可视化痰生物膜发展影响使用腔室盖玻片型号

摘要

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

摘要

生物膜是由以自分泌的基质包裹细菌的群体。它们在工业污染，以及在许多健康相关性感染的发展和维持中发挥重要作用。一种在人类疾病中最充分描述并研究生物膜发生在囊性纤维化患者的慢性肺部感染。当在主机的情况下学习生物膜，许多因素会影响生物膜的形成和发展。为了鉴定宿主因素如何影响生物膜的形成和发展，我们使用一个静态腔室盖玻片方法中的宿主衍生的因子在痰上清液的形式存在下生长生物膜。细菌接种到商会和暴露于痰滤液。继增长48小时，生物膜沾满共聚焦显微镜和分析之前的商业可行性生物膜套件。以下图像采集，生物膜特性可以使用不同的软件平台来评估。这个方法允许我们想象中不同物质，包括抗生素的存在生物膜生长的关键性质。

引言

细菌生物膜是微生物组附加到彼此并以自分泌的基质包裹。 ^1,2-传统上，它们代表细菌物理连接到流量的条件下形成的非生物或生物的表面上。生物膜也已经显示在静态条件（无流动）和远离表面，如在形成于试管热水池或药膜的空气 - 液体界面生长。这些生物膜早已在环境中识别和是主要损害工业过程，因为它们可以在蓄水池或管道形成，导致生物结垢，腐蚀和堵塞。 ^3,4

生物膜也是在医疗设置关键的，因为它们已被证明参与导管相关感染，囊性纤维化患者的肺感染，以及在许多其他感染。 ^5,6-一个生物膜感染的标志是德折痕细菌对抗生素的敏感性，并通过先天免疫系统受损的间隙。 ^7-9最充分研究，涉及基于生物膜感染临床相关情形发生在患者的囊性纤维化（CF），谁是慢性感染绿脓杆菌生物膜。 铜绿假单胞菌能建立慢性感染，使得它很难治疗的过程中发生了一些变化。 ^10,11生物膜可以激活差异的先天免疫和炎症驱动。 ^12-14由于这些感染导致CF患者发病率和死亡率，它是要明白，在这方面可以影响生物膜发展的因素是至关重要的。

最近的一项研究表明，宿主因素是在铜绿假单胞菌生物膜聚集体的形成是至关重要的。 ¹⁵这些生物膜有助于减少对抗生素的敏感性和宿主防御机制。该prese的宿主衍生的因素，如嗜中性粒细胞弹性蛋白酶，以及来自本在CF肺部的微生物分泌的产品NCE，必须大大调制生物膜形成和发展的潜力。 ¹⁶此外，生物膜与宿主相互作用来调节多种途径表达并开始发炎。而高通量的方法，例如标准的结晶紫测定法中，可以为用户提供关于生物膜过程中的一些信息，响应于这些因素的生物膜的可视化提供更深入的信息。

在这个手稿我们描述了使用来自CF患者的痰因素来研究生物膜的体外发育的方法。此方法允许暴露于使用商业生物膜存活包含痰宿主因素生物膜的快速可视化。这种技术可以用于可视地识别在exogeno存在生物膜生长过程中发生的变化我们的产品，并表示改进的方法来分析各种条件下的生物膜发展的变化。

研究方案

需要注意的是研究伦理委员会（REB）来收集和痰标本从人类受试者的存储。这些研究是由病童医院REB＃1000019444批准。

1.准备CF痰液标本

1. 收集患者的痰液标本中的囊性纤维化诊疗常规访问，保持在冰上。
2. 在冰上运痰样品收集的第一个小时内，向研究实验室，经过处理。

2.痰处理

1. 记录所得到的痰样品的体积。添加磷酸盐缓冲盐水（PBS）至2倍的样品（ 即，2份PBS中，1份样品）的体积。
2. 用移液管混合样品井。涡上1分钟后，完全混合最高设置的样本。
3. 等分试样将1ml上述混合物的入适当数量的1.5 ml离心管中并离心以5,000 xg离心在4℃下20分钟。
4. 离心后，除去上清液并弃沉淀。
5. 过滤通过0.22微米的过滤器消毒上清，在一个干净的离心管收集。
   注意:滤液的无菌通过电镀在LB琼脂和接种液体培养基试验。
6. 在-80℃，以备将来使用存储痰上清。
   注:痰从多个患者也可以下列过滤合并。
7. 在使用之前，稀释痰滤液1/10体积/体积中所需的介质（100微升痰，900微升的介质）。
   注:在这里，使用标准LB培养基（LB）的媒体。

3.生物膜形成腔室盖玻片方法

1. 在37℃生长在期望的媒体关注隔夜的细菌分离用颤抖的（200转）。
   注意:使用了许多不同的细菌，包括临床分离株绿脓杆菌 ， 金黄色葡萄球菌 ，洋葱伯克霍尔德菌复杂和木糖氧化无色杆菌。的媒体选择取决于菌株和感兴趣的条件下，但是LB培养基可以用于最初的实验。
2. 从过夜培养，将40微升培养物分成4毫升的新鲜培养基中，并在37℃振荡（200rpm）下在大约0.5 600纳米（OD _600），以获得与光学密度的培养生长3-4小时-0.6。
3. 稀释步骤3.2文化在1/5所需的媒体有10％痰滤液或无痰滤液（作为对照）。痰滤液其他浓度可以进行测试（ 即，50％或100％）。
4. 用200微升稀释的种子的幻灯片室井。
5. 使细菌4小时，在37°C不晃动重视。
6. 4小时后，取出媒体，轻轻地用1X新鲜培养基洗生物膜。用200微升新鲜培养基更换。
   注:研究痰的效果上生物膜的FRES^ h媒体应该包含痰上清。
7. 允许生物膜到的时间所需量的在37℃不摇动生长，替换媒体每12小时，未经洗涤直到时间为显微镜。
   注:研究生物膜药敏痰上清液的效果，抗生素加入到以下生物膜生长的24小时的媒体和被保持在媒体直至染色和生物膜的成像。

4.染色生物膜和共聚焦显微镜

1. 继所需生长时间（24-48小时效果最好），从室移去培养基，并轻轻地用300微升无菌PBS洗涤各室的两倍。
2. 通过混合1微升每种染料（在可行性套件中提供）为所需的每个毫升溶液的准备生物膜染色的混合物。使水或媒体解决方案染料。
   注:水是由制造商推荐的。
3. 加入200μl染料混合物到腔式covergla的每个孔SS和孵育在室温下，在黑暗中45分钟。
4. 从腔室中移除染色混合物并用300μl无菌PBS冲洗每个孔中。除去PBS并用清水或媒体取代。
5. 通过共聚焦显微镜生物膜的可视化进行。

5.可视化生物膜与共焦显微镜

1. 染色（在1个小时）后，立即阅读室染色生物膜。通过一次染色八月一日至2日孔腔最小化在载玻片的可视化延迟。
2. 利用共聚焦显微镜用激光激发和过滤器集收购进行成像。
   注:在这里，北极光光谱的激光旋转盘共聚焦系统被用于激励（绿色:561纳米:491nm，红色）。用于发射滤光片套四十零分之五百十五和四十零分之六百二十四的由生物膜生存能力套件形象化的污渍。
3. 以使用与相机共聚焦显微镜25X一水的目标图像。
使用Z-堆栈生物膜模型。拍摄图像每隔0.5-1微米从第一焦点对准平面开始到生物膜的最后的聚焦框（通常跨越30-80微米48小时生物膜）
4. 从每口井以3-5的图像。
   注:因此，对于一个8孔腔玻璃罩，将产生24-40图像。
5. 保存图像进行分析。
   注意:图片应保存为使用COMSTAT ^18,19分析OME-TIFF文件。生物膜图像分析说明可以在http://www.comstat.dk/找到。一旦图像被导入，参数，如平均厚度，生物质和表面覆盖率为每个通道（红色和绿色）进行分析。

结果

实验的整体设计在图1中表示。使用这种协议的提供了一个方便的方法来可视化在生长的不同时间（ 例如，24，48或72小时）的生物膜的变化。重要的是，外源信号，如痰的滤液，可以被添加到可视化生物膜发展的变化。如在图2中看到的那样，10％的痰的滤液的存在可以改变生物膜的结构（ 图2A，下图）。 ¹⁶这些图像可以...

讨论

本文描述的方法允许在外源产物的存在下生长的细菌生物膜的可视化。不令人惊讶地，使用这种类型的系统时生产exoproducts的是重要的。例如，二硫苏糖醇（DTT），经常被用来对人痰样品来帮助液化样本。然而，DTT的单独的效果可降低生物膜发展和活力（数据未显示）。因此，对于所有条件适当的控制是必要的。此外，加入的人类痰产品由于这一事实，即每个病人的痰中有一个独特的微生物产生?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Blood agar plates	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT	Availble software online		COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters	Millipore	SLGV013SL	Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf