Визуализация Эффекты мокроте на биопленки развития с использованием модели Chambered покровного стекла

Резюме

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Аннотация

Биопленки состоят из групп бактерий, заключенная в самостоятельной секретируется матрице. Они играют важную роль в промышленном загрязнении, а также в развитии и настойчивости многих инфекций, связанных со здоровьем. Одним из наиболее хорошо изученных и описанных биопленок болезни человека происходит при хронической легочной инфекции у больных муковисцидозом. При изучении биопленки в контексте хозяина, многие факторы могут воздействовать на образование биопленки и развитие. Для того, чтобы определить, как факторы хозяина могут влиять на формирование и развитие биологической пленки, мы использовали статический метод камерные покровного стекла расти биопленки в присутствии факторов хозяина, полученных в виде мокроте супернатантов. Бактерии высевали в камеры и подвергаются мокроте фильтратов. После 48 ч роста, биопленки окрашивали коммерческой жизнеспособности биопленки комплекта до конфокальной микроскопии и анализа. После получения изображения, биопленки свойства могут быть оценены с использованием различных программных платформ.Этот метод позволяет визуализировать ключевые свойства роста биопленки в присутствии различных веществ, в том числе антибиотиков.

Введение

Бактериальные биопленки группы микроорганизмов, которые прикреплены друг к другу и вписанные в себя секретируемый матрице. ^1,2 Классически, они представляют собой бактерии , физически прикрепленные к абиотической или биотической поверхности , образованной в условиях потока. Биопленки, также было показано, чтобы расти в статических условиях (отсутствие потока) и дистально от поверхности, например, на границе раздела воздух-жидкость из термальных бассейнов или Плёночные образующихся в пробирках. Эти биопленки уже давно признаны в окружающей среде и являются одним из основных ущерба для промышленных процессов, так как они могут образовывать в водоемах или в трубах, в результате обрастания, коррозии и засорений. ^3,4

Биоплёнки также имеют важное значение в медицинских учреждениях, так как они были показаны быть вовлечены в связанных с катетером инфекций, легочных инфекций у больных муковисцидозом, а также во многих других инфекций. ^5,6 Один из признаков биопленки инфекции является деувеличилась восприимчивость бактерий к антибиотикам и нарушение клиренс врожденной иммунной системы. ^7-9 Наиболее хорошо изучены, клинически значимых сценариев с участием биопленки на основе инфекции происходит у пациентов с кистозным фиброзом (CF), которые хронически инфицированы синегнойной биопленок. П. палочки может пройти ряд изменений во время установления хронической инфекции , которые делают его очень трудно поддается лечению. ^10,11 биопленки может дифференцированно активировать врожденный иммунитет и привод воспаление. ^12-14 Поскольку эти инфекции приводят к повышению заболеваемости и смертности у пациентов с МВ, крайне важно , чтобы понять факторы , которые могут повлиять на развитие биопленки в этом контексте.

Недавнее исследование предполагает , что хозяин-факторы имеют решающее значение в формировании агрегатов биопленки синегнойной. ¹⁵ Эти биопленки способствуют снижению восприимчивости к антибиотикам и механизмов защиты хозяина. Preseсть вмещающих полученных факторов, таких как эластазы нейтрофилов, а также секретируемых продуктов из микроорганизмов, присутствующих в легких при МВ, имеют потенциал, чтобы в значительной степени модулировать образование и развитие биопленки. ¹⁶ Кроме того, биопленки взаимодействовать с хозяином , чтобы модулировать экспрессию многочисленных путей и инициировать воспаление. В то время как высокие методы пропускной способности, такие как стандартного анализа кристаллического фиолетового, может предоставить некоторую информацию в отношении процесса биопленки, визуализация биопленки в ответ на эти факторы предоставляют больше информации в глубину.

В этой рукописи мы опишем метод с использованием коэффициентов из мокроты больных с МВ для изучения развития биопленок в пробирке. Этот метод позволяет быстро визуализации биопленки, подверженных мокроте, содержащей факторов хозяина с использованием коммерческого набора жизнеспособности биопленки. Этот метод может быть использован для визуального определения изменений, которые происходят во время роста биопленки в присутствии exogenoнам продукты, и представляет собой усовершенствованный метод для анализа изменений в развитии биопленки в различных условиях.

протокол

Обратите внимание, что Совет по этике исследований (РЭП) требуется для сбора и хранения образцов мокроты из человеческих субъектов. Эти исследования были одобрены больницы для больных детей РЭП # 1000019444.

1. Подготовка образцов CF мокроте

1. Соберите образец мокроты от пациентов во время плановых визитов в клинику муковисцидоза и держать на льду.
2. Транспорт образец мокроты на льду в течение первого часа сбора, в научно-исследовательской лаборатории, пройти обработку.

2. Обработка Мокроту

1. Регистрируют объем образца мокроты, полученной. Добавить забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) , в 2 раза больше объема образца (то есть, 2 части PBS, 1 часть образца).
2. Смешайте образец хорошо с пипетки передачи. Vortex образец на самое большое значение для 1 мин до полного смешивания.
3. Алиготе 1 мл указанной выше смеси в соответствующее число 1,5 мл микропробирок и спином вниз при 5000 мкг в течение20 мин при температуре 4 ° С.
4. После центрифугирования, удалить супернатант и отбросить осадок.
5. Фильтр стерилизовать супернатант через фильтр 0,22 мкм и собирают в чистую центрифужную пробирку.
   Примечание: стерильность фильтрата проверяется путем высева на LB агар и модифицирования жидких сред.
6. Хранить в мокроте супернатанта при -80 ° С для дальнейшего использования.
   Примечание: мокрота из нескольких пациентов также могут быть объединены после фильтрации.
7. Перед использованием разбавить фильтрат мокроте 1/10 V / V (100 мкл мокроты, 900 мкл среды) в желаемом СМИ.
   Примечание: Здесь был использован стандартный лизогении бульон (LB) средств массовой информации.

3. Chambered покровного стекла Метод биопленки

1. Grow бактериальный изолят интереса в течение ночи в желаемой среде при температуре 37 ° C при встряхивании (200 оборотов в минуту).
   Примечание: были использованы ряд различных бактерий, в том числе клинических изолятов синегнойной, золотистый стафилококк,Burkholderia cepacia комплекса и Achromobacter xylosoxidans. Выбор носителя зависит от деформаций и условий, представляющих интерес, однако LB СМИ могут быть использованы для начальных экспериментов.
2. С в течение ночи культуры, место 40 мкл культуры в 4 мл свежей среды , и расти в течение 3-4 ч при 37 ° C при встряхивании (200 оборотов в минуту) , чтобы получить культуру с оптической плотностью при 600 нм (OD ₆₀₀₎ приблизительно 0,5 -0,6.
3. Развести культуру со стадии 3.2 до 1/5 в нужной среде с 10% фильтрата мокротой или без мокроты фильтрата (в качестве контроля). Другие концентрации фильтрата мокроте может быть протестирована (то есть, 50% или 100%).
4. Используйте 200 мкл разведения семян в лунки камер скольжения.
5. Позволяют бактериям прикрепляться в течение 4 ч при 37 ° С без встряхивания.
6. Через 4 часа, удалите носитель и аккуратно мыть биопленки с 1x свежей средой. Заменить 200 мкл свежей средой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения влияния мокроте на биопленки, в Фресч носитель должен содержать супернатант мокроту.
7. Разрешить биопленки не расти в течение желаемого периода времени при 37 ° С без встряхивания, заменяя среды каждые 12 ч, без промывки до времени для микроскопии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения влияния мокроте супернатантов на биопленки чувствительности к антибиотикам, антибиотики добавляют к прессе после 24 ч роста биопленки и не поддерживаются в средствах массовой информации до окрашивания и визуализации биопленки.

4. Окрашивание биопленки и конфокальной микроскопии

1. После желаемого времени роста (24-48 ч лучше всего работает), удалите материал из камеры колодцев и осторожно промойте каждую камеру дважды 300 мкл стерильной PBS.
2. Подготовка окрашивания смесь для биопленки путем смешивания 1 мкл каждого красителя (можно найти в комплекте жизнеспособности) для каждого мл раствора необходимо. Сделать краситель в воде или растворе носителя.
   Примечание: Воду рекомендовано производителем.
3. Добавить 200 мкл смеси красителя в каждую лунку камерно coverglaсс и инкубировать при комнатной температуре, в темноте в течение 45 мин.
4. Удалить окрашивающий смесь из камеры и мыть каждую лунку по 300 мкл стерильной PBS. Удалить PBS и заменить свежей водой или СМИ.
5. Продолжить визуализации биопленки с помощью конфокальной микроскопии.

5. Визуальное биопленок с конфокальной микроскопией

1. Прочитайте запятнанные биопленки в камерах сразу после окрашивания (в течение 1 ч). Сведение к минимуму задержки в визуализации слайдов с помощью окрашивания с 1 по 2 8-луночных камер одновременно.
2. Выполните визуализацию с помощью конфокальной микроскопии с использованием лазеров для возбуждения и наборов фильтров для приобретения.
   Примечание: Здесь, вращающийся диск конфокальной системы со спектральными Borealis лазеров (Зеленый: 491nm, красный цвет: 561 нм) были использованы для возбуждения. Эмиссионные фильтр наборы 515/40 и 624/40 были использованы для визуализации пятна от комплекта жизнеспособности биопленки.
3. Возьмите изображения с использованием объектива 25X воды на конфокальной микроскопии с камерой.
Использование Z-стеки для моделирования биопленки. Возьмите изображения каждые 0,5-1 мкм, начиная с первой плоскости в фокусе до последнего кадра в фокусе биопленки (как правило, охватывает 30-80 мкм в течение 48 ч биопленки)
4. Возьмите 3-5 изображений из каждой лунки.
   Примечание: Таким образом, для 8 хорошо камерных покровного стекла, 24-40 изображения будут генерироваться.
5. Сохранение изображений для анализа.
   Примечание: Изображения должны быть сохранены как OME TIFF-файлы , которые будут проанализированы с помощью КОМСТАТ ^18,19. Инструкции для анализа биопленки изображения можно найти на сайте http://www.comstat.dk/. После того, как изображения импортируются такие параметры, как средняя толщина, биомасса и покрытия поверхности для каждого канала (красный и зеленый) могут быть проанализированы.

Результаты

Общий дизайн эксперимента представлена на рисунке 1. Использование этого протокола обеспечивает удобный способ для визуализации изменений в биопленок , выращенных в течение различных периодов времени (например, 24, 48 или 72 ч). Важно отметить, что экзогенн?...

Обсуждение

Методы, описанные здесь, позволяют для визуализации бактериальных биопленок, выращенных в присутствии экзогенных продуктов. Не удивительно, что производство exoproducts имеет важное значение при использовании этого типа системы. Например, дитиотреитола (ДТТ), часто используется на образца...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Blood agar plates	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT	Availble software online		COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters	Millipore	SLGV013SL	Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf