تصور آثار البلغم للتنمية بيوفيلم باستخدام نموذج غرف ساترة

Summary

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Abstract

تتكون الأغشية الحيوية من مجموعة من البكتيريا المغطى في مصفوفة يفرز النفس. أنها تلعب دورا هاما في التلوث الصناعي وكذلك في تطوير واستمرار العديد من الأمراض المتصلة بالصحة. تحدث أحد الأغشية الحيوية صفها وصفا جيدا ودرس في الأمراض التي تصيب البشر في عدوى الالتهاب الرئوي المزمن من مرضى التليف الكيسي. عند دراسة الأغشية الحيوية في سياق المضيف، يمكن أن العديد من العوامل تؤثر تشكيل بيوفيلم والتنمية. من أجل تحديد مدى العوامل المضيفة قد تؤثر على تشكيل بيوفيلم والتنمية، استخدمنا طريقة ساترة تشامبيريد ثابت للنمو الأغشية الحيوية في وجود عوامل المستمدة من المضيفة في شكل supernatants البلغم. هي المصنفة البكتيريا في غرف ومعرضة للالرواشح البلغم. وبعد 48 ساعة من النمو، هي ملطخة الأغشية الحيوية مع بيوفيلم مجموعة الجدوى التجارية قبل الفحص المجهري متحد البؤر والتحليل. وبعد الحصول على الصور، والخصائص بيوفيلم يمكن تقييم استخدام منصات البرمجيات المختلفة.هذا الأسلوب يسمح لنا تصور الخصائص الأساسية للنمو بيوفيلم في وجود مواد مختلفة بما في ذلك المضادات الحيوية.

Introduction

الأغشية الحيوية البكتيرية هي مجموعات من الكائنات الحية الدقيقة التي تعلق على بعضها البعض، والمغطى في مصفوفة يفرز النفس. ^1،2 كلاسيكي، إلا أنها تمثل البكتيريا تعلق بدنيا لسطح اللاأحيائي أو الحيوية شكلت في ظل ظروف التدفق. وقد تبين أيضا الأغشية الحيوية للنمو في ظروف ثابتة (غياب تدفق) والقاصي من السطوح، مثل في واجهة الهواء السائل من الحمامات الحرارية أو pellicles شكلت في أنابيب الاختبار. منذ فترة طويلة التعرف على هذه الأغشية الحيوية في البيئة وهم اذى رئيسيا في العمليات الصناعية، كما أنها يمكن أن تشكل في خزانات المياه أو في الأنابيب، مما أدى إلى biofouling والتآكل والعقبات. ^3،4

الأغشية الحيوية هي أيضا حاسمة في مرافق الرعاية الصحية، كما ثبت أن تشارك في العدوى المرتبطة القسطرة، والالتهابات الرئوية في مرضى التليف الكيسي، وكذلك في التهابات أخرى عديدة. ^5،6 واحدة من السمات المميزة لالتهابات بيوفيلم هي ديمجعدة قابلية البكتيريا للمضادات الحيوية وضعاف إزالة من قبل النظام المناعي الفطري. ^7-9 درست معظم جيدا، والسيناريوهات ذات الصلة سريريا تنطوي عدوى القائم على بيوفيلم يحدث في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي (CF)، المصابين المزمنين مع الأغشية الحيوية الزنجارية الزائفة. الزائفة الزنجارية يمكن أن يخضع لعدد من التغييرات خلال إنشاء عدوى مزمنة تجعل من الصعب جدا لعلاج. يمكن ^10،11 الأغشية الحيوية تفعيل تفاضلي المناعة الفطرية ودفع الالتهاب. ^12-14 وهذه الالتهابات تؤدي إلى زيادة معدلات الاعتلال والوفيات في مرضى التليف الكيسي، فمن الأهمية بمكان أن نفهم العوامل التي يمكن أن تؤثر على التنمية بيوفيلم في هذا السياق.

وتشير دراسة حديثة إلى أن العوامل المضيفة هي الحاسمة في تشكيل المجاميع بيوفيلم الزائفة الزنجارية. وتساهم ¹⁵ هذه الأغشية الحيوية لتقليل التعرض للمضادات الحيوية وآليات دفاع المضيف. وبريسيالامتحانات التنافسية الوطنية من العوامل المستمدة من المضيفة، كالإيلاستاز العدلة، فضلا عن المنتجات يفرز من الكائنات الدقيقة الموجودة في CF الرئة، لديها القدرة على تعديل إلى حد كبير تشكيل بيوفيلم والتنمية. ¹⁶ وبالإضافة إلى ذلك، الأغشية الحيوية تتفاعل مع المضيف لتعديل تعبير عن العديد من الممرات وبدء الالتهاب. في حين أساليب إنتاجية عالية، مثل معيار فحص الكريستال البنفسجي، يمكن أن توفر بعض المعلومات فيما يتعلق بعملية بيوفيلم، والتصور للبيوفيلم ردا على هذه العوامل توفر مزيد من المعلومات المتعمقة.

في هذه المخطوطة وصفنا طريقة لاستخدام عوامل من البلغم من المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي لدراسة تطوير الأغشية الحيوية في المختبر. وتسمح هذه الطريقة لتصور السريع الأغشية الحيوية تتعرض لعوامل المضيف البلغم التي تحتوي على استخدام عدة قابلية بيوفيلم التجارية. هذه التقنية يمكن استخدامها لتحديد بصريا التغييرات التي تحدث أثناء نمو بيوفيلم في وجود exogenoلنا المنتجات، ويمثل طريقة تحسين لتحليل التغيرات في التنمية بيوفيلم في ظل ظروف مختلفة.

Protocol

لاحظ أن بحوث أخلاقيات المجلس (جندي كونفدرالي) مطلوب لجمع وتخزين عينات البلغم من البشر. تمت الموافقة على هذه الدراسات من قبل مستشفى المرضى الأطفال REB # 1000019444.

1. إعداد عينات البلغم CF

1. جمع عينة البلغم من المرضى خلال الزيارات الروتينية للعيادة التليف الكيسي والحفاظ على الجليد.
2. نقل عينة البلغم على الجليد في غضون الساعة الأولى من جمع، إلى مختبر للأبحاث، إلى الخضوع لمعالجة.

2. معالجة البلغم

1. سجل حجم عينة البلغم الحصول عليها. إضافة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى 2x حجم العينة (أي 2 أجزاء PBS، 1 جزء العينة).
2. خلط العينة بشكل جيد مع ماصة نقل. دوامة العينة على أعلى الإعداد لمدة 1 دقيقة لخلط تماما.
3. قسامة 1 مل من الخليط المذكور أعلاه في عدد 1.5 مل أنابيب microcentrifuge المناسبة وتدور باستمرار في 5000 x ج ل20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
4. بعد الطرد المركزي، وإزالة طاف وتجاهل بيليه.
5. فلتر تعقيم طاف من خلال مرشح 0.22 ميكرون وجمع في أنبوب microcentrifuge نظيفة.
   ملاحظة: يتم اختبار العقم من الترشيح من قبل الطلاء على LB أجار وبتلقيح السائلة وسائل الإعلام.
6. تخزين طاف البلغم في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
   ملاحظة: البلغم من يمكن أيضا تجميع المرضى متعددة بعد الترشيح.
7. قبل استخدامها، وتمييع البلغم الترشيح 1/10 ت / ت (100 ميكرولتر من البلغم، 900 ميكرولتر من وسائل الاعلام) في وسائل الإعلام المرجوة.
   ملاحظة: هنا، تم استخدام مرق استذابة القياسية (LB) وسائل الاعلام.

3. غرف الطريقة ساترة لتشكيل بيوفيلم

1. تنمو عزل البكتيريا من بين عشية وضحاها الاهتمام في وسائل الإعلام المطلوب عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (200 دورة في الدقيقة).
   ملاحظة: استخدمت عدد من البكتيريا المختلفة، بما في ذلك السريرية عزلات الزائفة الزنجارية، المكورات العنقودية الذهبية،بيركولديريا مجمع الشرهة وxylosoxidans المنتصلة. اختيار وسائل الاعلام يعتمد على سلالات وشروط الفائدة، ولكن وسائل الاعلام LB يمكن استخدامها لإجراء التجارب الأولية.
2. من الثقافة بين عشية وضحاها، ضع 40 ميكرولتر من ثقافة إلى 4 مل من وسائل الإعلام الجديدة وتنمو لمدة 3-4 ساعة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (200 دورة في الدقيقة) للحصول على الثقافة مع الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD ₆₀₀₎ ما يقرب من 0.5 -0.6.
3. تمييع الثقافة من الخطوة 3.2 إلى 1/5 في وسائل الإعلام المطلوب مع 10٪ البلغم الترشيح أو بدون الترشيح البلغم (كما المراقبة). تركيز الآخرين من الترشيح البلغم يمكن اختبار (أي 50٪ أو 100٪).
4. استخدام 200 ميكرولتر من التخفيف البذور آبار غرف الشرائح.
5. تسمح للبكتيريا ان نعلق لمدة 4 ساعة على 37 درجة مئوية دون أن تهتز.
6. بعد 4 ساعات، وإزالة وسائل الإعلام وبلطف يغسل بيوفيلم مع وسائل الإعلام الجديدة 1X. استبدال 200 ميكرولتر وسائل الإعلام الجديدة.
   ملاحظة: لدراسة آثار البلغم على بيوفيلم، وFRESوينبغي أن تتضمن وسائل الاعلام ح البلغم طاف.
7. تسمح الأغشية الحيوية لتنمو لكمية من الوقت المطلوب عند 37 درجة مئوية دون أن تهتز، لتحل محل وسائل الاعلام كل 12 ساعة، دون غسل حتى الوقت للفحص المجهري.
   ملاحظة: لدراسة تأثير supernatants البلغم على القابلية للمضادات الحيوية بيوفيلم، تتم إضافة المضادات الحيوية إلى وسائل الإعلام بعد 24 ساعة من نمو بيوفيلم ويتم الاحتفاظ بها في وسائل الإعلام حتى تلطيخ والتصوير الأغشية الحيوية.

4. تلطيخ الأغشية الحيوية ومتحد البؤر المجهري

1. وعقب المطلوب الوقت نمو (24-48 ساعة يعمل بشكل أفضل)، وإزالة وسائل الإعلام من الآبار الغرفة وغسل بلطف كل غرفة مرتين مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة.
2. تحضير خليط تلطيخ للبيوفيلم عن طريق خلط 1 ميكرولتر من كل صبغ (المنصوص عليها في عدة الجدوى) لكل مل من محلول الحاجة. جعل الصبغة في محلول مائي أو وسائل الإعلام.
   ينصح المياه من قبل الشركة المصنعة: ملاحظة.
3. إضافة 200 ميكرولتر من خليط الصبغة لكل بئر من covergla غرفSS ويحضن في درجة حرارة الغرفة، في الظلام لمدة 45 دقيقة.
4. إزالة خليط تلطيخ من الغرف وغسل كل بئر مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة. إزالة برنامج تلفزيوني واستبدالها مع المياه العذبة أو وسائل الإعلام.
5. المضي قدما في التصور الأغشية الحيوية عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.

5. تصور الأغشية الحيوية مع متحد البؤر المجهري

1. قراءة الأغشية الحيوية الملون في غرف مباشرة بعد تلطيخ (في حدود 1 ساعة). تقليل التأخير في التصور من الشرائح التي تلطيخ 1-2 غرف 8 جيدا في كل مرة.
2. أداء التصوير باستخدام متحد البؤر المجهر مع الليزر لالإثارة وتصفية مجموعات لاقتناء.
   ملاحظة: هنا، والغزل نظام القرص متحد مع ليزر بورياليس الطيفية استخدمت لإثارة (الأخضر: 561 نانومتر: 491nm، الأحمر). واستخدمت الانبعاثات تصفية مجموعات من 515/40 و624/40 لتصور البقع من عدة قابلية بيوفيلم.
3. التقاط صور باستخدام الهدف المياه 25X على المجهر متحد البؤر مع الكاميرا.
استخدام Z-الأكوام لنموذج بيوفيلم. التقاط صور كل 0.5-1 ميكرون ابتداء من اول طائرة في التركيز على الإطار في التركيز الأخير من بيوفيلم (عادة تمتد 30-80 ميكرومتر لمدة 48 الأغشية الحيوية ساعة)
4. يستغرق 3-5 صور من كل جانب.
   ملاحظة: وهكذا لمدة 8 ساترة غرف جيدا، سيتم إنشاء 24-40 الصور.
5. حفظ الصور للتحليل.
   ملاحظة: يجب حفظ الصور كملفات OME-TIFF ليتم تحليلها باستخدام COMSTAT ^18،19. تعليمات لتحليل الصور بيوفيلم يمكن العثور عليها في http://www.comstat.dk/. مرة واحدة يتم استيراد الصور والمعلمات مثل سمك متوسط ​​والكتلة الحيوية وتغطية السطح لكل قناة (الأحمر والأخضر) يمكن تحليلها.

النتائج

ويمثل التصميم الشامل للتجربة في الشكل 1. استخدام هذا البروتوكول يوفر طريقة مريحة لتصور التغيرات في الأغشية الحيوية نمت لفترات زمنية مختلفة (على سبيل المثال، 24، 48 أو 72 ساعة). الأهم من ذلك، إشارات خارجية، مثل البلغم الرواشح، ويمكن أن يضا?...

Discussion

الطرق الموضحة في هذه الوثيقة تسمح لتصور الأغشية الحيوية البكتيرية التي تزرع في وجود المنتجات الخارجية. ليس من المستغرب أن إنتاج exoproducts له أهمية عند استخدام هذا النوع من النظام. على سبيل المثال، Dithiothreitol (DTT)، وغالبا ما تستخدم على عينات البلغم الإنسان لمساعدة تسييل الع?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Blood agar plates	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT	Availble software online		COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters	Millipore	SLGV013SL	Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf