JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الغدة البين في الزرد هي نظيره teleostean من الغدة الكظرية الثدييات. يدخل هذا البروتوكول كيفية تنفيذ نازعة 3-β هيدروكسي ستيرويد (Δ 5-4 إيزوميراز، 3β-HSD) فحص النشاط الأنزيمي، الذي يكتشف خلايا الستيرويدي المنشأ متباينة في الزرد النامية.

Abstract

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-β-Hydroxysteroid dehydrogenase /Δ5-4 isomerase (3β-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3β-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3β-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

Introduction

الغدة الكظرية، عنصرا حاسما في المحور hypothalamo الغدة النخامية، الغدة الكظرية، تفرز المنشطات وينسق التوازن الستيرويد والاستجابة الجسدية للإجهاد. تتكون الغدة الكظرية القشرة الخارجية، التي تفرز المنشطات بطريقة منطقة محددة، والنخاع الداخلية، الذي يجمع الكاتيكولامينات. الغدة البين في teleosts هي النظير من الغدة الكظرية في الثدييات، وتتكون من خلايا البين وأليفة الكروم الستيرويدي المنشأ، والتي هي المعادل الوظيفي من قشرة الغدة الكظرية والنخاع، على التوالي 1-3. وأفادت الدراسات التي أجريت باستخدام نموذج الزرد التي تتشكل على حد سواء الأنساب الخلية الستيرويدي المنشأ وأليفة الكروم من الآليات الجزيئية والخلوية التي تشبه إلى حد كبير تلك الموجودة في الثدييات 1،2. ولذلك، فإن الزرد هو نموذج يحتمل أن تكون قوية لدراسة الأمراض الوراثية، ومراقبة الغدد الصم العصبية، وبيولوجيا الأنظمة من المحور hypothalamo الغدة النخامية، الغدة الكظرية (البين).

الصورة = "jove_content"> في الغدة الكظرية، 3β-HSD يحفز تحويل هرمون البروجسترون من بريغنينولون، 17α-هيدروكسي من 17α-hydroxypregnelolone، والاندروستيرون من ديهيدرو 4،5. 3β-HSD ضروري لbiosynthesizing جميع فئات المنشطات الهرمونية، وهما هرمون البروجسترون، السكرية، مستحضرات معدنية، الاندروجين، وهرمون الاستروجين. وهما البشري 3β-HSD نظائر الانزيمات HSD3B1 وHSD3B2 وأعرب تفاضلي 6. وأعرب عن HSD3B1 في المشيمة والأنسجة الطرفية، في حين أعرب HSD3B2 في قشرة الغدة الكظرية والغدد التناسلية. HSD3B1 الإنسان وHSD3B2 هي شارك في orthologs من hsd3b1 الزرد، وهو ما يعبر عنه في الأنسجة البين والغدد التناسلية الكبار. hsd3b2 الزرد هو جين أعرب أمومي التي تختفي قبل توالد 7 النصوص. وقد تم تطوير هذا البروتوكول من 3β-HSD فحص النشاط الأنزيمي كامل جبل لالزرد عن طريق تعديل طريقة ليفي، وهوق التي وصفها ميلانو وآخرون. ، على أقسام المجمدة من ثمانية أنواع مكتملة العظام 8. بسبب نفاذية الأنسجة والشفافية البصرية من الزرد النامية، كلها جبل 3β-HSD الكيمياء النسيجية يمكن أن تستخدم بنجاح للجنين الزرد ثابت واليرقات وتحديدا ترسيم أنسجة البين متباينة.

وقد تم تطبيق هذا الاختبار حساس وسريع لمختلف المسوخ وmorphants مما يدل على أنواع مختلفة من dysmorphogenesis بين الكليتين. النشاط 3β-HSD البين غائب في الجنين حيث تعطلت مواصفات الأنسجة البين من خلال ضربة قاضية محددة من عامل النسخ Ff1b وانخفضت كما يتأثر التمايز البين من قبل ضربة قاضية للcoregulator Ff1b Prox1 9،10. والجدير بالذكر، أن يتم الكشف عن النشاط 3β-HSD في المسوخ مع عيوب مرحلة مبكرة شديدة، مثل أعور رأس الدبوس والحول، حيث 3β-Hالتنمية المستدامة الكيمياء النسيجية يحدد كيف يتأثر الهجرة الخلية البين 11. عدم المساس تمايز الأنسجة البين حتى في غياب كامل من الدم والأوعية الدموية. لذلك، كيف ترسم إشارات المستمدة من البطانة الجهاز البين وضع يمكن تحديد 12،13. وبشكل عام، وقد استخدم هذا الاختبار بنجاح النسيجية لدراسة مواصفات، والتمايز، وهجرة الخلايا الستيرويدي المنشأ في نموذج الزرد. لذلك، يجب أن تكون فعالة وأداة يمكن الاعتماد عليها لأي شاشات الوراثية أو الكيميائية التي تستهدف اضطرابات الجهاز الكظرية والبين.

Protocol

أخلاقيات الإعلان: وقد وافق جميع الإجراءات التجريبية على الزرد من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية Tunghai جامعة (IRB الموافقة NO 101-12.) والتي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة.

1. الحلول المالية ل3β-HSD الأنزيمية آخر تلطيخ

  1. إعداد العابر للديهيدرواندروستىرون [10 ملغ / مل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)].
  2. إعداد β-نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد هيدرات (1.2 ملغ / مل في 0.1 م العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.2).
  3. إعداد نيكوتيناميد (فيتامين B3، 50 ملغ / مل في H 2 O).
  4. إعداد نتروبلو الأزرق 4-نيترو (50 ملغ / مل في 70٪ ثنائي ميثيل الفورماميد).
  5. قسامة كل هذه المكونات في أنابيب microfuge ومخزن في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: في تجربتنا، وتجميد والذوبان المتكررة من aliquots من كل الحلول المذكورة أعلاه لا تؤثر على شدة 3β-HSD تلطيخ النشاط.

2. Wحفرة جبل 3β-HSD آخر تلطيخ

ملاحظة: النشاط الأنزيمي 3β-HSD قابلا للاكتشاف في الأجنة الزرد في أقرب وقت 28 ساعة بعد الإخصاب (HPF) عند المثقف في 28.5 درجة مئوية، وهو ما يتسق مع بداية التعبير مرنا من hsd3b1 2،7. ويستند البروتوكول النشاط تلطيخ كله جبل 3β-HSD في هذه الدراسة على الطريقة الموصوفة سابقا 8 و تم تحديد أن تكون ناجحة في الزرد تطوير ما يصل إلى 7 أيام بعد الإخصاب 9. لتحليل المكروية الأوعية الدموية في الأنسجة الستيرويدي المنشأ البين، كلها جبل 3β-HSD النشاط تلطيخ يجب أن يطبق على خطوط المعدلة وراثيا معربا-البطانة محددة مضان، مثل تيراغرام (kdrl: EGFP) s843 14 و تيراغرام (kdrl: mCherry) CI5 15 . لتحليل الأنسجة الستيرويدي المنشأ البين النظر تنمية الكلى الزرد، ويمكن 3β-HSD النشاط تلطيخ يكون تطبيق صحيفةed لتيراغرام (wt1b: GFP) li1 الأسماك 16، حيث تحدد تشكيل الكبيبة وسليفة الكلوة الأنابيب.

  1. علاج الزرد النامية تفرخ لهم في 0.03٪ الفنيل في الماء البيض (الملح 0.06 ملغ / لتر الشعاب المرجانية في المياه منزوع الأيونات)، بدءا من مرحلة ما بين 12 و 24 HPF، لمنع تشكيل الصباغ.
  2. إصلاح الأجنة dechorionated أو اليرقات في الفقرة (أ) 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تستكمل مع 0.1٪ توين 20 (PFAT) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) أو (ب) 2٪ PFAT بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية، تليها 4 ساعة على RT.
    تحذير: PFA سامة عن طريق الاستنشاق والجلد عن طريق الاتصال. ومن مدمر على الجلد والأغشية المخاطية والعينين والجهاز التنفسي العلوي.
  3. غسل الأجنة 4X لمدة 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.1٪ توين 20 (PBST) في RT.
    ملاحظة: فمن الأهمية بمكان أن لا تجفيف العينات أثناء تغيير الحلول الغسيل.
  4. طازجة إعداد ستاحل ining قبل ردود الفعل (الجدول 1). إعداد، الدوامة، وأجزاء أجهزة الطرد المركزي A و B في أنابيب منفصلة.
    ملاحظة: لإضافة جميع العناصر مباشرة في أنبوب واحد تسبب هطول الأمطار الشديد.
  5. إضافة الحل كله من الجزء ألف إلى حل كامل من الجزء باء، وتخلط جيدا لإعداد حل تلطيخ، وتوزيع الفور 1 مل في كل microfuge أنبوب يحتوي على أجنة الثابتة وغسلها.
  6. لف أنابيب microfuge مع رقائق الألومنيوم لحمايتها من ضوء ومكان سواء على محور دوار أو منصة هزاز لطيف اهتزاز في RT.
  7. تحديد تجريبيا وقت رد الفعل من خلال رصد الإشارات اللونية من خلال المجهر. رواسب طفيفة سوف تتطور مع مرور الوقت. ومع ذلك، فإنها لا تتداخل مع عملية التفاعل.
    ملاحظة: للحصول على الأجنة ثابتة عند 28 HPF، وتلطيخ عند 25 درجة مئوية لمدة 4 ساعات يولد إشارة واضحة على الأنسجة البين.
  8. وقف رد فعل عن طريق غسل 4X لمدة 10 دقيقة في PBST. أناو لا حاجة لمزيد المناعى (IHC) تحليل، بعد إصلاح الأجنة ملطخة 4٪ PFAT لمدة 60 دقيقة في RT. خلاف ذلك، وتخزين الأجنة غسلها عند 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  9. لكامل جبل المجهري، ومسح الملون، وظيفة ثابتة، وغسلها الأجنة مع 50٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني، توجيههم مع الجانب الظهري مواجهة على شريحة، ومراقبة باستخدام المجهر تستقيم تحت إضاءة حقل مشرق.
    ملاحظة: لتقديم صورة عالية الدقة من التشكل الأنسجة البين، شقة جبل تحليل من الجنين الملون والنشاط 3β-HSD وdeyolked يوصى. كما يتم وضع الأنسجة الستيرويدي المنشأ البين الحق فوق الكيس المحي، تحليل مسطح جبل البطنية من الأنسجة البين يسمح الملاحظة المباشرة واضحة من التشكل البين 17.

3. تحليل IHC من الأجنة الملطخة آخر 3β-HSD

ملاحظة: للحصول على تحليل المكروية الأوعية الدموية في steroiالأنسجة dogenic، تتعرض الأجنة الملطخة النشاط 3β-HSD مع مراسل فلوري المعدلة وراثيا-البطانة محددة لالمستعرضة vibratome باجتزاء والتحليل IHC لاحق 12،18.

  1. بعد تثبيت
    1. بعد إصلاح الأجنة الملون والنشاط 3β-HSD وغسلها مع 2٪ PFA تستكمل مع 1٪ تريتون X-100 لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية، وغسل 4X لمدة 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ تريتون X-100 (PBSTx) في RT.
  2. تضمين
    1. إعداد 4٪ منخفضة ذوبان الاغاروز عن طريق إذابة الاغاروز في برنامج تلفزيوني في 95 درجة مئوية، وقسامة في أنابيب microfuge، وتخزينها في 4-8 درجة مئوية.
    2. تذوب قسامة من 4٪ انخفاض ذوبان الاغاروز عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ومن ثم الحفاظ على قسامة في 47 درجة مئوية. تضمين كل جنين في المنصهر 4٪ منخفضة ذوبان-الاغاروز في سقف متجردا من أنبوب 1.5 مل microfuge التي هي بمثابة القالب، والسماح لتبرد حتى الصلبة.
  3. Vibratome باجتزاء
    1. عصا قطعة من الشريط ورقة لع الجافlatform من vibratome.
    2. إزالة كتلة الاغاروز صلابة من القالب بواسطة شفرة حلاقة. تطبيق superglue إلى الشريط ورقة على المنصة، وإصلاح كتلة الاغاروز على الشريط ورقة، مع الجانب الأمامي من العينة مواجهة. خفض كتلة agarose على شكل شبه منحرف المنشور، مع ما يقرب من 4 ملم و 8 ملم على كل جانب من جوانب العلوية والسفلية، على التوالي.
    3. شطف كتلة الاغاروز التي تحتوي على عينة مع برنامج تلفزيوني الباردة تستكمل مع 0.5٪ تريتون X-100 (0.5٪ PBSTx) باستخدام قطارة.
    4. شريحة كتلة agarose إلى 100 ميكرون أقسام وفقا لدليل تعليمات من vibratome. دائما شطف كتلة agarose لمنع جفاف. كما يتم قطع كل شريحة، إزالته من vibratome باستخدام 26 G إبرة حقنة، ونقل إلى لوحة بقعة الباردة التي تحتوي على 0.5٪ PBSTx (500 ميكرولتر / جيد).
    5. جمع المقاطع الأنسجة النشاط الإيجابي 3β HSD عن طريق فحص تحت المجهر تشريح، ونقل أقسام من قبل بيpette طرف مع نهايته قطع (حوالي 1 ملم القطر الداخلي في فتح) في لوحة 96-جيدا الباردة التي تحتوي على 0.5٪ PBSTx (150 ميكرولتر / جيد). عينات الأنسجة عادة ما تنفصل من كتلة agarose بعد هذه الخطوة.
  4. Permeabilization والغسل
    1. تغسل شرائح 6X لمدة 15 دقيقة في 0.5٪ PBSTx في RT، 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني، و4X لمدة 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1٪ المصل البقري ألبومين / 1٪ DMSO / 0.1٪ تريتون X-100 (PBDTx).
  5. حجب
    1. احتضان شرائح لمدة 1 ساعة في 2٪ مصل العجل الجنين (FCS) في PBDTx في RT.
  6. رد فعل الأجسام المضادة الأولية
    1. احتضان شرائح لمدة 1.5 أيام في PBDTx يحتوي على الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال، الأرنب بولكلونل الفيبرونكتين مكافحة الإنسان والفأر مكافحة الإنسان التنسيق كيناز الالتصاق) في 4 درجات مئوية.
  7. غسل
    1. تغسل شرائح 6X لمدة 10 دقيقة في PBDTx في RT.
  8. حجب
    1. احتضان شرائح لمدة 1 ساعة في 2٪ FCS في الجريدة الرسميةدي تي في RT.
  9. رد الفعل المضاد الثانوي
    1. احتضان شرائح لمدة 1.5 أيام في PBDTx يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية (-fluorophore مترافق الماعز المضادة للأرنب أو المضادة للماوس مفتش) في 4 درجات مئوية.
  10. غسل
    1. تغسل شرائح 6X لمدة 10 دقيقة في PBDTx في RT و4X لمدة 10 دقيقة في PBST في RT.
      ملاحظة: للحصول على التحليل المجهري متحد البؤر، مسح العينات مع 50٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني.

4. تحليل متحد البؤر

  1. مراقبة جبل الجنين كله وقسم من المجهر متحد البؤر مجهزة 10X / 0.5 و 20X / 0.75 عدسة الهدف.
  2. للكشف في وقت واحد مضان وتلطيخ 3β-HSD، تعيين وضع متعدد المسارات على النحو التالي: 488 نانومتر الأرجون ليزر و505-530 نانومتر ممر الموجة مرشح للكشف عن GFP. 543 نانومتر ليزر الهليوم نيون و560-615 نانومتر ممر الموجة مرشح للكشف عن mCherry. وتنتقل عن طريق قناة الخفيفة للكشف عن 3β-HSD تلطيخ.حجم الثقب هو 1 وحدة إيري، والقرار هو 1024 X 1024 بكسل.
  3. تجميع أكوام ض (مع 6 فاصل ميكرون) كنوع من الإسقاط 3D، ودمج الإسقاط ومشرق الميدان، وذلك باستخدام المدمج في البرنامج متحد البؤر.

النتائج

لتحديد كيفية codevelops الأنسجة بين الكليتين الستيرويدي المنشأ مع الكبيبة الكلى سليفة الكلوة والأوعية الدموية لها الوليد، تم إجراء 3β-HSD فحص النشاط الأنزيمي على ضعف المعدلة وراثيا تيراغرام (wt1b: GFP) li1، تيراغرام (kdrl: mCherry) CI5 الجنين في 34 HPF

Discussion

زادت قوة الإشارة من النشاط 3β-HSD على مدى رد فعل. تم الكشف عن إشارات واضحة عن النشاط 3β-HSD بعد 4 ساعات من رد فعل لمراحل من 28 HPF فصاعدا. ومع ذلك، ومدة رد الفعل يتطلب تحديد التجريبية، وهذا يتوقف على الغرض من الفحص. في الحالات التي يتطلب تلطيخ معالجة بين عشية وضحاها، على خلفية م...

Disclosures

The authors have no competing financial interests to declare.

Acknowledgements

نشكر البروفيسور كريستوف Englert والبروفيسور ديدييه Stainier لالإهداء تيراغرام (wt1b: GFP) li1 وتيراغرام (kdrl: EGFP) s843 سلالات، على التوالي، ومرفق تايوان الزرد الأساسية لتوفير تيراغرام (kdrl: mCherry) CI5. وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من وزارة تايوان للعلوم والتكنولوجيا (96-2628-B-029-002-MY3، 101-2313-B-029-001، 102-2628-B-029-002-MY3، 102- 2321-B-400-018).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Confocal microscopeCarl Zeiss LSM510 
DMSOSigmaD8418 
GlycerolUSBUS16374
Hyclone Fetal Calf Serum GE Healthcare Life SciencesSH30073
NicotinamideSigmaN0636
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrateSigmaN1636
4-Nitro blue tetrazoliumPromegaS380C
Nusieve GTGLonza50081
ParaformaldehydeSigmaP6148
PhenylthioureaSigma P7629
Phosphate buffered salineSigmaP4417-100Tab
PYREX Spot PlateCorning7220-85
Reef SaltAZOOAZ28001
trans-DehydroandrosteroneSigmaD4000
Triton X-100SigmaT8787
Tween 20SigmaP9416
VibratomeLeicaVT1000M

References

  1. Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130, 2107-2116 (2003).
  2. To, T. T., et al. Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development. Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).
  3. Liu, Y. W. Interrenal organogenesis in the zebrafish model. Organogenesis. 3, 44-48 (2007).
  4. Cravioto, M. D., et al. A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes. J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).
  5. Lachance, Y., et al. Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells. J Biol Chem. 267, 3551 (1992).
  6. Simard, J., et al. Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family. Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).
  7. Lin, J. C., et al. Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution. Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).
  8. Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry. Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).
  9. Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev Biol. 260, 226-244 (2003).
  10. Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium. Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).
  11. Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).
  12. Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo. PLoS One. 9, e107997 (2014).
  13. Liu, Y. W., Guo, L. Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development. Dev Biol. 297, 44-58 (2006).
  14. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  15. Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis. Dev Biol. 348, 34-46 (2010).
  16. Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309, 87-96 (2007).
  17. Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish. Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).
  18. Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel. PLoS One. 7, e43040 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

118 3 vibratome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved