Visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm Utilisation d'un modèle Chambered lamelle couvre-objet

Résumé

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Résumé

Les biofilms sont constitués de groupes de bactéries enrobées dans une matrice auto-sécrété. Ils jouent un rôle important dans la contamination industrielle, ainsi que dans le développement et la persistance de nombreuses infections liées à la santé. Un des biofilms plus bien décrits et étudiés dans les maladies humaines se produit dans l'infection pulmonaire chronique des patients atteints de fibrose kystique. Lors de l'étude des biofilms dans le contexte de l'hôte, de nombreux facteurs peuvent influer sur la formation et le développement de biofilm. Afin d'identifier comment les facteurs de l'hôte peuvent affecter la formation de biofilm et de développement, nous avons utilisé une méthode coverglass chambré statique de croître biofilms en présence de facteurs de l'hôte dérivé sous forme de surnageants d'expectorations. Les bactéries sont ensemencées dans des chambres et exposées à filtrats expectorations. À la suite de 48 h de croissance, les biofilms sont colorées avec un kit de viabilité commerciale du biofilm avant la microscopie et l'analyse confocale. Suite à l'acquisition de l'image, les propriétés biofilm peuvent être évaluées en utilisant différentes plates-formes logicielles.Cette méthode nous permet de visualiser les propriétés clés de la croissance du biofilm en présence de différentes substances, notamment des antibiotiques.

Introduction

biofilms bactériens sont des groupes de micro-organismes qui sont reliés les uns aux autres et enfermés dans une matrice auto-sécrété. ^1,2 Classiquement, ils représentent les bactéries physiquement attachés à une surface abiotique ou biotique formé dans des conditions d'écoulement. Biofilms ont également été montré à croître dans des conditions statiques (absence d'écoulement) et distal par rapport à des surfaces, par exemple à l'interface air-liquide des piscines thermales ou aux pellicules formées dans des tubes à essai. Ces biofilms sont reconnus depuis longtemps dans l'environnement et sont un préjudice important aux procédés industriels, car ils peuvent se former dans les réservoirs d'eau ou dans les tuyaux, ce qui entraîne l'encrassement biologique, la corrosion et les blocages. ^3,4

Les biofilms sont également critiques dans les milieux de soins de santé, comme il a été démontré être impliqués dans les infections liées au cathéter, les infections pulmonaires chez les patients atteints de fibrose kystique, ainsi que dans de nombreuses autres infections. ^5,6 L' une des caractéristiques des infections biofilm est le deaugmenté la sensibilité des bactéries aux antibiotiques et une altération de la clairance par le système immunitaire inné. ^7-9 Le plus bien étudiés, des scénarios cliniquement pertinentes impliquant une infection à base biofilm se produit chez les patients atteints de fibrose kystique (FK), qui sont chroniquement infectés par Pseudomonas biofilms aeruginosa. P. aeruginosa peut subir un certain nombre de changements lors de l' établissement d' une infection chronique qui le rendent très difficile à traiter. ^10,11 biofilms peuvent différentiellement activer l' immunité innée et conduire l' inflammation. ^12-14 Comme ces infections conduisent à une augmentation de la morbidité et de la mortalité chez les patients atteints de mucoviscidose, il est essentiel de comprendre les facteurs qui peuvent influer sur le développement du biofilm dans ce contexte.

Une étude récente suggère que l' hôte facteurs sont essentiels à la formation de P. aeruginosa agrégats de biofilm. ¹⁵ Ces biofilms contribuent à une sensibilité réduite aux antibiotiques et les mécanismes de défense de l' hôte. Le presence de facteurs dérivées de l'hôte, telles que l'élastase neutrophile, ainsi que les produits sécrétés à partir de micro-organismes présents dans le poumon CF, ont la capacité de moduler considérablement la formation de biofilm et de développement. ¹⁶ En outre, les biofilms interagir avec l'hôte pour moduler l' expression de nombreuses voies et initier l' inflammation. Bien que les méthodes à haut débit, tels que le test de cristal violet standard, peuvent fournir des informations en ce qui concerne le processus de biofilm, la visualisation du biofilm en réponse à ces facteurs fournissent plus d'informations en profondeur.

Dans ce manuscrit , nous décrivons une méthode d'utilisation des facteurs de l'expectoration des patients atteints de mucoviscidose pour étudier le développement de biofilms in vitro. Cette méthode permet une visualisation rapide des biofilms exposés à des crachats contenant des facteurs de l'hôte en utilisant un kit biofilm viabilité commerciale. Cette technique peut être utilisée pour identifier visuellement des changements qui se produisent lors de la croissance du biofilm en présence d'exógenonous produits, et représente une méthode améliorée pour analyser les changements dans le développement du biofilm dans diverses conditions.

Protocole

Notez que Comité d'éthique de la recherche (CER) est nécessaire pour recueillir et stocker des échantillons de crachats de sujets humains. Ces études ont été approuvées par le Hospital for Sick Children REB # 1000019444.

1. Préparation des échantillons d'expectoration CF

1. Prélever un échantillon de crachat de patients au cours des visites de routine à la clinique de fibrose kystique et de garder sur la glace.
2. Transports échantillon de crachat sur la glace dans la première heure de la collecte, au laboratoire de recherche, de se soumettre à un traitement.

2. expectorations Processing

1. Enregistrer le volume de l'échantillon de crachat obtenu. Ajouter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 2 fois le volume de l'échantillon ( par exemple, 2 parties du PBS, 1 partie de l' échantillon).
2. Mélanger le puits d'échantillon avec une pipette de transfert. Vortex l'échantillon sur le réglage le plus élevé pour 1 min pour mélanger complètement.
3. Aliquote de 1 ml de mélange ci-dessus dans le numéro 1,5 ml microtubes appropriés et centrifuger à 5000 xg pour20 min à 4 ° C.
4. Après centrifugation, éliminer le surnageant et jeter le culot.
5. Filtre stériliser le surnageant à travers un filtre de 0,22 um et de recueillir dans un tube propre.
   NOTE: Stérilité du filtrat est testé par étalement sur gélose LB et inoculer des milieux liquides.
6. Rangez surnageant expectoration à -80 ° C pour une utilisation future.
   NOTE: Les expectorations provenant de plusieurs patients peuvent également être mises en commun après filtration.
7. Avant utilisation, diluer expectoration filtrat 1/10 v / v (100 pi d'expectoration, 900 pi de médias) dans le support souhaité.
   NOTE: Ici, le bouillon de lysogeny standard (LB) Les médias ont été utilisés.

3. Chambered lamelle couvre-objet Méthode de formation de biofilms

1. Cultivez isolat bactérien d'intérêt durant la nuit dans le support souhaité à 37 ° C sous agitation (200 rpm).
   Note: Un certain nombre de bactéries différentes ont été utilisées, y compris des isolats cliniques de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Burkholderia cepacia et xylosoxidans Achromobacter. Choix des médias dépend des souches et des conditions d'intérêt, mais les médias LB peuvent être utilisés pour des expériences initiales.
2. A partir de la culture pendant une nuit, placer 40 ul de la culture dans 4 ml de milieu frais et faire croître pendant 3-4 heures à 37 ° C sous agitation (200 tours par minute) pour obtenir une culture avec une densité optique à 600 nm (DO ₆₀₀₎ d'environ 0,5 -0.6.
3. Diluer la culture de l'étape 3.2 à 1/5 dans le support désiré avec 10% de crachats filtrat ou sans filtrat expectorations (comme témoin). D' autre concentration des crachats filtrat peut être testée ( par exemple, 50% ou 100%).
4. Utiliser 200 ul de la dilution pour ensemencer des puits de chambres à glissière.
5. Permettre aux bactéries de se fixer pendant 4 heures à 37 ° C sans agitation.
6. Après 4 heures, retirer les médias et laver délicatement le biofilm avec un milieu frais 1x. Remplacez-le par 200 ul de milieu frais.
   REMARQUE: Pour étudier les effets de crachats sur le biofilm, les fresh médias devraient contenir des crachats surnageant.
7. Laisser biofilms de croître pour la quantité désirée de temps à 37 ° C sans agitation, en remplaçant tous les médias 12 h, sans lavage jusqu'à ce que le temps pour la microscopie.
   NOTE: Pour étudier l'effet des surnageants de crachats sur la sensibilité aux antibiotiques biofilm, les antibiotiques sont ajoutés aux médias suivants 24 h de croissance du biofilm et sont maintenues dans les médias jusqu'à ce que la coloration et l'imagerie des biofilms.

4. Coloration biofilms et Microscopie confocale

1. Après le temps de croissance désiré (24-48 h fonctionne le mieux), retirer le support des puits de chambre et laver délicatement chaque chambre deux fois avec 300 pi de PBS stérile.
2. Préparer le mélange coloration pour biofilm en mélangeant 1 pi de chaque colorant (fourni dans le kit de viabilité) pour chaque ml de solution nécessaires. Faire un colorant dans une solution d'eau ou de milieux.
   NOTE: L'eau est recommandé par le fabricant.
3. Ajouter 200 pi de mélange de colorants dans chaque puits de covergla chambréss et incuber à température ambiante, dans l'obscurité pendant 45 min.
4. Retirer le mélange de coloration des chambres et laver chaque puits avec 300 pi de PBS stérile. Retirer PBS et le remplacer par l'eau douce ou les médias.
5. Procéder à la visualisation de biofilms par microscopie confocale.

5. Visualizing biofilms avec Microscopie confocale

1. Lire biofilms tachées dans les chambres immédiatement après coloration (à moins de 1 h). Minimiser retard dans la visualisation des diapositives par coloration 1 à 2 chambres 8 puits à la fois.
2. Effectuer l'imagerie utilisant microscope confocal avec des lasers pour l'excitation et de filtrage des ensembles pour l'acquisition.
   NOTE: Ici, le système de disque confocale de filage avec des lasers borealis spectrales (vert: 491nm, Rouge: 561 nm) ont été utilisés pour l'excitation. Émission des jeux de filtres de 515/40 et 624/40 ont été utilisés pour visualiser les taches du kit biofilm de viabilité.
3. Prendre des images en utilisant un objectif d'eau 25X sur microscope confocal avec la caméra.
4. Utiliser Z-Stacks pour modéliser le biofilm. Prenez des photos tous les 0,5-1 um à partir du premier plan de mise au point à la dernière image de mise au point du biofilm (couvrant généralement 30-80 um pour 48 biofilms hr)
5. Prendre 3-5 images de chaque puits.
   NOTE: Ainsi, pour un 8 coverglass bien chambré, 24-40 images seront générées.
6. Enregistrer des images pour l'analyse.
   REMARQUE: Les images doivent être enregistrées en tant que fichiers OME-TIFF à être analysés en utilisant COMSTAT ^18,19. Instructions pour l'analyse d'images de biofilm peuvent être trouvés à http://www.comstat.dk/. Une fois que les images sont importées, des paramètres tels que l'épaisseur moyenne, la biomasse et la couverture de surface pour chaque canal (rouge et vert) peuvent être analysés.

Résultats

La conception d' ensemble de l'expérience est représenté sur la figure 1. L'utilisation de ce protocole fournit une méthode pratique pour visualiser les changements dans les biofilms cultivés pour différentes périodes de temps (par exemple, 24, 48 ou 72 h). Surtout, des signaux exogènes tels que des crachats filtrats peuvent être ajoutés pour visualiser les changements dans le développement du biofilm. Comme on le voit sur la figur...

Discussion

Les procédés décrits ici permettent une visualisation des biofilms bactériens cultivés en présence de produits exogènes. Sans surprise, la production des exoproducts est d'une importance lors de l'utilisation de ce type de système. Par exemple, dithiothréitol (DTT), est souvent utilisé sur des échantillons de crachats humains pour aider à liquéfier les échantillons. Cependant, l'effet de DTT seul peut réduire le développement de biofilm et la viabilité (données non présentées). Ainsi, des...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Blood agar plates	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT	Availble software online		COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters	Millipore	SLGV013SL	Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf