin.
6. Tüm kuyular transfekte edildikten sonra, yavaşça geri sallanan ile plaka mixnd ileri ve 37 ° C inkübatör dönmek.
7. 24 saat DMEM içeren serum ve 10 mM sodyum bütirat ile medya değiştirin - 16 sonra.
8. Yaklaşık 48 saat sonra transfeksiyon ortamı çıkarın ve ya hemen sonra kullanılmak üzere -80 ° C'de hücreleri ısıya dayanıklıdır ekran ile devam ya da dondurun. Hücreler, bir kaç hafta içinde, -80 ° C'de saklanabilir.

S -citalopramın 2. Sintilasyon Yakınlık tabanlı Termostabilite Ekran

1. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca - (20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl, Tris-tamponlu tuzlu su) TBS 25 uL 200 nM S -citalopramın kuluçkaya bırakılır.
2. ekleyerek, hücreleri eritmek 8 mM N-dodesil-β-D-maltopiranozit (C12M), 1mM kolesteril hemmisuccinate (CHS), proteaz inhibitör kokteyli (2 mM fenilmetansülfonil florit (PMSF), 0.1 mg / mL aprotinin, 4 g 25 uL / ml pepstatin A ve 4 ug / ml löpeptin) TBS içinde, ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe.
3. TBS wi 50 uL ekleyininci 20 nM ^[3H] sitalopram (81.7 Ci / mmol),% 0.1 sığır serum albümini ve 2 mg / ml His-tag afinite sintilasyon yakınlık deneyi (SPA), her yapı için üç kuyu için boncuklar. son için iyi listelenen aynı çözüm eklemek, ancak spesifik olmayan bağlanmasını belirlemek için 100 mcM sertralinle tamamlar. 96-iyi levhaya eklerken His-tag afinite SPA taneleri iyice karışmasını sağlamak.
4. Ölçüm ^[3H] sitalopram oyuk başına 1 dakika sayımı kez oda sıcaklığında 96 oyuklu bir sintilasyon sayacı kullanılarak bağlanması. toplam sayım (yaklaşık 36 saat sonra) plato kadar sayma plakaları devam edin.
5. 33 ° C 'de ısıtılmış kapak ile, bir ısıtma bloğu içinde 15 dakika için ısı plakalar. 2.4'te tarif edildiği gibi ^[3H] sitalopram ısıtıldıktan sonra yeniden birleşimini ölçebilir.
6. Adımı tekrar 2,4-2,5 ve 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C, 51 ° C'ye kadar ısıtma aşamasını değiştirin. Belirgin erime sıcaklığına bağlı olarak ısıtma sıcaklıkları ayarlayın (Tm)Hedef protein ve en kararlı yapının termostabilite. Tüm yapılar düşük özgül sayıları elde edene kadar plakaları ısıtmak için devam edin.
7. Tm değerlerini belirlemek için verileri analiz edin.
   1. 3 tekrarlı kuyu ortalamasını alarak sertralin içermeyen kuyuları için inşa her ortalama toplam sayıları min başına (CPM) belirleyin. Tek bir plaka içeren her sertralin CPM ortalaması alınarak spesifik olmayan CPM belirler.
   2. toplam CPM gelen spesifik olmayan CPM çıkarılarak özel CPM hesaplayın.
   3. Boltzmann sigmoid fonksiyonu doğrusal olmayan bir geçme ile Tm hesaplanır. Oda sıcaklığında düşük özgül CPM (Tm değerleri yoktur. En termo yapılardan mutasyonlar bir araya getirildi ve termostabilite katkı artar taranabilir.

HEK293S GnTI İnsan serotonin taşıyıcı 3. Ekspresyon ^{- Hücreler}

1. plazmid 1 ng kimyasal yetkin DH10Bac hücrelerini dönüştürmek.
   1. DH10Bac hücreleri 50 ul plazmid ilave edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
   2. 30 saniye için 42 ° C sıcaklıkta ısı şoku DH10Bac hücreleri. SOC ortamı, 200 ul ekleyin ve çalkalanarak 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   3. Levha 50 ug / ml kanamisin, 7 ug / ml gentamisin, 10 ng / ml tetrasiklin, 100 ug / ml 5-bromo-3-indolil β-D-galaktopiranosid ihtiva eden Luria Broth (LB) plakası üzerine bakterilerin tümünü ve 40 ug / ml izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG).
2. LacZ izole ^- LB agar plakaları üzerinde 2 gün boyunca 37 ° C'de büyütüldü koloniler (beyaz koloni).
3. LB ihtiva eden antibiyotik 5 mL, 37 ° C 'de pek çok koloniler O / N büyütün ve Bacmid DNA, izole eder.
   1. 5 dakika boyunca santrifüj içinde 1000 x g'de bakteri dönerler. Süpernatantı atın. miniprep r 200 uL ile yeniden süspanse bakteriesuspension tamponu.
   2. miniprep lizis tamponu 200 mcL ekleyerek ve yavaşça 10 kez tersini tüp lyse bakteri. nötralizasyon tamponu 200 mcL ekleyin.
   3. bir santrifüj içinde 10 dakika için 14,000 x g'de iplik çözünür olmayan kısmın çıkarılması. 20 dakika DNA çökeltilmesi için -20 ° C'de süpernatana izopropanol ve soğuk 1 ml ekleyin.
   4. bir santrifüj içinde 15 dakika için 14,000 x g'de spin ve süpernatant atılır.
   5. Yıkama DNA,% 70 EtOH ile pelet haline getirilmiş ve 15 dakika için 14,000 x g'de tekrar döndürün. Süpernatantı atın. Tüm EtOH kadar Hava kuru DNA buharlaştırılır ve su 50 uL tekrar süspansiyon vardır.
      Not: Bacmid DNA, hemen en iyi sonuçlar için Sf9 hücreleri içine transfekte olması gerekir, ancak, aynı zamanda birkaç hafta -20 ° C'de saklanabilir.
4. Transfect 6 oyuklu tabakta 27 ° C'de nemlendirilmiş bir haznede lekelenmiştir yetiştirilen yapışık Sf9 1x10 ⁶ hücrelerine bakmid DNA'sını. steril bir laminer akış başlığı içinde, tüm hücre kültüründe kullanılan gerçekleştirin.
   1. hücrelerden ortamı çıkarın ve taze Sf9 medya 2 mL ekleyin. Sf9 ortam, 100 uL (Çözelti A) Bacmid DNA, 5 ug ekleyin.
   2. Sf9 ortam, 100 uL (solüsyon B) bir katyonik lipid Sf9 transfeksiyon reaktifi 8 uL ekleyin. 5 dakika boyunca çözeltiden B içeren tüp inkübe edin.
   3. Çözelti B tüp ihtiva eden çözelti, karıştırın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe ve Sf9 hücreleri çözüm tüm ekleyin.
   4. 0.2 um'lik bir filtreden geçirilerek 96 saat, hasat süpernatan (P1 virüsü) sonra. P1 virüsü karanlıkta 4 ° C'de birkaç ay boyunca saklanabilir ve gerektiğinde P2 virüsü hale getirmek için tekrar kullanılabilir.
5. Sf9 ortam içinde 1 x 10 ⁶ hücre / mL yoğunluğunda Sf9 hücrelerinin 1 L 100 uL P1 virüsü ekleyin. 100 rpm'de bir çalkalama 27 ° C 'de büyümekte, 96 saat hücreleri enfekte etmektedir.
6. 15 dakika ve 0.2 um'lik bir filtreden virüs partikülleri içeren süpernatan filtre 4,000 xg'de santrifüj hücreleri dönerler. Hücre pelet atın. unsurlarviral plak deneyi veya bir virüs sayacı kullanılarak ine viral yoğunluk. Virüs yoğunluğu mililitre başına> 1 x 10 ⁸ virüs parçacıkları olmalıdır. P2 virüsü karanlıkta 4 ° C'de saklandı ve birkaç ay boyunca kullanılabilmektedir.
7. HEK293S GnTI 10 L Infect ^- süspansiyon içinde büyüyen hücrelerin ^7, 37 ° C 'de% 8 _CO2 ve% 85 nem ile bir çalkalama düzenine% 2 FBS ile takviye edilmiş 293 sentezleme ortamı 130 rpm bir enfeksiyon çokluğu 2 (MOI) ve / ml, tipik olarak 30, 3 x 10 ⁶ hücre yoğunluğu - 50 ml 2 L hücre 800 ml başına P2 virüsünün şişesindeki.
   NOT: HEK293S GnTI beri P2 virüsünün 80'den fazla mL kullanılması tavsiye edilmez ^- Vadesi pH bir değişiklik hücrelerin yavaş yavaş büyüyecek ve unviable hale gelebilir. Sf9 medya 293 ifadesi medyaya daha asidik olduğunu.
8. 12 - Enfeksiyondan 16 saat, 1 M stoktan 10 mM'lik bir konsantrasyonda sodyum bütirat ilave edin. 48-60 saat sonra enfeksiyon, santrifüj ile hasat hücreler15 dakika boyunca 4,000 x g. süpernatantı.
9. TBS 150 mL yeniden süspanse hücreleri, 2 mcM S -citalopram veya diğer SERT inhibitörleri ve -80 ° C'de mağaza saflaştırılması için hazır olana kadar.

Bağışıklama ve Kristalizasyon için Serotonin Transporter 4. Affinity Arıtma

1. Hızla homojen olana kadar, 10 ml bir pipet geçirilerek ılık su (yaklaşık 30 ° C) ve tekrar süspansiyon kültür 10 L hücreleri çözülme.
2. 80 mM Tris, pH 8, 40 mM C12M, 5 mM CHS ihtiva eden 150 mM NaCI ve proteaz inhibitörü kokteyli: çözündürme (150 mL) deterjan çözeltisi hazırlayın.
3. Bir karıştırma çubuğu olan bir behere tüm hücreleri ekleyin ve karıştırılırken hücrelere bir deterjan her ekleyin. karıştırılarak 1 saat boyunca 4 ° C'de çözünür.
4. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 8000 x g'de lizat dönerler. temiz ultrasantrifüjdeki tüpler içine pelet ve decant süpernatant atın. Bir ultracent 1 saat boyunca 100,000 x g hızında Spinrifuge. 0.2 mikron filtre ile pelet ve filtre süpernatant atın.
5. Yıkama tampon maddesi içinde dengelenmiş bir peristaltik pompa kullanılarak bir sütun içine yerleştirilmiş 10 ml Strep afinite reçinesi üzerinde lizat geçirin: 1mM C12M, 0.2 mM CHS,% 5 gliserol, 25 uM lipit (1-palmitoil-2-oleoil sn -glycero- 1 bir mol oranında 3-fosfokolin, 1-palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3-fosfoetanolamin, 1-palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3-fosfogliserol: 1: 1) ve 1 um S -citalopram veya TBS içinde SSRI.
6. Bir Hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) sisteme Strep afinite sütunu bağlayın ve yıkama tamponu 66 mL (6.6 kolon hacminde) ile 2 mL / dakika sütun yıkayın. Aynı tampon içinde Elute saflaştırılmış protein tamponu 33 mL (3.3 kolon hacmi) kullanılarak 0.5 ml / dk'da destiobiyotin 5 mM ile takviye edilmiştir. 1 ml'lik fraksiyonlar toplamak; pik fraksiyonlar ~ 10 mi olur. İstendiği takdirde, 3 D - Arıtılmış protein 2, 4 ° C'de depolanabilir.
   NOT: Toplam verim 3 olacak -SERT _CC 4 mg ve SERT _IC 1 mg. 280 nm 'de 2 AU absorbans 1 mg / ml SERT eşittir.

Bağışıklama lipozomlar içine Taşıyıcının 5. Sulandırma

1. Kolesterol: asolectin içeren lipozomları hazırlamak lipit A: beyin kutuplu lipit (mol oranı 60: 17: 3: 20). 1 mL kloroforma lipitleri çözülür ve belirtilmedikçe molar oranı 100 mililitrelik bir cam yuvarlak tabanlı bir şişeye, toplam lipidin 40 mg ekleyin.
   1. yuvarlak tabanlı bir şişe, yaklaşık sıcak su içinde 30 ° C dönen vakum altında en az 1 saat boyunca, kloroform buharlaştırın.
   2. TBS 10 ml ekleyerek lipidlerin rehidrate. 10 dakika süre ile tampon maddesi içinde inkübe edilir.
   3. Sıvı N ₂ balon yerleştirerek lipid dondurun.
   4. Çözülme. Ilık su ile dolu bir beher içinde, yaklaşık olarak 30 ° C bir şişe küresel alt bırakın. 5 dakika bir banyo sonikatörü içinde sonikasyon.
   5. Vortex ve tekrar adımları 5.1.3 - 5.1.4 10 kez ya da lipid kadartam altından yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve bulutsu bir süspansiyon oluşturur.
   6. 200 nm filtreler aracılığıyla iki kez, tüm lipit karışımı a'ya. Lipid ekstrüzyon öncesinde bir sütlü süspansiyon olarak görünecektir; sonra o saydam olacak. o tıkanabilir olarak numunenin kaybı ile sonuçlanan, bir defada ekstrudere tüm lipit karışımı ilave etmeyin.
   7. 40 mg / mL'lik bir konsantrasyonda TBS 1 mL - 0.5 20 dakika ve tekrar süspansiyon 100,000 xg'de lipitler dönerler.
2. 2 100 kDa'lık bir MWCO santrifüj proteini konsantratör kullanılarak 500 uL - - 250 saflaştınlmış SERT _IC Konsantre 4 mg / ml ve 5 mM C12M lipozomlar doyurulması. deterjan saflaştırılmış SERT ekleyin: lipid karışımı 1 ml nihai hacim içinde.
3. 80 mg / ml, hidrofobik emici reçinenin 3 ilâvesi ile C12M çıkarın. İlk 2 eklemeler için, 4 ° C'de 2 saat boyunca rotasyon ile reçine ile inkübe edin. cam yünü içinden geçirilerek reçine çıkarmak. reçine ile son bir inkübasyon gerçekleştirmebir gecede.
4. 20 dakika boyunca 100,000 x g'de santrifüj ile proteoliposomes konsantre edilir. TBS 500 ul - 250 supernatant ve tekrar süspansiyon pelet atın.
5. Reçinenin son çıkarılmasını takiben yeniden protein S -citalopramın 10 uM nihai konsantrasyon ekleyin.
6. SDS-PAGE yükleme tamponu (62.5 mM Tris, pH 6.8,% 10 gliserol,% 2 SDS,% 0.01 bromofenol mavisi, 100 mM DTT) içinde proteoliposomes 2.5 uL çözündürülmesi ve 1 200 V bir SDS-PAGE jel üzerinde bu SERT sağlamak H başarılı yeniden edilmiştir. Proteoliposomes uzun süreli depolama için parçalar halinde -80 ° C'de saklandı ve her aşılama önce buz üzerinde çözülmüş olabilir.

3D antikorları tanıyanlardır 6. Eleme

1. Western blot ile ekran hibridom hücre çizgileri. Western blot ile SERT tanıyan antikorlar, muhtemelen lineer epitopları bağlayan ve büyük olasılıkla, yapısal çalışmalar için yararlı olmayacaktır.
   1. purifi 1 mikrogram karıştırınEd SERT _IC veya SERT _CC ve 4 üzerinde çalışan - 1 saat boyunca 200 V'ta% 15 SDS-PAGE jeli.
   2. Towbin tamponu kullanılarak 30 dakika boyunca (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 20 (h / h) metanol,% 0.1 SDS), 200 mA bir nitroselüloz zara transfer edin. Membran, kurutuldu ve oda sıcaklığında süresiz olarak saklanabilir.
   3. Yeniden ıslanma,% 10 metanol ile membran ve PBS ile yıkayın (10 mM fosfat, pH 7.4, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI).
   4. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde% 5 süt tozu ile bloke edin.
   5. PBS ile yıkayın% 0.1 süt ile PBS içinde antikorun 1 ug / ml ile inkübe edin.
   6. PBS,% 0.1 Tween-20 ihtiva eden iyice yıkayın.
   7. % 0.1 Tween 20 ve% 0.1 süt ile PBS içinde 10.000: IR boyası konjuge keçi anti-fare antikoru ile inkübe 1 seyreltilmiştir.
   8. yoğun yıkayın ve bir görüntüleme sistemi kullanılarak tarayın.
2. (2 SER: 1 molar oranı ile, 100 nM SERT _CC proteini ile Western Negatif antikorları içeren hibridoma süpernatant karıştırınT: 1mM C12M, 0.2 mM CHS ve 1 uM S -citalopramın 200 uL TBS içinde mAb). 20 dakika boyunca 100,000 x g'de santrifüjleyin. SERT-mAb kompleksleri içeren süpernatant analiz ve Floresan algılama Boyut Dışlama Kromatografisi (FSEC) ⁸ ile analiz edin. pelet atın.
   1. TBS, 0.4 mM içeren çalışan bir tampon (510 nm: 480 nm, emisyon uyanm) floresan detektörü ile donatılmış bir yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) kullanılarak 0.5 ml / dk'da bir ebat eksklüzyon kolonu üzerinde yüzer, 100 uL başlat lauril maltoz neopentil glikol ve 1 uM S -citalopram. kompleksler oluşturan antikorlar, GFP füzyon proteini boyut dışlama kolonundan serbest taşıyıcı daha önce elüte neden olur.
   2. 1 mM C12M 200 uL TBS içinde 10, 1, 0.1 nM, 0.2 mM CHS ve 1 uM S -citalopramın ve tekrar işleme FSEC için kompleksleri seyreltilir. hala düşük nanomolar konsantrasyonlarda taşıyıcı tepe kayabilir antikorlardıryüksek afiniteli bağlayıcılar ve yapısal çalışmalar için iyi bir aday.
3. 1 mM serotonin mevcudiyetinde FSEC ciltlenmesini yeniden test edin. özellikle SSRI bağlanmış yapıyı tanıyan antikorlar, alt-tabakanın mevcudiyetinde bağlamayacaktır. konformasyon sonucu değişmez 3B epitopu tanıyan antikorlar, ne olursa olsun, bağ mevcut bağlanacaktır.
4. Antikorların ikili farklı kombinasyonları karıştırın ve FSEC ile bağlanma açısından test edin. apayn epitopları tanımaktadır antikorlar, tek bir antikor bağlanması ile karşılaştırıldığında birbirine birleştirildiğinde SERT önce elüte neden olur.
5. İlk yapı çalışmaları için de, 3D epitopları tanıyan yüksek afinite antikorları seçmek.

Sf9 hücrelerinde antikor parçasının 7. Ekspresyon

1. standart protokoller kullanılarak Sf9 hücrelerinde ekspresyon için böcek ekspresyon sistemi içine PCR tarafından Fab klon değişken ve sabit alan.
2. Transfect 1 x 1(Bölüm 3.4 başı gibi) GP67 salgı dizisi 8-His takılı 8B6 Fab, hafif ve ağır zincirleri kodlayan Bacmid DNA, 5 ug 0 ⁶ Sf9 hücreleri.
3. Hasat P1 virüsü 96 saat transfeksiyondan P2 virüsü yapmak için bir 2 L'lik bir şişede, 1 x 10 ⁶ hücre / mL yoğunluğunda Sf9 hücreleri 1 L P1 virüsünün 500 ul ilave edin. 27 ° C 'de 96 saat hücreleri enfekte etmektedir.
4. Hasat P2 virüsü (bölüm 3.6 göre).
5. Her 2 L bir şişe içinde Sf9 hücrelerinin 1 L bir şişeye 50 mL - P2 virüsü, tipik olarak 40 ile 2 MOI 3 x 10 ⁶ hücre / mL - 2 yoğunluğunda Sf9 hücreleri 6 L Infect.
6. Hasat hücreler yaklaşık 96 saat İnokulasyonu. 20 dakika boyunca 4000 x g'de hücreleri ve spin 50 mM nihai konsantrasyona fosfat tampon maddesi, pH 8 50 mL. 0.2 um'lik bir filtreden teğetsel akış hücresi içinden hücre pelletini ve filtre Süpernatant atılır. İstendiği takdirde, 3 gün - 2, 4 ° C'de süpernatan ve depolayan.

8. Sf9 süpernatanından Antikor Parçalarının Saflaştırılması

1. 800 ml - yaklaşık 400, 30 kDa'lık bir moleküler ağırlık Kesilmiş (MWCO) teğetsel akış hücresi kullanılarak Sf9 süpernatant konsantre edilir.
2. 10 mM ve His-etiketi afinite reçinesi, 10 mL bir son konsantrasyonda imidazol, pH 8 ekleyin. 4 ° C'de 1 saat süreyle bir beher içinde karıştırılır.
3. 5 dakika boyunca 2,000 x g'de santrifüj ile His-tag afinite reçinesi toplayın. Süpernatantı atın.
4. Bir sütuna His-tag afinite reçine paketi ve bir FPLC bağlanın.
5. 50 mM fosfat, pH 8, 150 mM NaCI, 25 mM imidazol 66 mL (6.6 kolon hacminde) ile 2 mL / dakika ile His-tag afinite reçinesi yıkayın.
6. 50 mM fosfat, pH 8, 150 mM NaCI, 250 mM imidazol 33 mL Elute 8B6 Fab. 1 ml'lik fraksiyonlar toplanır.
7. buz soğukluğunda 20 mM asetat, pH 5 10 kat hacim Fab saflaştınldı afiniteye seyreltilir.
8. 1 mL / dakika bir peristaltik pompa kullanılarak 1 ml katyon değiştirme kolonuna Fab bağlayın.
9. 30 ml lin kullanarak ayrı Fabbir FPLC kullanılarak 20 mM asetat pH 5.5 içinde - (500mM 0) NaCI kulak gradyanı. FAB-MS, 300 mM NaCl'de, tek bir tepe noktası olarak elüte olur.
10. 100 mM DTT ihtiva eden bir örnek tamponu kullanılarak bir% 12.5 SDS-PAGE jeli üzerinde analiz edin. 8B6 Fab ağır ve hafif zincirlerinin bir indirgeyici SDS-PAGE jeli üzerinde sırasıyla, 27 ve 25 kDa çalışacaktır.
11. 3.000 x g'de bir sallanan kepçeli santrifüjde 30 kDa'lık bir MWCO proteini konsantratör kullanılarak 15 mg / mL - Fab içeren havuz kısımlar ve en az 10 kadar konsantre edilir.
12. 4 ° C'de uzun bir dönem için Fab saflaştırılarak son 50 mM konsantrasyonda ve saklamak için 1 M Tris pH 8 eklenerek pH 8'e ayarlayın. 30 mg - Toplam verim 25 olacak. 280 nm 'de 1.4 AU absorbans 1 mg / 8B6 Fab mL eşittir.

Boyut Dışlama Kromatografisi ile Transporter-antikor Kompleksleri ve Ayırım 9. oluşumu

1. Daha önce (bölüm 4) tarif edildiği gibi kristalleştirme için, C12M LTR yükseltici afinite kromatografisi ile SERT _CC saflaştırılması.
2. Trombin ile Özet etiketleri çıkarmak için (1: ağırlık / ağırlık, 100) ve EndoH O (1:10 a / a) / RT N. 10 mg / ml bir protein konsantrasyonuna 100 kDa'lık bir MWCO santrifüj proteini konsantratör kullanılarak 300 uL - 250 için konsantre edilir.
3. 1 bir mol oranında Fab ile konsantre SERT karıştırın: 1.2 500 uL daha az bir hacim içinde. 20 dakika boyunca 4 ° C'de 100,000 x g'de santrifüjleyin. SERT-Fab kompleksi içeren süpernatant toplayın. Sil pelet.
4. TBS içinde dengelenmiş bir ebat eksklüzyon kolonu üzerinde FPLC ile Boyut Dışlama Kromatografisi (SEC) ile ayrı n-oktil-β-D-maltozit 40 mM (C8M), 0.5 mM CHS,% 5 gliserol, 25 uM lipit (Aynı durum ile desteklenmiş aşama 4.5) ve 0.5 mL / dakika, 1 uM G -citalopramın bölgesindeki.
5. 0.5 mL kesirler toplamak ve 4 analiz -% 15 SDS-PAGE jelleri yanı sıra SEC tarafından triptofan floresan. GFP SERT, bir SDS-PAGE jeli üzerinde de yaklaşık 80 kDa çalışır etiketli. termini çıkarılması ve N-bağlantılı şekerlerin sonra bir 45 kDa proteini olarak çalışır.
6. detefraksiyonlar triptofan floresans SEC tarafından fraksiyonlarının analizi ile belirlendiği üzere tek dağılımlı sadece kısımların havuzlanmasıyla birleştirmek rmine (eksitasyon: 280; emisyon: 335 nm).
7. Mağaza 1 hafta kadar 4 ° C 'de SERT-8B6 kompleksi saflaştırılmıştır.

Drop Asma tarafından Transporter-antikor komplekslerinin 10. Kristalizasyon

1. kristalleştirme öncesinde, 100 kDa'lık bir MWCO santrifüj proteini konsantratör kullanılarak 2 mg / mL Sert-8B6 kompleksinin SEC ayrılması elde edilen pik fraksiyonların konsantre. 280 nm 'de 2 AU absorbans 1 mg / mL kadardır.
2. 1 oranında ek Fab ekleyin: 0,05 kompleksi: ücretsiz Fab. 10 mcM ücretsiz S -citalopram ekleyin.
3. 20 dakika boyunca 4 ° C'de 100,000 x g'de santrifüjleyin. SERT-Fab kompleksi içeren süpernatant toplayın. Sil pelet.
4. Tablo 1 'e göre olan 4 ° C' de asılı damla 24 oyuklu ekranı ayarlayın. Rezervuar çözümler üzerinde kırılma kalitesi kristallerinin oluşması125 mM KCI, 32.5 - -% 34 PEG 400 ve% 0.5 6-aminoheksanoik asit, 100 mM Tris-NaOH, pH 8.5, 25 ihtiva etmektedir.
   Not: bir tampon, pH 8.5'e NaOH ile ayarlandı kullanımlar Tris. HCl ile ayarlanmış Tris baz kullanmayın. Ekran 2 ml tüpler hazırlanan ve bitene kadar kullanılabilir. doğru son derece viskoz olduğu gibi pozitif deplasmanlı pipet kullanarak PEG 400 pipetle için dikkat!
   1. her bir tatbik sızdırmazlık maddesi ile düşük profilli 24 kuyulu bir levhadaki her rezervuar çözeltisi pipetle 500 uL. Pipet 1.5, 1.75 ve 18 mm'lik silikonlu cam kapak slip üzerine SERT-8B6 kompleksinin 2 uL. Protein numunesi üzerine rezervuar çözeltisi pipetle 1 pL.
      NOT: levha zaten kuyu kenarına uygulanan dolgu ile satın alındı.
   2. rezervuar çözümü bakacak damla 24-kuyuya kapak slayt uygulayın ve dolgunun her kuyuya önceden uygulanan üzerine kapak kayma basarak hemen kapatın.
   3. 24-kuyu kurulmuştur kadar devam edin.
   4. 4 ° C 'de, iyi izole edilmiş bir odada mamul levha bırakın. En az 3 gün boyunca plakaları rahatsız etmeyin
      NOT: Tek kristaller yaklaşık 3 gün içinde ortaya çıkar ve 14 gün sonra 100-175 um büyüyecektir.
5. Hasat cryoloops kristaller ve önceki X-ışını difraksiyon verileri toplama sıvı N ₂ ile doğrudan flaş-soğutun.
6. Gerekirse, asılı damla geniş tarama ek kristalleşme koşullarını bulabilirsiniz. 2 Yağışlı oranları: 1, 1.5: 1, 1: protein ile üç damla kullanın 1. Robot mevcut ise, o zaman 100-150 nL, 96 oyuklu bir plaka içerisinde rezervuar çözeltisi üzerinde 70 ul damla ayarlayın. Büyük 3D kristaller 24 kuyularda yetiştirilebilir.
7. damla görünümünü dayalı Puan: 0, berrak; 1, toz; 2, taneli çökelti; 3 faz ayrılması; 4, mikrokristalin; 5, iğneler; 6, tabaklar; 7, 3D kristaller.
8. yeni tanımlanan koşul etrafında yukarıda açıklandığı gibi 24 kuyularda damla yöntemleri asarak kristalleşmesini kurmakitions.

Sonuçlar

SERT _TC arka planda tek nokta mutantlar bir kütüphane mutasyonlarını termo ekranına oluşturuldu. Bağımsız mutantlar standart mutagenez kullanılarak elde edilmiştir. Şekil 1A tarif edilen tarama programı geçici hızlı kimlik kristalleştirme için yararlı mutasyonlara HEK293S hücreleri ve bir sintilasyon yakınlık tabanlı termostabilite ekran transfekte kullanmaktadır. Çizim Tm değerleri bağlı ^[3H] oda sıcaklığında sitalopram, yüksek termostabilite ve sentezleme seviyeleri, uygun olan yapılar ortaya karşısında protein saflaştırma için (Şekil 1B). Üç mutant (Y110A, I291A ve T439S) son derece stabil bir yapı (Şekil 1C) oluşturmak üzere bir araya getirilmiştir. Termostabilitesini ayrıca SERT-Fab kompleksinin kristalleşme için gerekli kısa zincirli deterjanlarda artan istikrar ile ilişkilidir.

baculovirüs-tr kullanılarak insan SERT büyük ölçekli ekspresyonuansduced HEK293S GnTI ^- hücreleri en az 2 hafta sürebilir ve Şekil 2A'da gösterildiği gibi, miligram miktarları üretebilir. GFP etiketli SERT _CC proteininin kullanımı SERT uygun floresan (Şekil 2B) ile ekspresyonu ve saflaştırılması sırasında takip edilebilir. ; Stabilize edici bir lipid olarak CHS mevcudiyetinde C12M hücrelerin ^- Bizim saflaştırma stratejisi 1) HEK293S GnTI S -citalopramın bağlı SERT çözünürlüğünü dahil 2) Strep afinite matrisi Sert bağlanması; Kapsamlı yıkama ile kirletici madde proteinlerinin 3) kaldırılması; ve 4) tamponu ihtiva eden destiyobiyotin (Şekil 2C) fonksiyonel SERT elüsyonu. FSEC (Şekil 2D, E) ile değerlendirildiği gibi Elüt edilen protein, büyük ölçüde, Coomassie mavi boyanması yolu ile, diğer tespit proteinlerin serbest ve tek dağılımlı olduğunu.

Benzer bir strateji, reconstitutio için kullanılan bir Strep II etiketiyle SERT saflaştırmak için alındın ve aşılama (Şekil 3A, B). proteoliposomes halinde SERT eklenmesi SERT serum yarı-ömrü ve stabilitesini artırır ve yüksek afıniteli antikorların izole edilmesi ihtimalini arttırır. Bundan başka, lipid A dahil, bakteri hücre duvarının bir bileşeni olan güçlü bir yardımcı madde ⁹ olarak hizmet eder. Çok katmanlı lipozomlar cam tüplerde bir kurutulmuş lipid karışımına tampon maddesinin eklenmesi ile hazırlanmış ve tampon maddesi içinde yeniden süspansiyona alınmıştır. 200 nm gözenek büyüklüğü filtrelerden lipozomların Ekstrüzyon tek dağılımlı tek lamelli lipozom süspansiyonları üretir. Lipozomlar daha sonra deterjan saflaştırılmış SERT ilave edilir deterjan ile doymuştur. deterjan karışımı: Son olarak, deterjan lipide hidrofobik emici reçinenin eklenmesiyle kaldırılır. Ek ligand antidepresan bağlı yapısını tanıyan antikorları seçmek için yeniden örnek eklenmelidir. proteoliposomes içinde SERT varlığı ile teyit edilmelidirSDS-PAGE yükleme boya veya C12M olan küçük bir örnek çözündürülmesi ve SDS-PAGE ve FSEC (Şekil 3C, D) üzerinde çalışan.

SERT antikorları eksprese eden hibridoma hücre çizgileri 3D epitopları tanıyan yüksek afiniteli bağlayıcılar için taranabilir. Antikor sıkıca homojen, iyi sıralı etki kristal ambalaj teşvik etmek yapılandırılmış bölgeye bağlı kalmalıdır gibi bu özellikler, kristalleşme nihai başarısı için çok önemlidir. İlk adımda, yapısal olmayan bölgeleri tanıyan antikorlar tanımlanmıştır. SERT denature edilir ve bir nitroselüloz zarı üzerine beneklendirilmiştir; denatüre SERT bağlanan antikorlar batı-pozitif ve büyük olasılıkla lineer epitopları tanıyacaktır. Şekil 4A, biz batı-pozitif ve crystallogenesis teşvik etmek olası yararlı değildir antikorların 2 örneklerini göstermektedir. Şekil 4B'de, diğer Batı negatif antikorlar 100 nM SERT-GFP ile kuluçkaya yatırılır ve ayrılmışFSEC. SERT önceki bir konuma GFP pozitif tepe kayacak bağlayan antikorlar. SERT-antikor kompleksleri FSEC ile analiz ardından nanomolar afinite ile bağlanan belirlemek için başka deterjan seyreltilebilir. yapısal taşıyıcı değişiklikleri ve böylece antikorlar serotonin sonuçları eklenmesi de özellikle SSRI bağlı yapısını kabul belirlemek için tekrar elenebilir edilebilir. Şekil 4C'de, antikorlar, epitop (lar) ilişkili bir durumu substrat SSRI arasında değişmez gösteren serotonin mevcudiyetinde SERT bağlandığı gösterilmiştir. Son olarak, Şekil 4D'de antikorların kombinasyonları daha sola doğru bir kayma ile sonuçlanır, apayn epitopları bağlanma yetenekleri açısından test edilir. Burada 15B8 veya 8A11 antikorlar 8B6 farklı bir epitopu tanır.

8B6 antikor papain Akne tedavi edici ile ön kristal tarama dayalı daha fazla yapısal analiz için seçildited Fab. 8B6 Fab genler, bir böcek hücresi sentezleme vektörüne klonlanmıştır. Fab ifade süspansiyon içinde büyüyen Sf9 hücrelerinden salgılanabilir. 8B6 Fab His-tag afinite (Şekil 5a, b) ve SDS-PAGE jelleri üzerinde yabancı maddelerden arındırılmış görünen protein elde katyon değişim kromatografisiyle (Şekil 5C, D) Sf9 hücre yüzer saflaştırılabilir. Şekil 5E'de, yeniden birleştirici 8B6 Fab SERT bağlandığı gösterilmiştir ve sonraki biyokimyasal ve biyofiziksel deneylerde kullanılır.

Eğilim saf hale getirilmiş SERT _CC trombin ve EndoH ile sindirilmiş ve S -citalopramın mevcudiyetinde bir kompleks oluşturmak için 8B6 Fab ile karıştırılır. Taşıyıcı-antikor kompleksi, daha sonra C8M (Şekil 6A) SEC ile ayrılır ve SDS-PAGE (Şekil 6B) ile gösterildiği gibi, en yüksek fraksiyonlar eki ve Fab ikisini de içerir. C8M kullanımı kristal oluşumu muhtemelen için çok önemlidirkısa zincirli deterjan kristal kafes içinde moleküller arasında daha iyi ambalaj sağlar. FSEC kristalizasyon için toplanmış hangi fraksiyonlar belirlemek için kullanılmıştır (Şekil 6C); tek dağılımlı değildir ve / veya serbest SERT veya Fab büyük miktarlarda içeren fraksiyonlar kombine edilmemelidir.

Prizma şeklindeki SERT-antikor kristaller damla buhar difüzyonu (Şekil 7A) asılarak Bu protokol kullanılarak S -citalopramın mevcudiyetinde yetiştirilebilir. Oluşan kristaller 3.15 Å ¹⁰ (Şekil 7B) bir çözünürlük X-ışınları yaymak.

Şekil 1:. Sintilasyon Termostabilite Deneyi A Yakınlık tabanlı. ^[3H] sitalopram. B mevcudiyetinde termostabilite taranması için protokol bakış. En bağlanmış ^[3 (Tm) karşı destek> H] sitalopram. Noktalı çizgiler WT taşıyıcısı değerlerini temsil etmektedir. 3 En termostabil mutantlar etiketlenir. Gri alanı nedeniyle düşük sinyal-gürültü. C WT ve dolayısıyla doğru olmayan Tm değerlerine kıyasla bağlanan ^[3H] sitalopram% 10'dan daha az olan mutantlar temsil eder. WT SERT _TC ve ilk 3 mutantlar için termostabilite eğrileri. Hata çubukları standart sapmayı (SD) temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2:. Memeli Heterolog Protein Ekspresyonu A Genel Bakış. HEK293S GnTI içinde BacMam virüs üretimi ve SERT ifade şematize bakış ^-. Hücreler B. HEK293S GnTI ^-. SERT _CC (GFP floresans) Cı ifade eden hücreler. Strep afinite reçine SERT _CC elüsyon profili. % 100 (0 - - 5 mM) D. Yeşil iz destiyobiyotin konsantrasyonunu, 0 temsil eder. % 15 SDS-PAGE jeli e -. 4 üzerinde yakınlık saf hale SERT _CC analizi. GFP floresans tespit afinite saflaştırılmış SERT _CC FSEC (eksitasyon: 480 nm; emisyon: 510 nm). 15 mL akıtılarak zirve SERT (#) ve 18 ml ücretsiz GFP (*) 'dir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3:. SERT _IC A Temsilcisi Affinity Arıtma ve Sulandırma. Antikor nesil şematik bakış. B. Elüsyon profili Strep afinite reçinesi üzerinde SERT _IC afinite saflaştırma 280 nm'de gözlendi. % 100. (0 - - 5 mM) C yeşil iz destiyobiyotin konsantrasyonunu, 0 temsil eder. Afinitesi analizi saf hale getirilir ve bir 4 SERT yeniden -% 15 SDS-PAGE jeli D.. yeniden çözme aşamalarından sonraki çözündürülmüş SERT'in FSEC. Triptofan artıklarının floresan SERT (: 280 nm; Emisyon: Uyarma 335 nm) tespit etmek için kullanılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4:. Temsilci SERT Antikorların Analizi. Western blot ile antikorların taranması. Yaklaşık 1 mikrogram GFP ile veya olmadan SERT _CC 4 uygulandı -% 15 SDSPAGE jel ve bir nitroselüloz zarı üzerine beneklendirilmiştir. Bağlama IR boyası konjüge edilmiş bir keçi anti-sıçan antikoru kullanılarak tespit edildi. 2G4 ve 10F2 batı olumlu. B bulunmaktadır. FSEC 100 nM GFP etiketli eki ve algılama antikorların bağlanma GFP floresan kullanılarak tespit edildi. C. 1 mM serotonin. D varlığında 100 nM GFP etiketli Sert seçilen Fab'ların bağlanması. 8A11 ve 15B8 Fab'ın bağlanma SERT-8B6 için Fab. 18 mL akıtılarak minör zirveleri ücretsiz GFP vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5: Sf9 hücrelerinden 8B6 Fab'ın Örnek saflaştırılması için uygun değildir.. Elüsyon profili His-tag afinite kromatografisi yolu ile 8B6 Fab saflaştırılması 280 nm'de gözlenmiştir hy. % 50 (0 - - 250 mM) B. Yeşil iz imidazol konsantrasyonunu, 0 temsil eder. Indirgeyici olmayan ve His-etiketi afinite saflaştırmadan sonra, SDS-PAGE jeli azaltır. 50 kDa yakınına kadar protein indirgenmemiş Fab (#) ve kDa Fab (*). C azalır 25 ° küçük bir türdür. Elüsyon profili, doğrusal bir sodyum klorür gradyanı altında elüt edilmektedir tek simetrik tepe gösteren katyon değişimiyle 8B6 Fab saflaştırılması 280 nm'de gözlendi. % 100. (0 - - 500 mM) D yeşil iz NaCl konsantrasyonu, 0 temsil eder. Katyon değişim. E ile saflaştırma sonrasında% 12.5 SDS-PAGE jeli üzerinde 8B6 Fab analizi. GFP floresan kullanılarak tespit, 10 nM GFP etiketli SERT için 8B6 Fab bağlanması. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

e 6 "src =" / files / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg "/>
Şekil 6:. Varlığı S -citalopram A SERT-8B6 Kompleksi'nin Temsilcisi Jel Filtrasyon Kromatografisi. saflaştınldı SERT-8B6 kompleksinin Jel filtrasyon elüsyon profili. 11.5 mL elüsyon ana pik SERT-8B6 kompleksidir. 15 tepe -. 17 mL GFP ve Fab B içerir. % 15 SDS-PAGE jeli - 4 üzerinde saflaştırıldı SERT-8B6 kompleksi analizi. SERT ve Fab ağır ve hafif zincirlerinin pozisyonları tire. C ile gösterilir. beden ayrılan fraksiyonların FSEC. SERT-8B6 kompleksleri triptofan floresan kullanılarak tespit edildi. Fraksiyon 17 Fab ile kompleks vermedi SERT daha büyük bir miktarda içerir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7:. S -citalopram A Bound SERT-8B6 Kompleksinin Kristalizasyon. büyüme 2 hafta sonra SERT-8B6 kompleksinin paralel yüzlü şekilli kristallerin ışık mikroskobu. Ölçek çubuğu 200 mikron. B eşittir. SERT-8B6 kristalleri 3.15 Å X-ışınları yaymak. Mavi halka 3.15 Å temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1:. S -citalopramın Bound SERT-8B6 Kompleksi için bir Kristalizasyon Ekranı Bu tabloyu indirmek için tıklayınız.

Tartışmalar

Biyofiziksel tekniklerle membran proteini yapısının belirlenmesi, birçok tıbbi önemli taşıyıcıları, reseptörler ve kanallar ¹¹ için zor bir girişim olarak kalır. Burada S -citalopramın bağlı insan serotonin taşıyıcı yapı tayini için geliştirilen ayrıntılı uzmanlık paylaşır. Biz bu yöntemlerin diğer yapısal durumları yanı sıra diğer zor zar proteinlerinin yapılarda SERT yapılarının yararlı olacağını tahmin ediyoruz. Bundan başka, burada açıklanan biyokimyasal teknikler aynı zamanda, deterjan saflaştırıldı eki ve bir yakın yerel lipid ortam işlevi çalışmak için de kullanılabilir.

SERT kristalleşme birkaç araç ve tekniklerin geliştirilmesi üzerine menteşeli. İlk olarak, taşıyıcı termo gelişmeler membranların ⁶ taşıyıcı çıkarma aşağıdaki çeşitli deterjan miseller iyi davrandım SERT varyantları üretti. İkincisi, kullanımsaflaştırma ve kristalizasyon boyunca yüksek afiniteli ligandı S -citalopramın daha da geliştirilmiş kararlılık ve düşük yapısal heterojenite. Üçüncü olarak, aşılama ve kristalleşme hem de kolaylaştıran 2 hafta gibi kısa bir süre içinde SERT büyük miktarlarda üretimi için izin BacMam sentezleme sistemi ⁷ geliştirilmesi. Son olarak, stratejilerinin geliştirilmesi kristaller halinde SERT-antikor komplekslerinin iyi sıralı ambalaj teşvik 8B6 antikorunun keşfine izin 3D epitopları tanıyan yüksek afiniteli antikorların seçilmesi için.

genellikle protokol boyunca meydana gelen kritik adımlar ve reaktifler yanı sıra ortak bir takım sorunlar vardır. İlk olarak, yüksek titre SERT P2 virüsün üretimi sorunlu olabilir. Bu protokolde tarif edildiği gibi P2 virüs üretmek için P1 virüsünün düşük konsantrasyonlarda eklemek genellikle bu sorunu ortadan kaldıran, ve P2 Virüs titresi düşük olduğu durumlarda, P3 virüsü usin yapılabilir0.0001 bir MOI'da g virüsü. 1 x 10 ⁸ virüs partiküllerinin daha düşük bir titreye sahip bir virüs / ml kullanılmamalıdır ve hemen hemen her zaman düşük protein verimine neden olur. Ekspresyon için, HEK293S GnTI ^- bunlar N kompleks N -glycans sentezleyemediği dolayısıyla I aktivitesini -acetylglucosaminyltransferase ve eksik olur hücreler yerine, yalnızca yüksek mannoz N -glycans üreten seçilmiştir. EndoH böler N asparajin bağlı bir N -acetylglucosamine bırakarak hücre dışı döngü 2 (EL2) iki noktada yüksek mannoz glikanların glikozilasyon -bağlı. N sindirimi şekerler kristalleştirme için olası önemli El2 yüzey entropi azaltır -bağlı. Antikorların üretimi için, SERT _IC immünizasyon için kullanılmalıdır. GFP ¹² yüksek oranda immünojenik ve tamamen SEC tarafından çıkarılması zor olduğu için antikorların üretilmesi için, bir füzyon etiket olarak kullanılmamalıdır. SERT esnek N- ve C-terminali de değildiBu bölgelerin karşı antikor önlemek için bir yapı da yer almaktadır. Fareler yeniden oluşturulmuş proteinin 30 ug ile immünize edilebilir; antikorların yüksek serum konsantrasyonları tespit edilmeye kadar immünize fareler devam tarif ¹³ hibridoma hücrelerinin üretilmesi. Bir thermostabilized yapı genellikle aşılama için en iyi seçimdir; taşıyıcı iyi davrandım ve arıtma için aşağıdaki biyolojik aktivitesini muhafaza, bu genellikle antikorları geliştirmek için yeterli olmaktadır. 8B6 antikoru WT SERT karşı büyüdü. kristalizasyon için FSEC ile değerlendirildiği gibi tek dağılımlı kompleksini ihtiva SEC sadece pik fraksiyonlar bir araya getirilmiş ve konsantre olmalıdır. SERT-8B6 kristalleri koşullar dar bir aralıkta büyür ve özellikle SERT kristal büyümesi ile ilgili sorunları gidermek için alınması gereken adımların bir dizi vardır. HCI ile ayarlanmıştır Tris baz, bu tampon, kristal büyümesini desteklemez, rezervuar çözeltisi içinde kullanılmamalıdır; böylece CRI olduğukortikal yerine NaOH ile ayarlanmıştır Tris kullanımı. Kristaller uzamıyor veya çok sayıda küçük kristaller gözlenir ise, PEG 400 konsantrasyonda bile küçük bir artış veya azalış tavsiye edilir eğer öyleyse SERT kristalleri, PEG 400 dar bir konsantrasyon aralığında büyür. Bundan başka, ilave 6-aminoheksanoik asit, aynı zamanda, nükleasyon artırmak için optimize ekran kullanılmıştır. Protein damla oranı: de bir çözüm de, kristal büyümesi için önemli bir belirleyici faktör olduğunu. tipik olarak daha büyük bir 3 boyutlu kristallerin büyümesine destek 1: 2 daha yakın açılan oranları önerilmektedir 1: 2 - 1.5 oranlarını bırakın. Son olarak, düşük profil 24 oyuklu plakalar kullanımı ki tahminen bu, buharı difüzyon hızının değiştirilmesi için, kristal büyüme yönünde çok önemlidir.

SPA yöntemine alternatif bir yaklaşım, tahlil ⁵ bağlayıcı filtre kullanılarak kokaine bağlı konformasyonunda sıçan serotonin taşıyıcısını stabilize mutantlar için ekrana geliştirilmiştir. Buna karşılık, SPA baSED deney ligandına bağlı kalır SERT fraksiyonunun belirlenmesi ile, sırasıyla aşağıdaki ısıtma adımları sağlar. Bu nedenle, bu örneklerin az sayıda erime sıcaklığının hızlı bir şekilde belirlenmesine izin verir. SPA yöntem radyo-etiketli yüksek afiniteli bir ligandın varlığına dayanır ve herhangi bir ligand submikromolar afınite ile bağlanan, bilinmektedir sonra alternatif bir yaklaşım, gerekli olacaktır. Birçok diğer yöntemler yaygın olarak bu tür floresan boyalar ve kalorimetri ¹⁴ bağlayıcı protein stabilitesini ölçmek için kullanılan, ancak, düşük-verimlilik ve işlevi doğrudan ölçülmesi veya yüksek miktarda protein gerektirecek ya edemiyoruz vardır. SPA yöntem kullanılabilir olamaz, alternatif bir yüksek verimli bir yaklaşım, örnek taşıyıcı kalan fraksiyonunun ayrılması ve ardından ısıtılan bir FSEC tabanlı Termostabilite Deney ¹⁵ (FSEC-TS) vardır. FSEC-TS kromatografik davranış ve oligomerik durumunu erişmek için kullanışlı bir yaklaşım ve ApSPA yöntemiyle birlikte kullanılabilecek owerful tamamlayıcı bir araç.

Çeşitli ortak protein ekspresyon sistemlerinin bir karşılaştırma da SERT ifadesi ¹⁶ için memeli hücrelerinin kullanımı tercih bulunmuştur ve şaşırtıcı Bu büyük olasılıkla, memeli kökenli birçok proteinler için geçerlidir. Biz ifade için kullanılan metodlar SERT için uyarlanmış ancak büyük olasılıkla kolayca adapte edilmiştir. yüksek ifade seviyeleri tercih şartlar dikkatli bir şekilde, örneğin sodyum bütirat histon deasetilaz inhibitörleri sentezlenmesi, sıcaklık, virüs konsantrasyonu ve varlığı süresi değiştirilerek belirlenmelidir.

Genellikle bağlanmadan önce yüksek afiniteli bir ligandın tutmak için yeniden-teşekkül ettirilmeden CHS birlikte böyle C12M gibi hafif bir uzun zincirli deterjan afinite saflaştırma lehinedir. hidrofobik emilimini kullanarak Sulandırma biz birkaç diğer nakliyecilere ve alıcıları için etkili olduğu bulduk hafif bir tekniktir. Eğer budiyaliz, seyreltme, veya sek. yüksek kritik misel konsantrasyonu ile deterjan çıkarılması ¹⁷ antijeni deterjanlar içinde yeterince kararlı olarak temin başarılı kullanılabilir değildir. Uygun bir antikor bulunan durumlarda, hemen hemen her zaman sorun işlevi veya antijen denatürasyon kaybı nedeniyle ve bu gibi durumlarda başarıyla protein biyokimyası özel dikkat yeni aşılar uygulandı bulabilirsiniz. Son olarak, yüksek bir afinite ile bağlanan ligandlar ve antikorlar, bir rasyonel olarak planlanmış kristalizasyon deney için bir temel oluşturacaktır ve ısıya dayanıklı bir varyantın yararlanarak, biri farklı deterjanların özellikleri değiştirilerek koşullarının geniş bir aralıkta tarayabilir. Bundan başka, bir lipidik mezofaz ¹⁸ kristalleştirme veya bicelles ¹⁹ kullanılarak her miseller kristalleşme alternatif olarak düşünülmelidir.

Bu ilkeler ve yöntemler bazı modifi ile kullanılabilirifade ve diğer ekspresyon ana den saflaştırmak ve yüksek afiniteli ilaçların hedeflerinden yapı tayini için özellikle faydalı olacaktır zor olan diğer zar proteini için bir katyondur.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DH10Bac	Invitrogen	10361-012
Kanamycin	Fisher	BP906-5
Gentamicin	Fisher	BP918-1
Tetracycline	Sigma	T-7660
Bluo-gal	Invitrogen	15519-028	5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside
Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside	Anatrace	I1003	IPTG
Miniprep kit	Qiagen	27106
Cellfectin II	Invitrogen	10362-100	Sf9 transfection reagent
Sf9	ATCC	CRL-1711
Sf-900 III SFM media	Life Technologies	12658-027
HEK-293S GnTI-	ATCC	CRL-3022
Freestyle 293 media	Life Technologies	12338-018	293 expression media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	0984018DJ
Sodium butyrate	Sigma	303410
S-citalopram	Sigma	E4786	Anagrade
n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside	Anatrace	D310
Cholesteryl hemmisuccinate	Sigma	C6013
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850457P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine	Avanti Polar Lipids	850757P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol	Avanti Polar Lipids	840457P
Leupeptin	Sigma	L2884
Pepstatin A	Sigma	P5318
Aprotinin	Sigma	A1153
PMSF	Sigma	P7626
Desthiobiotin	Iba Life Sciences	2-1000-05
Asolectin	Sigma	11145
Cholesterol	Sigma	C-8667
Lipid A	Sigma	L5399
Brain polar lipid	Avanti Polar Lipids	141101C
Biobeads	Biorad	152-3920	Hydrophobic absorption resin
Goat anti-mouse IRDye 680RD	Odyssey	926-68070	Used as secondary antibody for western blotting
Lauryl maltose neopentyl glycol	Anatrace	NG310	Anagrade
Serotonin	Sigma	H9523
pFastBac 8B6			Available from authors
pEG Bacmam SERT Strep II			SERTIC, Available from authors
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His			SERTTC, Available from authors
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His			SERTCC, Available from authors
Imidazole	Sigma	56749
n-Octyl β-D-maltoside	Anatrace	O310	Anagrade
Thrombin	Haematologic Technologies	HCT-0020
EndoH	New England Biolabs	P0702
Trizma-HCl	Sigma	T5941	Tris is used for preparation of crystallization reservoirs
PEG 400	Sigma	91893
6-aminohexanoic acid	Sigma	7260
Trypsin-EDTA	Fisher	MT25052CV
Isoplate-96 TC	PerkinElmer	6005070
PolyJet	SignaGen	SL100688	Polymer transfection reagent for mamalian cells
Copper HIS-Tag YSI SPA Beads	PerkinElmer	RPNQ0096	His-tag affinity SPA beads
Citalopram, [N-Methyl-3H]	PerkinElmer	NET1039250UC
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023	heating block for thermostability assay
ThermoTop	Eppendorf	5308000003
SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates	Eppendorf	5306000006
0.2 µm syringe filter	Olympus Plastics	25-243
1 L filter system	Corning	430517
2 L flat bottom tissue culture flask	Genemate	F-5909-2000
2 L baffled tissue culture flask	Genemate	F-5909-2000B
CO2 incubator	Thermo Scientific	3950
Forma Orbital Shaker	Thermo Scientific	416
Strep-Tactin resin	Iba Life Sciences	2-1208-025	Strep affinity resin
Extruder	Northern Lipids
Li-Cor imaging system	Odyssey		western blot imaging system
XK16 column	GE Healthcare	28-9889-37	column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton
100 kDa MWCO protein concentrator	Millipore	UFC910096
30 kDa MWCO protein concentrator	Millipore	UFC903024
Äkta FPLC	GE Healthcare	UPC-900
HPLC	Shimadzu	51476
Superose 6 (10/300) column	GE Healthcare	17-5172-01	Used for FSEC
Tangential flow apparatus	Pall Filtron
0.2 µm filter tangential flow cell	Pall Filtron	PSM20C11
30 kDa MWCO tangential flow concentrator	Pall Filtron	OS030T12
Talon resin	Clonetech	635504	His-tag affinity resin used for Fab purification
1 mL HiTrap SP column	GE Healthcare	17115101	Cation exchanger used for Fab purification
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17-5175-01	Used for SEC separation of SERT-8B6
24-well VDXm plate	Hampton Research	HR3-306
18 mm coverslips	Hampton Research	HR3-239
Virocyt virus counter	Virocyt	2100
MicroBeta Trilux	PerkinElmer	1450	96-well scintillation counter
HiTrap SP column	GE Healthcare	17115101
Sertraline	Sigma	S6319