Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme

Özet

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Özet

Biyofilmler kendinden salgılanan matris kaplı bakteri gruplarından oluşur. Bu endüstriyel kirlenme hem de bir çok sağlık ile ilgili enfeksiyonların gelişmekte ve önemli bir rol oynamaktadır. insan hastalığında en iyi tarif ve çalışılan biyofilm biri kistik fibroz hastalarının kronik akciğer enfeksiyonu meydana gelir. konak bağlamında biyofilm öğrenim görürken, birçok faktör biyofilm oluşumunu ve gelişimini etkileyebilir. Ev sahibi faktörleri biyofilm oluşumunu ve gelişimini etkileyen nasıl tespit etmek amacıyla, balgam yüzer şeklinde bir ev sahibi türevli faktör varlığında, biyofilm büyümeye statik odacıklı coverglass yöntemi kullanılmıştır. Bakteri odalarına tohumlanmış ve balgam süzüntüler maruz kalmaktadır. büyüme 48 saat sonra, biyofilm önce konfokal mikroskopi ve analiz için ticari bir biyofilm canlılığı kiti ile boyandı. Görüntü alınmasının ardından, biyofilm özellikleri farklı yazılım platformları kullanarak değerlendirilebilir.Bu yöntem antibiyotikler de dahil olmak üzere, farklı maddelerin varlığında biyofilm büyüme önemli özelliklerini görselleştirmek sağlar.

Giriş

Bakteri biyofilmleri birbirlerine bağlanmış ve bir öz salgılanan matris kaplı olan mikroorganizmaların gruplarıdır. ^1,2 Klasik olarak, fiziksel olarak akış koşulları altında meydana gelen bir abiyotik veya biyotik yüzeye bağlı bakteri temsil etmektedir. Biyofilmler, aynı zamanda bu tür test tüplerinde oluşan ısı havuzları veya ince zarlar hava-sıvı arayüzü itibarıyla yüzeylerin statik koşullar altında (akış olmaması) ve distal, büyümeye gösterilmiştir. Onlar biyolojik kirlenme, paslanma ve tıkanmalara neden su rezervuarları veya borularda oluşabilir gibi bu biyofilm uzun, endüstriyel prosesler için büyük bir kayba ortamında tanınan ve vardır oylandı. ^3,4

Onlar kateter ile ilişkili enfeksiyonlar, kistik fibroz hastalarında akciğer enfeksiyonları, yanı sıra çok sayıda diğer enfeksiyonlarda rol gösterilmiştir olarak biyofilm, aynı zamanda sağlık ortamlarında kritik önem taşımaktadır. Biyofilm enfeksiyonlarının işaretlerinden ^5,6 biri de olanBakterilerin antibiyotiklere duyarlılığının katlanmış ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi tarafından açıklığı engelli. Biyofilm tabanlı enfeksiyonu kapsayan ^7-9 en iyi okudu, klinik olarak anlamlı senaryolar kronik Pseudomonas aeruginosa biyofilm bulaşmış kistik fibrozis (KF) olan hastalarda ortaya çıkar. P. aeruginosa çok zor tedavi yapmak, kronik enfeksiyon kurulması sırasında bir dizi değişiklik uğrayabilir. ^10,11 Biyofilmler farklı olarak doğuştan gelen bağışıklık etkinleştirmek ve inflamasyonu sürebilirim. Bu enfeksiyonlar KF hastalarında artmış morbidite ve mortalite neden ^12-14 gibi, bu bağlamda biyofilm gelişimini etkileyen faktörleri anlamak önemlidir.

Yeni yapılan bir çalışmada konak faktörleri P. aeruginosa biyofilm agrega oluşumunda kritik olduğunu göstermektedir. ¹⁵ Bu biyofilm antibiyotik ve konak savunma mekanizmaları indirgenmiş duyarlılık katkıda bulunur. preseörneğin nötrofil elastaz gibi CF akciğer mikroorganizmaların salgılanan ürünler olarak ev sahibi türevli faktörlere nce, büyük ölçüde biyofilm oluşumunu ve gelişimini modüle potansiyeline sahiptir. ¹⁶ Ayrıca, biyofilm sayısız yolların ifadesini modüle ve inflamasyonu başlatmak için ev sahibi ile etkileşim. Böyle standart kristal viyole deneyi olarak yüksek kapasiteli yöntemleri, biyofilm süreci ile ilgili olarak bazı bilgiler sağlayabilir iken, bu faktörlere yanıt olarak biyofilm görselleştirme daha derinlemesine bilgi sağlar.

Bu yazıda in vitro biyofilm gelişimini incelemek için KF'li hastaların balgam faktörlerini kullanmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir ticari biyofilm canlılığı kiti kullanılarak balgam içeren konak faktörlerine maruz kalan biyofilm hızlı görselleştirme sağlar. Bu teknik, görsel exogeno mevcudiyetinde biyofilm büyüme sırasında oluşan değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilirUS ürünleri ve çeşitli koşullar altında biyofilm gelişme değişiklikleri analiz etmek için geliştirilmiş bir yöntemi temsil eder.

Protokol

Araştırma Etik Kurulu (REB) toplamak ve insan denekler gelen balgam örnekleri saklamak için gerekli olduğunu unutmayın. Bu çalışmalar Sick Children REB # 1000019444 için Hastanesi tarafından kabul edildi.

1. Hazırlama CF Balgam Örnekleri

1. kistik fibroz kliniğine rutin ziyaretler sırasında hastaların balgam örneği toplayın ve buz üzerinde tutmak.
2. işleme geçmesi, araştırma laboratuarına, koleksiyonun ilk saat içinde buz üzerinde balgam örneği taşıyın.

2. Balgam İşleme

1. Elde edilen balgam örneğinin hacmini kaydedin. Örnek (örneğin, 2 parça PBS, 1 kısım örnek) hacminin 2x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ekleyin.
2. Bir transfer pipet yardımıyla iyice örnek karıştırın. Vortex 1 dk tamamen karıştırmak için en yüksek ayarda örnek.
3. Kısım uygun sayı, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler içine yukarıdaki karışımın 1 ml ve 5.000 xg aşağı doğru döndürün4 ° C'de 20 dakika.
4. santrifüj sonrasında, süpernatant kaldırmak ve pelet atın.
5. Filtre 0.22 um'lik bir filtreden süpernatantı steril ve temiz bir mikrosantrfuj tübüne birikir.
   NOT: süzüntü sterilite LB agar kaplama ve sıvı ortamları aşılayarak test edilir.
6. ileride kullanmak üzere, -80 ° C'de, balgam süpernatant saklayın.
   NOT: Balgam birden hastalar da filtrasyon aşağıdaki havuza edilebilir dan.
7. Balgam Süzüntü, 1/10 hac / hac istenen medyada (balgam 100 ul, ortam 900 ul) seyreltilmiş, kullanılmadan önce.
   NOT: Burada, standart lizojeni suyu (LB) ortamı kullanılmıştır.

Biyofilm Oluşumunun 3. odacıklı coverglass Yöntemi

1. (200 rpm) çalkalanarak 37 ° C'de arzu edilen ortam ilgi gece boyunca bakteriyel izolatı büyütün.
   Not: Farklı bakteri çok sayıda kullanılmış, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus klinik izolatlarının dahil,Burkholderia cepacia karmaşık ve Achromobacter xylosoxidans. ortam seçimi Ancak LB ortamı ilk uygulamalar için kullanılabilir suşları ve ilgi koşullara bağlıdır.
2. Gecelik kültürden taze ortam 4 ml kültür, 40 ul koyun ve yaklaşık olarak 0.5, 600 nm (OD ₆₀₀₎ de optik yoğunluğu ile bir kültür elde etmek için (200 rpm) çalkalanarak 37 ° C'de 3-4 saat boyunca büyümeye -0.6.
3. % 10 balgam süzüntü ya da (kontrol olarak) balgam filtrattan olmadan istenilen medyada 1/5 adım 3.2 kültürünü sulandırmak. Balgam filtre bulunan konsantrasyonu test edilebilir (örneğin,% 50 ya da% 100).
4. slayt odaları kuyu tohum seyreltme 200 ul kullanın.
5. Bakteriler çalkalamadan 37 ° C'de 4 saat eklemesini sağlar.
6. 4 saat sonra, medyayı çıkarın ve yavaşça 1x taze medya ile biyofilm yıkayın. 200 ul taze medya ile değiştirin.
   NOT: biyofilm üzerindeki fres balgam etkilerini araştırmakh medya balgam süpernatant içermelidir.
7. biyofilm mikroskopi için saatine kadar yıkama olmadan Ortam her 12 saat yerine, sallayarak olmadan 37 ° C'de zaman istenilen miktarda büyümeye olanak sağlar.
   NOT: biyofilm antibiyotik duyarlılık balgam Süpernatantları etkisini incelemek için, antibiyotikler biyofilm büyüme 24 saat aşağıdaki ortama ilave edilir ve boyama ve biyofilm görüntüleme kadar medyada muhafaza edilir.

4. Boyama Biyofilmler ve Konfokal Mikroskop

1. İstenilen büyüme süresi (24-48 saat en iyi şekilde çalışır) ardından, oda kuyulardan ortamını çıkarın ve yavaşça steril PBS 300 ul ile iki kez her odasına yıkayın.
2. gerekli çözeltinin her ml (canlılık kitte sağlanan), her boyanın 1 ul karıştırılarak biyofilm boyama karışım hazırlayın. Su veya ortam çözelti içinde boya sağlayın.
   NOT: Su üretici tarafından tavsiye edilmektedir.
3. bölmeli covergla her bir kuyu için boya karışımının 200 ul eklep, 45 dakika süreyle karanlıkta, oda sıcaklığında inkübe edin ve.
4. odalarından boyama karışımı çıkarın ve steril PBS 300 ul her bir yıkama. PBS çıkarın ve tatlı su ya da medya ile değiştirin.
5. konfokal mikroskobu ile biyofilm görselleştirme ile devam edin.

5. Konfokal Mikroskop ile biyofilm görselleştirme

1. hemen (1 saat içinde) boyandıktan sonra odalarına lekeli biyofilm okuyun. Bir seferde 2 8-kuyu odalarına 1 boyanarak slaytların görselleştirme gecikmeyi en aza indirmek.
2. edinimi için uyarma ve filtre setleri için lazerler ile konfokal mikroskop kullanılarak görüntüleme gerçekleştirin.
   NOT: Burada, spektral borealis lazerler ile dönen disk konfokal sistemi (Yeşil: 491nm, Kırmızı: 561 nm) uyarma için kullanılmıştır. 515/40 ve 624/40 emisyon filtre setleri biyofilm canlılığı kiti lekeleri görselleştirmek için kullanılmıştır.
3. kamera ile konfokal mikroskop bir 25X su objektif kullanarak fotoğraf çekmek.
4. Kullan Z-Yığınları biyofilm modeli. Her 0.5-1 mikron biyofilm son olarak odak çerçeveye ilk odak düzlemi başlayarak görüntü almak (genellikle 30-80 mikron 48 saat biyofilm kapsayan)
5. her bir kuyunun 3-5 görüntüleri çekmek.
   NOT: Böylece 8 de odacıklı coverglass için, 24-40 görüntüleri oluşturulur.
6. Analiz için görüntüleri kaydedin.
   NOT: OME-TIFF dosyalarını COMSTAT ^18,19 kullanılarak analiz edilecek şekilde Görüntüler kaydedilmesi gerekir. biyofilm görüntü analizi için talimatlar http://www.comstat.dk/ adresinde bulunabilir. görüntüleri ithal edildikten sonra, bu tür her kanala (kırmızı ve yeşil) için ortalama kalınlığı, biyokütle ve yüzey kapsama gibi parametreler analiz edilebilir.

Sonuçlar

Deney genel tasarımı, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bu protokolün kullanılması farklı zaman aralıklarında (örneğin, 24, 48 veya 72 saat) için yetiştirilen biyofilm değişiklikleri görselleştirmek için uygun bir yöntem sağlar. Önemli bir şekilde, örneğin, balgam süzüntüler gibi dış sinyaller, biyofilm gelişme değişiklikleri görselleştirmek için ilave edilebilir. Şekil 2'de de görüldüğü gibi,% 10, ba...

Tartışmalar

Bu tarifnamede tarif edilen yöntemler eksojen ürünlerin mevcudiyetinde büyütülen bakteri biyofilmlerin görselleştirme için izin verir. bu tip bir sistem kullanılıyorsa Beklendiği gibi, exoproducts üretimi önem taşımaktadır. Örneğin, Ditiyotreitol (DTT), genellikle örnekleri sıvılaştırılması yardımcı insan balgam kullanılır. Bununla birlikte, tek başına DTT etkisi biyofilm gelişimi ve canlılığı azaltılmış olur (veriler gösterilmemiştir). Bu durumda, tüm koşullar için uygun kon...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Blood agar plates	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT	Availble software online		COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters	Millipore	SLGV013SL	Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf